斑马鱼一个IFIT 家族基因的鉴定及启动子分析

IFIT 家族由一类受干扰素诱导表达并具有TPR 结构域的蛋白组成, 但是在鱼类关于IFIT 基因的研究还很少。研究利用哺乳类IFIT 家族基因IFI56 的序列搜索斑马鱼基因组数据库鉴定出一个未知基因, 该基因具有哺乳类IFIT 家族保守的基因组结构, 编码蛋白具有保守的TPR 结构域, 暂命名为IFIT-A。RT-PCR 分析表明, Poly I:C 能够诱导IFIT-A 基因转录水平上调。与哺乳类IFIT 家族基因相似, 斑马鱼IFIT-A 启动子存在ISG 基因特有的典型ISRE 结构域。荧光素酶活性实验揭示Poly I:C 和重组IFN 蛋白能激活斑马鱼IFIT-A 启动子活性。此外, 过量表达IFN 调控因子IRF3 和IRF7 能诱导斑马鱼IFIT-A 启动子活性。实验结果证明IFIT-A基因是斑马鱼IFIT 家族成员, IRF3 和IRF7 在其诱导表中具有重要调控作用。       

稳定表达外源性p16基因肺癌A549细胞株的建立及鉴定

为构建稳定表达外源性抑癌基因p16的肺癌A549细胞株,用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体（pcDNA3)。将抑癌基因p16转移入此基因缺失的人肺癌细胞株A549细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学鉴定p16基因的表达,同时对克隆细胞分泌蛋白进行活性检测。结果显示转染p16基因的A549细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达,说明建立的p16真核表达载体能在肺肿瘤细胞中分泌表达蛋白,表达P16抑癌蛋白的A549细胞株的建立有助于研究抑癌基因p16在肺癌发生中的作用。     

尘螨变应原Derf1真核表达载体的构建及转染CHO细胞

目的：构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达。方法：根据Genebank中Der f1基因的核酸序列（AB034946）,设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his A上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定。结果：将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株。结论：成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质。     

尘螨变应原Der f1 真核表达载体的构建及转染CHO 细胞

目的:构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-hisA上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定.结果:将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株.结论:成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质.     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

FKBP12真核表达载体的构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的:构建FK506结合蛋白12(FK506 binding proteins 12,FKBP12)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法:RT-PCR扩增人平滑肌细胞FKBP12基因片断,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12真核表达载体,经琼脂糖电泳、特异性内切酶切割及测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,HygromycinB筛选建立稳定转染的细胞株,免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果:构建了FKBP12真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达FKBP12蛋白。结论:FKBP12真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为深入研究基于FKBP12靶点药物的机制奠定基础,进而为探索安全、高效的免疫抑制剂提供新的途径。     

稳定表达人Eps8基因的胶质瘤U251细胞系的建立

应用亚克隆方法构建pEGFP-C3／Eps8真核表达载体,经测序鉴定后,用脂质体进行胶质瘤U251细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达pEGFP-C3／Eps8和pEGFP—C3的细胞系,最后通过Western blot和荧光定位证明印娼在U251细胞中过量表达。本实验成功建立了稳定转染Eps8的U251细胞系,为进一步研究Eps8基因在胶质瘤中的功能奠定了良好的实验基础。     

斑马鱼IRF11基因的鉴定、亚细胞定位及表达特征

早期的研究表明IRF11是鱼类特有的IRF家族成员。查询最近解析的斑马鱼第九版基因组时,发现斑马鱼IRF1和IRF11命名出现了混乱。通过对脊椎动物IRF1和IRF11基因位点进行同线型分析表明,IRF11与IRF1是两个不同的基因,不宜命名为IRF1b和IRF1a。系统进化树分析发现,在脊椎动物中IRF11基因比IRF1起源更早;两栖类以后的脊椎动物基因组只有IRF1,没有IRF11,其中原因可能是因为基因丢失。斑马鱼IRF11与脊椎动物IRF1一样,其表达蛋白定位在细胞核中。缺失分析揭示斑马鱼IRF11的DBD有一个能引导蛋白定位进入细胞核的序列。表达分析发现poly（I:C）能诱导斑马鱼IRF11的表达,但其表达水平低于IRF1。     

人干扰素IFNα-2b在果蝇细胞中的稳定表达

以人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒为模板,PCR扩增,PCR产物克隆到表达载体获得重组质粒,经转染和筛选,得到稳定表达的果蝇S2细胞株.经CuSO4诱导表达并对表达产物进行检测,结果显示,在果蝇S2细胞中成功地进行了人干扰素IFNα-2b的蛋白表达,表达产物的大小约为26kD.并且,通过体外的抗病毒活性测定,证明所表达蛋白具有抗病毒活性.该研究为进一步利用该系统表达真核细胞蛋白,研究其结构和功能提供了重要的基础.     

病毒负性调节因子在内皮细胞稳定表达细胞株的建立

建立HIV-1的调节基因Nef基因在内皮细胞稳定表达的细胞株ECV304-Nef,为研究Nef对血管内皮细胞生物学活性的影响奠定试验基础。构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Nef,将其质粒和pcDNA3.1(+)质粒(阴性对照)分别转染血管内皮细胞ECV304,G418筛选。通过RT-PCR检测NefmRNA在细胞中的表达;细胞免疫荧光法检测Nef蛋白的表达及定位;Western blotting检测Nef蛋白的特异性表达,获得稳定表达的细胞株。构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-Nef经BamHI和EcoRI双酶切鉴定,得到的片段大小与理论值相符,分别为载体的5400bp和目的基因的621bp。测序结果显示碱基序列与GenBank(登录号:K03455)序列相同。转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的ECV304细胞株,RT-PCR显示转染pcD-NA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞出现621bp条带,对照组无目的条带出现;荧光显微镜下观察转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。Western blotting结果显示,转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞约27kD处检测到目的条带,表明pcDNA3.1(+)-Nef表达正确。     

鱼类培养细胞干扰素的诱导

对紫外线灭活的草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）－Ｆ９株,在几种鲤科鱼类培养细胞中诱导产生干扰素的能力及影响干扰素产量的各因素进行了研究。纯化的ＧＣＨＶ在紫外线照射５分丧失感染性,但获得了在ＣＡＢ等５种鲤科鱼类培养细胞中高铲诱导产生干扰素的能力。干扰素的诱导需要病毒高复数感染细胞。干扰素主要在诱导后１４小时时内产生。培养上清中的新生牛血清对干扰素的产量有抑制作用。而在ＰＨ６．２－７．８范围内对干扰素产量无     

PRODUCTION AND ROLE OF INTERFERON IN PHYSIOLOGICAL CONDITIONS

1. There is convincing evidence that a number of agents such as bacteria, viruses, endotoxins, foreign proteins, smokes and chemicals come into contact under physiological conditions with the lymphoid tissue associated with the gut and/or bronchial systems. Endogenous lectins and proteases may also act as mitogens on the central and peripheral immune system. 2. It is suggested that these agents act as inducers of interferon (and some also as immunogens), so that local production of interferon is turned on successively from cell to cell depending upon their responsiveness and upon the periodic inflow of inducers. 3. On the basis of a number of different features, it is proposed to distinguish between an ‘acute’ and a ‘physiological’ interferon response. In the latter, the interferon-producing cell influences the neighbouring cells by short-range humoral transmission (paracrine control) and possibly by cellular interaction, while the route of the general circulation is preferentially used in the former response. 4. It is suggested that the physiological interferon response, although previously overlooked, has great biological importance because production of interferon at strategic sites can maintain active defence systems essential for survival. 5. It is to be expected that the physiological interferon response, although amenable to experimental verification, may be difficult to detect. On the basis that interferon is normally absent from serum, it is suggested that most of the released immune-type interferon is either bound by cells surrounding the site of its synthesis or catabolized locally. 6. It is postulated that the progressive decline of the physiological interferon response with increasing age may represent one of the factors favouring the insurgence of autoimmune diseases and tumours in the process of ageing. It is also suggested that the involution of the thymus may in part be due to intrathymic production of interferon induced by proteases released from macrophages.     

一种新剂型基因工程干扰素稳定性的研究

目前国内市场上的干扰素多数为含有人血白蛋白的冻干制剂 ,为消除人血白蛋白带来的血源性感染 ,并方便临床用药 ,我们根据基因工程药物的特点 ,将冻干基因工程干扰素改造成干扰素注射液 ,选择合适的缓冲系统和非人血白蛋白稳定剂 ,在 4℃和 3 7℃下的稳定性进行了研究 ,确定了一种稳定的新型干扰素注射液。     

大剂量国产胸腺肽联合干扰素治疗慢性乙肝疗效及其机理初探

本文研究大剂量胸腺肽联合干扰素对慢性乙肝患者的治疗作用,发现胸腺肽联合干扰素治疗三个月后,患者的ＡＬＴ复常率、ＨＢｅＡｇ转阴率、ＨＢＶＤＮＡ阴转率和ＨＢＶＤＮＡ有效下降率分别为７６０％、４４０％、５６０％和９６０％。Ｔ淋巴细胞亚群分析结果表明,联合治疗后,患者外周血ＣＤ４＋淋巴细胞亚群上调,ＣＤ８＋亚群下调,二者比值趋于正常,说明国产胸腺肽联合干扰素治疗慢性乙肝的治疗机理与免疫调节作用有关。