拟南芥cDNA芯片和油菜-拟南芥比较作图相结合筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因

以拟南芥cDNA芯片筛选核盘菌侵染时甘蓝型油菜的局部抗(耐)病相关基因, 共获得在病斑周围局部组织中受核盘菌胁迫后表达变化达2倍以上的基因61个. 这些基因中, 36个基因为上升表达, 25个基因为下降表达. RT-PCR和Northern杂交验证了部分芯片杂交筛选的结果, 表明拟南芥cDNA芯片可用于甘蓝型油菜基因转录谱的研究. 结合油菜-拟南芥基因组比较作图, 将一些cDNA芯片筛选得到的油菜菌核病抗性相关基因定位于甘蓝型油菜抗菌核病QTL区间内. 取定位于QTL峰值区域的少数基因为先验基因, 值得优先对这些基因进行深入研究.     

早熟油菜成花相关基因LFY的克隆与分析

以甘蓝型油菜晚熟品种RG-8的早熟突变体RG-8M为材料,通过同源克隆法得到1个LEAFY(LFY)同源基因,命名为BnLFY。该基因cDNA全长为1 310bp,包含1个长为1 248bp的开放阅读框,编码415个氨基酸。序列分析表明,推测的氨基酸序列含双子叶植物LFY类蛋白特有的N端脯氨酸富集区、中央酸性区、亮氨酸拉链结构以及富含赖氨酸与精氨酸的碱性区;且与几种十字花科植物LFY类蛋白的氨基酸序列一致性均在84%以上。转录表达分析表明,BnLFY基因在油菜中为组成型表达。     

甘蓝型油菜γ-TMT基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了甘蓝型油菜γ-TMT基因,并将其克隆到pMD18-T vector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为1 044 bp.将甘蓝型油菜γ-TMT基因定向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物超表达载体.     

甘蓝型油菜RPD3/HDA1基因家族鉴定及早熟相关基因挖掘

该研究运用生物信息学方法鉴定甘蓝型油菜RPD3/HDA1基因家族,检测了其在‘黔油早2号’和‘中双11’中的表达水平及2个品种在低温(4℃)和ABA胁迫下该家族基因的表达特征,以探讨RPD3/HDA1基因在甘蓝型油菜中的潜在功能,为早熟油菜抗逆性遗传改良提供理论基础和候选基因。结果表明:(1)在甘蓝型油菜全基因组中共鉴定到28个RPD3/HDA1基因,将其命名为BnHDA1~BnHDA28,聚类为4个亚家族,同一亚家族成员的基因结构较为相似;在该基因家族中共检测到16对复制基因,均为片段重复。(2)顺式作用元件预测统计中共发现675个元件与植物激素、环境胁迫和光响应有关。(3)qRT-PCR分析显示,RPD3/HDA1基因在‘黔油早2号’中的表达量均高于‘中双11’;低温胁迫下,‘黔油早2号’和‘中双11’中RPD3/HDA1基因呈差异表达,与‘中双11’相比,RPD3/HDA1基因在‘黔油早2号’中的下调幅度较大;ABA处理后,RPD3/HDA1基因在2个品种中表达模式不一致,‘黔油早2号’中大部分RPD3/HDA1基因表达量较‘中双11’下调幅度小。研究认为,RPD3/HDA1基因可能在油菜开花中发挥调节作用,而且可能通过激素信号通路和防御信号通路参与油菜的生长发育和防御反应的调节。     

应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因

以甘蓝型油菜(Brassica napus)野生型(宁油10号)及其柱头授粉功能缺失突变体FS-M1为材料,使用油菜基因表达谱芯片筛选甘蓝型油菜柱头特异表达基因。在含有16 540个基因的油菜基因表达谱芯片中(43 803探针),获得了4 410条差异表达探针,选择部分差异表达基因进行实时定量PCR,所得结果与芯片检测结果相吻合。其中,野生型较FS-M1显著上调且获得209个功能注释的探针,对应198个基因,这些特异表达的基因主要富集在水解酶、转移酶、氧化还原酶和转录因子中;涉及较大的基因家族包括:细胞色素P450基因、GDSL脂肪酶/水解酶基因、ABC转运蛋白基因、myb转录因子基因、bHLH转录因子基因、过氧化物酶家族和受体激酶基因等。推测这些基因与甘蓝型油菜柱头发育及授粉功能有关。     

甘蓝型油菜小核糖核蛋白BnSmD1编码区全长cDNA 的克隆与表达分析

通过筛选野生型油菜(Pet33-10)与无花瓣油菜(Apet33-10)反向消减文库(SSH)和运用RACE-PCR技术, 获得了甘蓝型油菜小核糖核蛋白BnSmD1的全长编码区 cDNA (GenBank登陆号DQ298446)。该基因长484 bp, 含有一个长354 bp的阅读框。BnSmD1在N端拥有两个高度保守的结构域(Sm-1和Sm-2), 羧基端则含有一个RG重复序列。Northern blot表达结果显示: BnSmD1在甘蓝型油菜的各个组织均有表达, 但是它在早期花蕾中的表达明显高于同期的叶和茎。通过对BnSmD1在Apet33-10无花瓣品系与野生型有花瓣品系Pet33-10中各组织的表达差异进行比较, 发现该基因在Apet33-10的早期花蕾中表达明显下降。因此, BnSmD1可能对植物的早期花发育起到了重要的作用, 并很有可能影响花瓣的形成。     

甘蓝型油菜BnMYC2基因克隆及对植物抗虫胁迫的研究

为了研究髓细胞组织增生蛋白(Myelocytomatosis protein,MYC2)基因与甘蓝型油菜抗虫性的关系,该研究从甘蓝型油菜恢复系R18中克隆获得BnMYC2基因的cDNA序列,并进行了基因表达及转化模式植物拟南芥的抗虫分析。生物信息学分析表明,BnMYC2基因gDNA不具有内含子结构,cDNA完整开放阅读框(ORF)为1 833 bp,编码610个氨基酸,推测BnMYC2基因位于甘蓝型油菜C6染色体上,具有bHLH型转录因子的保守结构域HLH。基因同源性分析结果表明,BnMYC2与拟南芥、甘蓝、萝卜的亲缘关系最近,氨基酸的相似度都在98%以上。组织特异性表达分析显示,BnMYC2在甘蓝型油菜的根、茎、叶、花、授粉后27 d的果荚和授粉后35 d的果荚中均有表达,且授粉后27 d的果荚中的表达水平最高。抗虫胁迫实验的结果显示,过表达BnMYC2拟南芥的抗虫基因VSP2的表达水平显著高于对照,推测甘蓝型油菜BnMYC2基因可能作为重要的调节因子参与虫害胁迫响应;MeJA诱导6 h后,VSP2基因在不同基因型拟南芥的表达量都明显增加,与诱导前相比差异显著,表明BnMYC2正向调...     

甘蓝型油菜PGK基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜磷酸甘油酸激酶(PGK)基因表达特性,在对拟南芥PGK基因家族生物信息学分析的基础上,通过电子克隆方法获得3个甘蓝型油菜PGK基因(BnPGK1、BnPGK2、BnPGK3)。分别设计特异引物,以甘蓝型油菜雄性不育系09A和保持系09B的cDNA为模板克隆BnPGK基因全长序列。根据获得的cDNA序列设计实时荧光定量特异引物,采用实时荧光定量PCR技术,研究油菜雄性不育系与保持系PGK基因表达差异。结果显示:BnPGK基因在甘蓝型油菜雄性不育系09A和保持系09B的根、茎、叶、花蕾中均有表达,属组成性表达。除茎中的BnPGK3外,BnPGK其它基因在根、茎、叶中的表达均表现为09A高于09B,而在花蕾中均为09B高于09A,BnPGK1和BnPGK3在09B中的表达量是09A中的2倍以上。     

甘蓝型油菜热激转录因子的克隆及表达分析

以甘蓝型纯系油菜为试材,用RT-PCR和RACE方法首次从油菜种子中获得油菜热激转录因子的cDNA全长序列,命名为BnHSFA4a,GenBank登录号为HQ435241。结果表明:该cDNA长1 667bp,编码1个具有389aa的蛋白质,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥热激转录因子AtHSFA4a编码的氨基酸序列间相似度为82%。对34条编码不同热激转录因子的氨基酸序列进行多重比对,结果在100～190aa处序列间氨基酸总相似性超过60%,显示出较高的保守性。构建原核表达载体并成功表达出预期蛋白。半定量RT-PCR结果显示,该基因的表达先于油菜肌醇半乳糖苷合成酶(BnGOLS1)基因,符合该基因调控BnGOLS1的假设。推测AtHSFA4a基因可能通过调控BnGOLS1的表达量进而在油菜种子脱水耐性获得过程中发挥一定的作用。     

甘蓝型油菜A基因组候选BAC克隆的筛选及其插入片段大小分析

选择甘蓝型油菜A基因组10个连锁群上特有的85个SSR分子标记,合成其引物序列,采用四维PCR法筛选甘蓝型油菜-新疆野生油菜二体异附加系BAC文库,成功筛选到甘蓝型油菜A基因组39个BAC克隆,其插入片段介于50～300 kb之间,平均为120 kb。甘蓝型油菜A基因组10个连锁群BAC克隆的获得,对后续开展甘蓝型油菜A基因组染色体识别、基因染色体定位、遗传距离与物理距离间关系分析等均具有重要价值。     

用单性结实基因2A11-iaaM转化罗汉果的研究

为了实现罗汉果生产中免除人工授粉和果实无籽化,该研究利用pBI121-Gus构建果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM的嵌合基因(2A11-iaaM)过量表达载体,以罗汉果雌株叶盘为材料,采用农杆菌介导法建立罗汉果高效遗传转化体系,转化和创制单性结实罗汉果种质,通过基因特异引物对的PCR扩增,初步检测出转基因阳性植株,将之移栽大田,观察转基因植株的单性结实性的表现。结果表明:构建罗汉果单性结实性相关的pBAI-Gus植物双元表达载体获得成功;建立了农杆菌介导的罗汉果叶盘遗传转化优化体系,即农杆菌菌液OD_(600)值为0.3～0.5,侵染10 min,最优选择培养基为MS+TDZ 0.7 mg·L~(-1)+IBA 0.5 mg·L~(-1)+Kan 5 mg·L~(-1)+Cef 300 mg·L~(-1);经PCR鉴定共获得4株转基因阳性雌株;将阳性植株扩繁后移栽田间,经田间调查发现,24株阳性扩繁植株中有5株正常开花,占总植株数的20.8%,且其子房未经人工授粉发育成幼果,表现单性结实性。在载体构建和农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系优化的基础上,将外源单性结实相关嵌合基因整合进罗汉果基因组并得到表达,为后续研究单性结实罗汉果的遗传生理,创制转基因罗汉果单性结实新种质,以及克服其产业化中需要人工授粉和无籽化提供了理论和应用基础。     

表皮葡萄球菌SarA对atlE、lipA和zinC基因表达调控的研究

表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermids) 是一种条件致病菌，SarA(Staphylococcal accessory regulator A)是该菌中一个全局性调控因子，它控制着细胞中许多与毒性相关的基因表达. 报道了SarA在转录水平直接调控atlE、lipA和zinC基因的表达. RT-PCR和lacZ报告基因的分析结果显示，在表皮葡萄球菌ATCC35984中，SarA对atlE (自溶酶基因) 表达起负调控作用，而对lipA (脂肪酶基因) 和zinC (膜相关锌金属蛋白酶基因) 的表达则有正调控作用. 生物信息学分析表明，SarA控制atlE，lipA和zinC 3种基因表达可能是通过与被调控基因上游的特定DNA序列的结合来实现的，该DNA结合区保守并富含AT碱基. 根据已报道的金黄色葡萄球菌中SarA的结合位点序列，利用Omiga软件分析并推测了SarA结合atlE，lipA和zinC的可能区域. 基于SarA是一种多功能的毒素相关调控因子，结果提示，SarA能调控众多因子，可以作为防治表皮葡萄球菌感染的一个药物筛选靶点.     

藏药多刺绿绒蒿种子萌发特性研究

多刺绿绒蒿(Meconopsis horridula)为罂粟科绿绒蒿属一年生草本植物,是一种极具观赏价值和药用价值的高山植物,目前处于濒危状态,因此研究多刺绿绒蒿种子的萌发特性对其种子育苗及人工栽培具有重要意义。为了提高多刺绿绒蒿的种子发芽率,该研究以多刺绿绒蒿的种子为材料,分析了不同消毒剂、浸种时间、温度和外源植物激素对种子萌发特性的影响。结果表明:(1)最适消毒方法为75%乙醇1 min+3%H2O25 min,最适浸种时间为24 h,最适温度和光照条件为20℃/10℃(光照12 h/黑暗12 h),用无菌水浸种后的种子发芽率为49.67%。(2) GA_3100～600 mg·L~(-1)和NAA 5～30 mg·L~(-1)可以提高种子的发芽率、发芽势和发芽指数,缩短发芽启动时间和发芽持续时间,对种子的萌发有促进作用。(3) 6-BA 5 mg·L~(-1)和10 mg·L~(-1)对种子的萌发有一定的促进作用,但不显著,6-BA浓度≥15 mg·L~(-1)则抑制种子的萌发。(4)用GA3500 mg·L~(-1)浸种后的种子发芽指标最好,发芽率、发芽势和发芽指数分别为69.67%、33.00%、4.51,种子的发芽起始时间和发芽持续时间分别为10.67 d、11.67 d。     

罗布麻CesA基因家族的生物信息学分析

植物体中纤维素是细胞壁形成的主要成分,不仅参与细胞形态的建成,调控细胞发育,还参与细胞内多种细胞信号转导途径,进而影响植物体的生长发育。纤维素合酶是植物体合成纤维素的主要酶类。为了探究CesA基因家族对罗布麻生长发育及纤维素合成的调控机理,该文通过生物信息学分析方法,从基因家族鉴定、结构分析、蛋白理化性质与多级结构预测、亚细胞定位、信号肽、进化关系和顺式作用元件等方面,对罗布麻CesA基因家族进行系统鉴定和分子特征分析。结果表明:基于全基因组测序,罗布麻CesA基因家族鉴定含有15个成员,分布在罗布麻11条染色体中的8条上,其编码蛋白的氨基酸数量为730～1 158,相对分子质量81 280.81～130 123.18 kDa,理论等电点6.18～8.83。除了AvCesA3、AvCesA5、AvCesA7、AvCesA10和AvCesA11蛋白为稳定蛋白,其余成员均为不稳定蛋白;除了AvCesA12蛋白为疏水性蛋白,其余成员均为亲水性蛋白。该家族成员包含3～14个外显子,8～15个保守基序。编码蛋白主要分布于质膜与高尔基体上,无信号肽,二级结构以无规则卷曲与α-螺旋为主要构成元件。AvCesA15蛋白的跨膜结构域和三级结构与其他成员存在显著不同。罗布麻CesA基因进化时主要受纯化选择作用。对上游1 500bp区域顺式作用元件分析,结果显示罗布麻CesA基因受到光、温度、水分、氧气等环境因子及生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯、水杨酸等植物激素调控。该研究为进一步探究罗布麻CesA基因家族的生物学功能、提高纤维品质与品种改良奠定理论基础。     

瑞香属和荛花属的数量分类研究

瑞香属和荛花属为瑞香科瑞香亚科的落叶或常绿灌木,中国西南部是瑞香属和荛花属的重要分化中心。全世界共有瑞香属95种、荛花属70种,中国分布有瑞香属52种、荛花属49种。瑞香属和荛花属的分类学研究一直存在不同程度的分歧。花盘形状和果实类型在传统分类中一直是区分瑞香属和荛花属的典型特征,而花盘形态和果实类型在2个属中存在交叉和过渡,部分植物分类学家根据这些特征将两个属进行过不同程度的归并。该研究采用数量分类法对瑞香属77种(变种)和荛花属62种(变种)植物,选取32个形态学性状进行聚类分析和主成分分析。结果表明:聚类分析和主成分分析均显示两属均未形成单系类群。在主成分分析中,前3个主成分分析的贡献值为35.56%,传统分类中用来区分两属的花盘形状、叶序及果实类型等特征对前3个主成分贡献相对较小,因此,传统分类学中对这两个属进行区分的性状并没有典型的分类学意义。同时,聚类图和主成分分析得到的散点图均不能将这两个属区分开来。数量分类研究结果显示两属植物存在明显的交叉,支持瑞香属和荛花属不是两个独立自然类群的观点。     

除虫菊TcALDH和TcGLIP基因启动子克隆及功能分析

天然除虫菊酯是从除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)中提取的绿色植物源生物杀虫剂。醛脱氢酶(TcALDH)和GDSL脂肪酶(TcGLIP)是除虫菊酯生物合成途径中的关键限速酶。为探究TcALDH和TcGLIP基因的功能,该研究从除虫菊无性系‘W99''中克隆得到TcALDH和TcGLIP基因的启动子,并通过生物信息学分析、组织化学染色(GUS染色)、荧光素酶报告实验和外源植物激素处理实验对其启动子的调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行分析。结果表明:(1)克隆得到的TcALDH和TcGLIP启动子序列分别为2 848、1 343 bp,均含有多个与逆境应答和激素信号相关的顺式作用元件。(2)分别构建了启动子和荧光素酶融合的植物表达载体,在烟草叶片中观察荧光成像发现,TcALDH启动子具有茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)激素诱导特异性。(3)用MeJA和ABA处理除虫菊‘W99''组培苗发现,TcALDH的表达量在12 h内受ABA诱导时上调,受MeJA诱导时先升高后降低,TcGLIP的表达量受ABA和MeJA诱导下调。(4)分别构建了TcALDH和TcGLIP启动子与GUS基因融合的植物表达载体,转化烟草并对其转基因叶片进行GUS活性染色发现,TcALDH启动子在烟草叶片腺体、腺毛头部及叶肉细胞中表达,而TcGLIP启动子仅在烟草叶肉细胞中表达。综上认为,TcALDH和TcGLIP的启动子具有组织特异性,TcALDH启动子具有MeJA和ABA激素诱导特性。该研究结果为除虫菊TcALDH和TcGLIP基因参与除虫菊酯合成的调控机制提供了新见解。     

纤枝短月藓BeLEA2基因的克隆及表达分析

为探究纤枝短月藓LEA2基因的结构和表达特征,该研究以纤枝短月藓为材料,首次利用PCR克隆技术得到纤枝短月藓BeLEA2基因序列,并对该基因进行分析。结果表明:(1)该基因序列中含有2个外显子和1个内含子,其开放阅读框(ORF)为456 bp,编码151个氨基酸,预测其相对分子质量为16515.96 Da。(2)将纤枝短月藓与其他植物LEA2基因氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示纤枝短月藓与小立碗藓的亲缘关系最近。(3)利用HiTail-PCR技术克隆获得1072 bp的BeLEA2启动子序列,用PlantCARE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行预测,结果表明该启动子除了含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他顺式元件。(4)实时荧光定量PCR分析表明,BeLEA2基因在纤枝短月藓不同发育时期和不同组织中都有表达,且对脱水胁迫有响应。以上结果为进一步探究LEA2基因在苔藓植物中的功能及作用机制奠定了基础。     

麻疯树种子发育过程中JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达模式研究

油质蛋白基因对种子中油体的形成至关重要,该研究通过实时荧光定量PCR,对麻疯树的两个油质蛋白基因JcOle14.3和JcOle16.6在种子不同发育时期的表达模式进行了分析。结果表明:两个基因在种子发育初期(10~30 d)表达量逐渐升高,但表达水平均较低;40 d时表达量急剧增加并达到最高,而种子发育后期(50~55 d)两个基因表达水平均逐渐降低。由此可初步推测,JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达量可能与种子油脂积累量存在正相关。该研究结果为麻疯树油体形成机理和油质蛋白的深入研究提供了理论基础。     

柠条锦鸡儿F3H基因克隆及功能分析

柠条锦鸡儿为豆科灌木,对各种环境胁迫具有较强的适应能力,类黄酮是天然的抗氧化剂,花青素属类黄酮化合物,逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成,而黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因,命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框(ORF)为1095 bp,编码364个氨基酸,推测的蛋白质分子量为41.3 kDa,理论等电点为5.9。生物信息学分析发现,CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性,推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列,PlantCARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导,并且在低温胁迫下,CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述,研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。     

马尾松细胞分裂素羟化酶基因PmCYP735A克隆与表达分析

该文首次在针叶树种马尾松(Pinus massoniana)中采用cDNA末端快速克隆(RACE)技术克隆,并鉴定出1个CYP735A基因。结果表明:马尾松CYP735A基因(PmCYP735A) cDNA全长为1 744 bp,包括1 647 bp的开放阅读框,44 bp的5'端非翻译区和53 bp的3'端非翻译区。该基因编码蛋白由548个氨基酸残基组成,其二级结构含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲。该基因编码蛋白不含跨膜区域,且无信号肽酶切位点,在399～406个和475～484个氨基酸残基存在P450超家族保守特征序列ETLRLYP(ExxRxxP)和血红素结合区域(Heme-binding region) FSFGPRKCVG (FxxGxRxCxG)。系统进化树分析表明,马尾松PmCYP735A与水稻、玉米、拟南芥CYP735A蛋白归属于同一小的进化枝,可可、毛果杨、麻风树和橡胶树等的CYP735A同源蛋白相对集中的定位于另一进化分支。实时定量PCR检测发现,PmCYP735A基因在马尾松根和茎中的表达量显著高于叶,该基因响应外源生长素NAA诱导表达,随着诱导时间呈现先上升再下降的表达趋势。以上结果有助于深入探究CYP735A基因家族的生物学功能及其在物种间的表达调控异同,为进一步挖掘马尾松优异基因资源奠定基础。