recA基因的克隆及其在λ溶原菌中的生物学功能

通过一对自行设计的引物,以E. coli染色体DNA为模板进行PCR扩增,获得完整的recA基因.将PCR产物和pUC18在体外进行连接后,并分别转入E. coli DH5α和E.coli k12(λ+),筛选出含重组质粒(pUR4)的转化子.在诱导条件和非诱导条件下,分别测定recA基因在不同转化子中的生物学功能.结果表明recA基因在溶原菌中表现出明显的生理功能,能使λ原噬菌体从溶原状态进入裂解循环.这种重组质粒将在进一步研究λ原噬菌体的诱导机理以及受紫外辐射损伤细胞的修复作用等方面成为有效的工具.     

耐辐射奇球菌recA基因的克隆、表达及其对recA缺损大肠杆菌辐射抗性的影响

将耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)recA基因克隆到表达质粒pET15b中,并在Escherichia coli HMS中高效表达了可溶性的RecA重组蛋白。同时将recA基因通过穿梭质粒pRADZ3导入recA缺损E.coli TG2细胞中,Western印迹实验显示RecA蛋白能够在不需要诱导剂IPTG的条件下稳定表达。辐射抗性实验表明,D.radiodurans的recA基因在E.coli细胞中的表达能够完全补偿recA缺损E.coli辐射抗性能力。     

耐辐射奇球菌recA基因的克隆、表达及其对recA缺损大肠杆菌辐射抗性的影响

将耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）的recA基因克隆到表达质粒pET15b中,并在Escherichia coli HMS(DE3)中高效表达了可溶性的RecA重组蛋白。同时将recA基因通过穿梭质粒pRADZ3导入recA缺损E. coli TG2细胞中,Western印迹实验显示RecA蛋白能够在不需要诱导剂IPTG的条件下稳定表达。辐射抗性实验表明,D. radiodurans的recA基因在E. coli细胞中的表达能够完全补偿recA缺损E. coli辐射抗性能力。     

禽流感病毒核蛋白在噬菌体表面的展示

利用PCR技术,扩增禽流感病毒（AIV）核蛋白基因片段,将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR—np,以此重组载体转化大肠杆菌Escherichia coli2（E2）,用溶菌酶缺陷噬菌体T4-zl感染重组E2菌,重组载体与缺陷噬菌体T4-zl基因发生同源重组,将np基因整合到噬菌体基因组中,用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-zl—np。经Western blot免疫电镜与ELISA检测证实,T4-zl-np表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。结果表明,AIV核蛋白成功地在T4噬菌体表面展示,为禽流感防治奠定了基础。     

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20（b）中构建成质粒pET—amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20（b）中构建成质粒pET—amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET—amyAⅠ中构建成质粒pET—amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E．coli JM109（DE3）,并将重组质粒pET—amyAⅠ转化E．coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIL。通过IPTG诱导测酶活性：在E．coli JM109（DE3）中表达的重组酶（pET—amyA）、（pET—amyAⅠ）、（pET—amyAⅡ）的酶活分别是1658．0U／mL、6721．7U／mL、8904．5U／mL,在E．coil BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中表达的重组酶（pET—amyAⅠ）的酶活是13867．7U／mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

大豆脲酶基因片段的无性繁殖

纯化的大豆细胞总DNA及质粒pBR322DNA分别经限制性内切酶HindⅢ切割,并用T_4DNA连接酶连接,进行重组。将重组后的DNA转化Escherichia coli C600。用四环素、环丝氨酸富集法浓缩和筛选对氨基苄青霉素具有抗性而对四环素敏感的重组转化子(Ap~rTc(?))。以酚红的显色反应及以脲素为唯一氮源从Ap~rTc~(?)转化子中筛选具有脲酶活性的无性繁殖系,获得一株转化子E.coli C600(pSH120),并从中分离了重组质粒pSH 120 DNA,经凝胶电泳法测定其分子量为12.9×10~6道尔顿。用重组质粒pSH 120 DNA分别转化E.coil C600和E.coliHB101,均能再产生具有脲酶活性的Ap~rTc(?)重组转化子。     

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌lat基因插入突变的重组质粒pELA

本实验将PCR所得的1.8kb的lat基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat,经EcoRI-HindⅢ双酶切后得到lat基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌lat基因的序列及质粒pIJ77(3 pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒)中阿泊拉抗性基因(aac(3)iv)的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的lat基因两端的互补序列,以质粒pIJ773为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有lat基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的lat基因同源序列与pGH112-lat中的野生型lat基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入lat基因中,得到lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌lat基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。     

新型瞬时报告载体pRSET-EGFP的构建及表达

目的：利用分子生物学技术和方法将pRSET-B质粒改建为带有绿色荧光蛋白(GFP)突变体基因(GFP-S65T)的新型瞬时表达载体pRSET-EGFP,并在E．coli．BL21中得到GFP基因的高效表达。方法：PCR法从pEGFP质粒克隆GFP-S65T cDNA并在5’末端引入KpnⅠ的位点。将扩增出来的GFP-S65T基因和pRSEY-B质粒用HindⅢ和KpnⅠ双酶切后连接构成重组质粒。用化学法把重组质粒转化到E．coli．BL21中,培养发酵液。OD540=0．4时加入IPTG诱导GFP-S65T基因转录和表达,合成绿色荧光蛋白。还对诱导条件进行了优化,发酵液OD540=0．4加入IPTG可以得到最优表达。结果：通过Ni^2 柱亲和层析,纯化得到绿色荧光蛋白,SDS-PAGE电泳检测,分子量为27kDa,与文献报道值一致。这说明Ni^2 柱能够有效的纯化表达产物。结论：成功构建了新型瞬时表达载体pRSET-EGFP,并且在E．coli．BL21中得到高效表达。     

人Notch2受体胞内区基因N2ICD的原核表达、纯化和鉴定

[目的]构建含Notch2胞内区基因N2ICD的原核重组质粒,并在E.coli中表达。[方法]根据Gen Bank上N2ICD基因序列设计引物,用PCR从真核重组质粒p CMV-Tag4/N2ICD中扩增目的基因,克隆至携带GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中并转化E.coli BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌体经反复冻融、溶菌酶破菌、超声破碎后,通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达形式,表达产物经谷胱甘肽琼脂糖树脂glutathione sepharose 4B纯化并经Western Blot鉴定。[结果]PCR获取了目的基因人N2ICD,并成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1/N2ICD,目的基因在E.coli中成功表达并以部分可溶性形式表达在上清中,纯化后经Western Blot鉴定表达产物分子量在110 k Da。[结论]重组N2ICD在E.coli中成功获得可溶性表达,为研究Notch2受体在细胞信号转导中的作用奠定了基础。     

大肠杆菌K-12转醛醇酶基因talB的克隆及在运动发酵单胞菌CP4中的表达

研究了E.coliK-12转醛醇酶基因(talB)在自身启动子和在Z.mobilisCP4eno基因启动子的启动下在E.coliDH5α和Z.mobilisCP4中的表达情况。首先克隆了E.coliK-12talB基因,并连接到穿梭载体pZB1上构建成pZB1-talB;然后利用PCR重叠延伸技术将E.coliK-12talB自身的启动子换成Z.mobilisCP4eno的启动子,构建得到pZB1-Peno-talB。将这两个质粒分别转化E.coliDH5α和Z.mobilisCP4。对转化子粗酶液进行的转醛醇酶酶活力测定结果表明,E.coli talB自身启动子和Z.mobilis eno启动子能以基本相同的效率启动talB基因在E.coli和Z.mobilis中的表达。     

基于大肠杆菌受体菌DH5α △asd缺失株的构建及作为基因转化、表达操作系统的评估

基于大肠杆菌(E.coli)染色体上asd基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建E.coliDH5α的asd基因缺失突变株DH5α△asd::cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20介导二次同源重组,以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合PCR扩增和测序结果,证明DH5α△asd缺失突变株的正确构建。该缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力,只有添加DAP或导入表达asd基因的质粒(asd基因互补试验)才能在LB培养基上生长,与原型DH5α比较,其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致。基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统。体外培养连续传代50代次,pnirBMisL-fedF-asd质粒不丢失,并功能性表达F18大肠杆菌黏附素FedF。     

pSH-CUP重组质粒的构建及面包酵母酸性海藻糖 酶基因的敲除

设计含有与面包酵母(Saccharomyces cerevisiae BY-6)编码酸性海藻糖酶ATH基因内部部分序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除单元,转化面包酵母获得G418阳性克隆.将铜抗性基因(cuP1-MT1)导入Cre重组酶表达质粒pSH47,得到重组质粒pSH-CUZ,并转化阳性克隆,以铜抗性筛选面包酵母转化子.半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因.重组质粒pSH-CUP的构建,不仅解决了酵母转化子筛选标记问题和非酵母基因的引入,而且使LoxP-kanMX-loxP基因敲除体系在进行真核生物基因敲除时更加方便可行.     

重组人α降钙素基因相关肽的克隆与表达

通过PCR方法从人类基因组中扩增出编码hαCGRP的片段,将该片段定向克隆到pET-32a( )载体上,构建DET-hαCGRP重组质粒．转化E．coli JM109菌株,利用酶切和测序方法筛选后,经IPTG诱导再转化E.coli BL21trxB(DE3)pLysS菌株.SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物,最后通过扩张蟾蜍肠系膜微循环血管实验来检测重组hαCGRP扩张血管的活性,结果表明,重组质粒含hαCGRP成熟肽编码基因序列(111bp),符合预想结果;表达出21kD的融合蛋白,且主要以可溶性形式存在,其粗提物具有扩张血管能力,重组hαCGRP的成功表达为下一步纯化及研制基因工程药物奠定了重要基础。     

改造的HPV16型E7基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

分别以卡介苗(BCG)基因组DNA及宫颈癌组织提取DNA为模板,通过PCR扩增得到19kD抗原的胞壁区及其上游调控元件(19ss)基因序列和HPV16型E7基因序列。先将19ss基因与大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261重组,得到重组质粒pMCW。再将E7基因克隆至pMCW,得到重组质粒pMCW-E7。最后用PCR引物定点诱变法突变E7基因与转化有关的位点,得到重组质粒pMCW-mE7。对重组质粒pMCW-mE7用PCR扩增、双酶切及测序鉴定证实,19ss基因及突变的E7基因正确插入穿梭质粒pMV261。成功构建了重组穿梭质粒pMCW-mE7。     

肺炎克雷伯菌调控蛋白RcsAB的构建表达及活性鉴定

为了探讨转录调控子Rcs AB对靶基因的转录调控作用,构建肺炎克雷伯菌RcsA和RcsB的重组质粒,之后诱导蛋白表达,提取纯化后测定其活性。PCR得到rcsA、rcsB片段,分别将两DNA片段克隆至表达载体pMAL-C5X、pET28a,构建重组质粒。再将重组质粒导入E. coli BL21(DE3)菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,超声破碎。破碎后的上清过柱、透析纯化,得到高纯度的蛋白,通过EMSA进行蛋白活性鉴定。RcsA,RcsB蛋白成功表达纯化,并能够与靶基因结合,初步证明蛋白具有生物学活性。成功制备有生物学活性的RcsA、RcsB蛋白,为进一步研究RcsAB蛋白复合物特异的生物学功能提供物质基础。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

利用PCR方法从酒类酒球菌(Oenococcus oeni)基因组中扩增出651 bp的DNA片段,将之克隆到pUC19-T载体上并转化大肠杆菌(E.coli)JM109菌株.重组质粒的测序结果表明,克隆到了苹果酸-乳酸酶基因(mle),它含有527 bp的阅读框架,其核苷酸序列与文献报道相同.     

荧光假单胞菌天冬氨酸转氨酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用克隆基因测序技术,从荧光假单胞菌GcM5-1A基因组文库中筛选到了天冬氨酸转氨酶的编码基因aspC。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因,插入pET-15b构建重组表达质粒pET-15bAAT,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中高效表达,利用亲和层析法初步分离纯化了重组蛋白。生物活性分析表明,纯化的重组天门冬氨酸转氨酶具有氨基转移活性。     

Hsh载体对外源基因在E. coli中高效表达的机制探讨

pHsh是根据大肠杆菌的热休克反应构建而成的新型表达载体, 受σ32调控。正常E. coli细胞的整个热休克反应持续时间约12 min, 而在携带有外源基因的高拷贝pHsh的E. coli细胞中, 外源基因却能持续高效表达4?10 h。为探求外源基因高效表达的机制, 以一个编码木聚糖酶的外源基因为代表, 首先研究了质粒拷贝数对木聚糖酶表达的影响, 接着通过Western-blot检测了携带质粒pHsh-xynIII和对照组携带pLac-xynIII的E. coli细胞在非诱导条件下(30 °C)和诱导条件下(30 °C→42 °C)胞内σ32的差异, 最后测定了不同温度下(30 °C、37 °C、42 °C、30 °C→42 °C)携带质粒(pHsh-xynIII)的E. coli细胞内稳定状态下热休克的水平(以木聚糖酶活性表征)。研究结果表明外源基因在pHsh中的高效表达是与3个方面密切相关的: pHsh质粒的高拷贝数增加了外源基因的剂量; pHsh的存在使E. coli细胞内σ32的水平较正常E. coli细胞显著增加了, 并最终增强了E. coli的热休克反应; 诱导状态下带有pHsh重组质粒的E. coli细胞内稳定状态下的热休克水平明显高于其它温度的水平。