山西与内蒙产蒙古黄芪的ISSR体系优化及遗传多样性分析

本研究对影响蒙古黄芪ISSR反应体系的因素进行了优化,同时对蒙古黄芪的遗传多样性进行了分析。确立蒙古黄芪ISSR初始反应体系,采用单因素实验优化ISSR反应体系,确立了最终的ISSR体系。采用非加权平均距离法(UPGMA)对8批蒙古黄芪样品进行遗传多样性和聚类分析。此次实验获得的黄芪ISSR-PCR反应体系为:总体积20μL,包含10×PCR Buffer 2μL、dNTPs 0.5 mmol/L、Taq酶1.0 U、MgCl_(2 )3.5 mmol/L、引物0.25μmol/L、DNA 50 ng。14条引物共扩增出多态性位点118个,遗传一致度在0.492 1～0.730 2之间,遗传距离在0.314 5～0.709 1之间。由聚类分析可知8批蒙古黄芪以产地分为了3类,内蒙古兴和县,山西浑源官儿乡各聚为一类,其余山西不同产地聚为一类。本实验表明建立的蒙古黄芪ISSR体系稳定,而山西与内蒙2个产地的蒙古黄芪遗传多样性丰富,该结果为黄芪良种选育及种质保护奠定基础。     

胡麻专化型尖孢镰刀菌ISSR-PCR最佳反应体系的建立

采用正交试验设计原理,对尖孢镰刀菌ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素进行优化筛选,确立了适合尖孢镰刀菌ISSR分析的反应体系,即25μL PCR反应体积中合有20 ng模板DNA、1 U Taq酶、0.4 μmol/L引物、0.2 mmol/LdNTPs、4.0 mmol/L Mg2+和2.5 μL 10 × buffer.PCR反应最佳退火温度根据引物而定,在此基础上筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.此研究为今后利用ISSR技术分析尖孢镰刀菌遗传多样性和群体结构奠定了基础.     

叉孢苏铁ISSR反应条件的优化及初步应用

利用ISSR 技术对叉孢苏铁(Cycas segmentifida)遗传多样性进行研究,对影响PCR 反应的DNA 模板浓度、dNTP 浓度、Taq 酶含量、引物浓度、Mg2 浓度和退火温度等进行了条件优化。叉孢苏铁的ISSR 最佳反应扩增体系为20μl 反应体积2μl 10 ×PCR buffer,模板DNA20ng,1UTaq 酶,1.5～2.75mmol/L MgCl2,0.1mmol/L 4 ×dNTP,0.22μmol/L 引物,2%甲酰胺。适宜的退火温度为50～52℃。从103 条引物中筛选出12 条用于所有样品的扩增,共扩增出122 条带,其中多态性条带为86 条,占总条带数的70.49%。POPGENE分析结果表明,种级水平上,叉孢苏铁具有中等稍高的遗传多样性水平,且各居群间有着很高的遗传分化度。     

野生毛木耳ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为获得条带清晰,重复性好,多态性高的野生毛木耳ISSR扩增结果,通过单因子试验对ISSR-PCR反应条件进行了优化。确定了ISSR分析的最佳PCR条件:25μL反应体系中模板DNA25ng、dNTPs0.24mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+0.9mmol/L、引物2μmol/L、10×PCR buffer2.5μL、ddH2O12.6μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。在此基础上初步筛选出25条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行野生毛木耳种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个适合的程序。     

云锦杜鹃ISSR扩增条件的优化

以云锦杜鹃基因组DNA为研究对象,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,包括镁离子浓度、dNTP浓度、模板DNA含量、TaqDNA聚合酶量、BSA浓度、引物用量以及退火温度等进行筛选和优化,建立了稳定、可重复的最佳反应体系:10μLPCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/LTris.HClpH9.0,50mmol/LKCl,0.1%TritonX-100),1.5mmol/LMgCl2,0.15mmol/LdNTP,0.45UTaqDNA聚合酶,2mg/mLBSA,12pmol引物,16ng模板DNA。利用所建立的优化反应体系从100个ISSR引物中共筛选出12个稳定性好、重复性高的引物,对5个居群共100个云锦杜鹃个体的DNA进行扩增,检测到170个位点,其中多态位点150个,多态位点百分率88.24%,5个居群的多态位点百分率平均为48.23%。云锦杜鹃ISSR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究云锦杜鹃的遗传多样性奠定了良好的基础。     

紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

以紫云英为研究材料,用哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物和11种株系紫云英品种的DNA为模板进行PCR扩增,筛选出33条扩增条带较好的ISSR引物,对其中的ISSR引物进行梯度PCR,筛选出最佳的退火温度。再采用正交试验和单因素试验相结合的方法对紫云英ISSR-PCR反应体系的5种因素(模板、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化浓度。确立了适合紫云英的ISSR分析的反应体系。在25μl反应体系中,其反应浓度为:DNA模版50.00ng,Mg2+2.00mol/L,Taq聚合酶1.0 U,dNTP 0.25mmol/L,引物0.20μmol/L,2.5μl 10×buffer。本试验为以后利用ISSR技术进行紫云英遗传多样性分析和物种保护奠定了技术基础。     

云生毛茛ISSR-PCR体系优化与引物筛选

旨在建立稳定可靠的云生毛茛ISSR-PCR反应体系。采用正交试验设计方法,对影响云生毛茛ISSR-PCR扩增结果的Mg2+、d NTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA五个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化,建立适用于云生毛茛的最佳反应体系和扩增程序,并对反应体系和扩增程序进行验证;在此基础上筛选多态性好的ISSR引物,采用梯度法筛选各个引物的最适退火温度。结果表明,云生毛茛20μL ISSR-PCR的最佳反应体系为:模板DNA 30 ng,Mg2+1.95 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.04U/μL,d NTP 0.150 mmol/L,引物0.5μmol/L;最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性20 s,49.6-60.6℃复性1 min,72℃延伸100 s,38个循环;72℃下延伸6 min。在优化的反应体系和反应程序条件下,从100条ISSR引物中筛选获得16条ISSR扩增引物,并确定了引物各自的最适退火温度。经过不同居群云生毛茛的验证,证明优化后体系扩增条带清晰且重复性好,可用于后续云生毛茛遗传多样性的研究。     

家蚕胚胎细胞系的DNA指纹图谱分析

在建立可靠的家蚕细胞系基因组DNA制备和PCR扩增技术体系的基础上,筛选具有稳定多态性位点的RAPD和ISSR引物,建立家蚕细胞系基因组DNA的ISSR和RAPD分子标记技术体系,检测家蚕细胞系的DNA分子标记多态性,构建细胞系的DNA指纹图谱。筛选出了26个ISSR引物和43个RAPD引物,通过PCR扩增在家蚕胚胎细胞系和传代昆虫细胞系等9个样品中分别获得了797条和1205条多态性条带,多态性达到89．9%和76．6%,不同细胞系的DNA多态性有较大差异,三个家蚕胚胎细胞系具有各自特有的DNA标记。测定了9个样品间的Nei's相似系数和遗传距离,构建了系统发育树,结果表明本实验室建立的3个家蚕胚胎细胞系和家蚕“夏芳×秋白”聚为一簇,亲缘关系较近,而来自不同物种的五个传代昆虫细胞系聚为一簇,它们之间的遗传距离比3个家蚕胚胎细胞系之间的遗传距离更小。     

突托蜡梅ISSR引物反应条件的优化与筛选

为从突托蜡梅(Chimonanthus grammatus)叶片中提取高质量的总DNA,比较了CTAB法、改良的CTAB法、SDS法、高盐低pH值法、SDS-CTAB法、SDS-蛋白酶K法.结果表明:改良的CTAB是提取突托蜡梅基因组DNA的有效方法.以U811(GA)8C为引物,确立了适合突托蜡梅的ISSR反应体系:在20 μL反应体系(50 ng DNA、0.6 μmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2 、0.15 mmol/L dNTPs、2.0 U Taq DNA聚合酶)中,反应程序为:94℃预变性5 min、94℃变性1 min、57.2℃退火45 s、72℃延伸2 min,循环40次,最后于72℃延伸5 min.用来自不同居群的7个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出了扩增效果较好的10个引物,得到了74个位点,其中39个为多态位点,多态性位点比例为52.7%.     

红树植物木榄SCoT-PCR体系优化及遗传多样性分析

为优化建立木榄的SCo T-PCR体系,利用建立的SCo T方法进行分析木榄不同地理种源的遗传多样性,基于L25(56)正交设计,本研究在5个水平上优化试验了5个影响木榄SCo T-PCR的因素:模板DNA、Mg~(2+)、d NTPs、Taq酶和引物。同时,运用优化的SCo T体系对木榄8个不同地理种源进行遗传多样性分析。本研究结果建立了木榄SCo T-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 20 ng,引物0.75μmol/L,d NTPs 0.5 mmol/L,Mg~(2+)2.5 mmol/L,Taq酶1.25 U。同时,筛选出了带谱清晰、多态性丰富的16条SCo T引物进行遗传多样性分析。共扩增出115个位点,其中73个为多态性位点,多态性比例为62.33%。从UPGMA聚类和PCo A分析结果可以看出8个地理种源间的遗传多样性及亲缘关系。研究表明SCo T分子标记可以用于木榄种群的遗传多样性。