草鱼TRAP-PCR反应体系的建立

目的:通过优化草鱼TRAP-PCR反应体系,将新型分子标记-靶位区域扩增多态性(target region amplified polymorphism,TRAP)引用到草鱼遗传多样性研究中。方法:以草鱼DNA为材料,分析了模板DNA、Mg2 、dNTPs、引物浓度,以及循环参数、退火温度对TRAP-PCR扩增结果的影响。结果:确立了稳定性强、重复性好的草鱼TRAP-PCR最佳反应体系和扩增参数:在25μl的PCR反应体系中,含约50ng模板DNA,1UTaq酶,1×PCR缓冲液,2.0mmol/L MgCl2,4种dNTPs各0.2mmol/L,固定引物与随机引物各15pmol;首先使模板在94℃变性3min;然后94℃变性1min,38℃退火1min,72℃延伸lmin进行5个循环;接着94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸lmin再进行35个循环,最后72℃延伸7min。结论:TRAP-PCR反应体系稳定可靠,该新型分子标记可应用于草鱼遗传多样性研究中。     

花椰菜温敏型雄性不育系的RAPD标记

选取温敏花椰菜不育系GS-19与GS-31杂交组合的F2高可育和高不育单株构建基因池,利用100对随机引物对其进行RAPD标记。同时,采用正交设计对其反应体系及扩增条件进行优化。试验结果表明,在25μL反应体系中含dNTPs0.625mmol/L,引物0.5μmol/L,DNA模板60ng,Taq酶1.5U,超纯水14.9μL;反应条件为94℃预变性4min,然后进行94℃变性30s,36℃退火45s,72℃延伸90s,35个循环后,再72℃延伸7min,花椰菜RAPD扩增效果较好。P21-1800为花椰菜温敏雄性不育基因的连锁标记。     

冬瓜和节瓜DNA提取及RAPD反应体系优化

以8份冬瓜和节瓜为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,采用正交试验设计,对冬瓜和节瓜RAPD条件进行了优化,建立了最佳反应体系:25μL反应体系中含1×buffer,模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶的浓度分别为20 ng、2.0mmol/L、0.24 mmol/L、0.3μmol/L和1.0 U。PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,36.9℃退火45 s,72℃延伸1.5min,共40个循环;72℃延伸10 min,12℃保存。     

杨梅RAPD-PCR体系的正交优化研究

以杨梅DNA为模板,对影响杨梅RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立杨梅RAPD反应的最佳体系。通过采用正交试验设计的方法,对杨梅RAPD-PCR条件进行了优化,结果表明最佳的杨梅RAPD-PCR的反应体系(20μl)中含有1×buffer,1.0U TaqDNA聚合酶,3.0mmol/L MgCl2,0.30mmol/L dNTPs,1.5μmol/L引物和模板DNA 30-40ng。适宜的扩增条件为94℃预变性3min,再进入38个PCR循环(94℃变性30s,38℃退火30s,72℃延伸90s),72℃延伸7min,4℃保存。     

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

药用植物草珊瑚RAPD扩增条件优化

采用CTAB-DNA提取方法,从草珊瑚植物的嫩叶中提取总DNA。以此DNA为模板,优化了草珊瑚RAPD-PCR的反应条件。结果表明,PCR扩增体系最适宜的条件为:反应体积25μL,内含2.5mmol/L Mg2+、1.0UDNA聚合酶、0.4μmol/L引物、60ng模板DNA和0.16mmol/L dNTP。扩增程序为:94℃预变性2min;94℃变性30s,37℃复性30s,72℃延伸80s,40个循环;72℃延伸10min;4℃保存10min。     

栝楼ISSR-PCR体系的正交优化

目的：建立栝楼最佳ISSR-PCR正交优化体系,为开展栝楼ISSR分子标记奠定技术基础。方法：采用正交试验设计对影响栝楼ISSR-PCR扩增的重要参数（DNA模板、MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶）进行优化试验,同时进行不同温度梯度试验和ISSR体系筛选。结果：最佳的栝楼ISSR-PCR的反应体系（20μl）为：30ng模板DNA,2.0mmol/L MgCl2,0.3mmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶;退火温度为52℃-55℃;扩增反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,52℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环;72℃延伸7min;4℃保存。结论：建立了栝楼的最佳ISSR反应体系,为栝楼种质鉴定提供了更客观可靠     

红锥基因组RAPD反应体系的建立和优化

以红锥(Castanopsis hystrix A.DC.)嫩叶为材料,应用改良的CTAB方法成功提取了红锥基因组DNA,并对影响随机扩增多态DNA(RAPD)反应的各因素进行了优化,建立了红锥RAPD的优化反应体系及程序.在25μl反应体系中,模板DNA 0.8 ng μl-1,10×Buffer 2.5 μl,Mg2 2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.8 U,dNTPs 0.35 mmol/L,随机引物S42 0.28 μmol/L.PCR循环程序为:94℃预变性3 min,然后94℃ 30 s,39℃ 1 min,72℃ 2 min,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存.     

土壤微生物RAPD分析体系的优化研究

采用正交实验设计,对影响土壤微生物RAPD扩增体系的Mg2+、dNTP浓度及引物浓度进行了研究,同时对退火温度、延伸时间及循环次数进行摸索。结果表明,适宜土壤微生物PCR扩增反应在25μl体积中进行,包括7ng土壤微生物DNA样品、20pm随机引物l、.5uTaq酶、3.0mmol.L-1Mg-CL2和0.2mmol.L-1dNTP。PCR扩增反应进程如下:94℃3min,使土壤DNA变性;然后再进行39个循环,每个循环包括94℃1min,37℃40s,72℃90s,结束后72℃延伸7min。     

广东野百合DNA提取和RAPD条件的优化

以野百合(Lilium brownii)新鲜叶片、硅胶干燥叶片及鳞片为材料,研究了DNA的提取方法,并对影响随机扩增多态DNA(RAPD)反应的各因素进行了优化。建立了野百合RAPD的优化反应体系及程序,即在20μl反应体系中,含20 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg2 、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.3μmol/L随机引物S1519;扩增程序为:94℃预变性5 min,然后94℃30 s,38℃50 s,72℃1 min,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存。