介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点鉴定

BLM解旋酶是人RecQ DNA解旋酶家族重要成员之一,在机体的DNA复制、重组、损伤修复以及维护基因组稳定性等方面发挥重要作用。早期研究表明,BLM解旋酶通过自身携带的核定位信号（nuclear localization signal, NLS）进入细胞核,但是介导其细胞核定位的关键氨基酸位点尚不清楚。本研究构建了BLM解旋酶C端(aa642 1417)截短体克隆,首先通过截短表达的方法确证其NLS结构域。在此基础上,构建重组真核表达载体pEGFP NLS/BLM NES/Rev,通过观察BLM NLS碱性氨基酸位点突变对EGFP NLS/ BLM NES/Rev融合蛋白细胞核定位的影响,以此快速鉴定NLS中介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点。结果表明,BLM(aa642 1417) C端截短体具有与全长BLM解旋酶相同的细胞核定位,同时确证1344RSKRRK1349是BLM解旋酶NLS结构域的活性位点,且具有与SV40 NLS相同的核输入能力。氨基酸位点突变试验结果表明,R1344A、K1346A、R1348A和K1349A点突变均减少了EGFP NLS/BLM NES/Rev和EGFP BLM(642 1417)融合蛋白的细胞核定位。因此,这4个位点是介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点。此结果为后续研究BLM解旋酶细胞核定位的分子机制奠定了基础。     

促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EphA2)SAM结构域对激酶结构域的脂质体结合能力与激酶活性的调控研究

促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph receptor) 是受体酪氨酸激酶(RTK)家族中最大的亚家族,其介导的双向信号传导对细胞的形态、黏附、运动、增殖、生存及分化都有重要的调控作用。EphA2是Eph受体家族中一个被广泛研究的重要亚型,在白内障和乳腺癌等病理发生过程中发挥了重要作用。既往研究发现:EphA2受体的激酶结构域可结合细胞膜,其激酶活性受磷脂膜的调控,但是相邻的SAM结构域对激酶结构域与脂膜的相互作用以及激酶活性的影响尚不清楚。在此项研究中,通过与磷酸酶PTP1B1-301活性片段共表达的方式,表达、纯化了EphA2受体的胞内段激酶-SAM串联结构域,通过比较胞内段激酶-SAM串联结构域与单独激酶结构域的脂质体结合能力,以及测定对应的激酶活性,发现:EphA2受体胞内段的SAM结构域使其激酶结构域与脂质体(4 mg/mL)的结合能力增强约6倍(P＜0.001);磷酸化后的EphA2胞内段激酶-SAM串联结构域结合脂质体(4 mg/mL)的能力比非磷酸化的胞内段激酶-SAM串联结构域提高2.5倍(P＜0.05);而结合脂质体后,激酶结构域的激酶活性也被进一步提高,从而形成正反馈。综上所述,本研究的发现提示:EphA2胞内段的酪氨酸激酶结构域与相邻的SAM结构域可形成一个完整的结构功能单位,其激酶活性和脂质体结合能力与单独的激酶结构域相比都形成了明显的差异,我们的这一发现对进一步理解Eph受体家族其他亚型的激酶结构域的活性调控提供了参考与思路。     

棕榈酰化修饰对G蛋白偶联受体功能的调节作用

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)作为跨膜蛋白,其结构和功能同时受相互作用的蛋白质和脂质分子调控.S-棕榈酰化(S-palmitoylation)能够影响GPCRs与信号蛋白及膜脂分子的相互作用,在GPCRs相关的多项生理进程中发挥重要调节作用.棕榈酸与GPCRs的半胱氨酸间形成不稳定的硫酯键,其修饰动力学过程受棕榈酰转移酶(protein acly transferases,PATs)与硫酯酶(thioesterases)之间的可逆性双重调控,与受体活性及生理状态密切相关.棕榈酰化修饰多发生在GPCRs的C末端,通过棕榈酸侧链插入到质膜内侧而形成第4和/或第5个胞内环,从而影响GPCRs的构象,促进其正确折叠与成熟,并对GPCRs胞内转运、分选、下游信号转导、失敏、内化、寡聚化等活动产生影响.此外,棕榈酰化还与磷酸化、泛素化及亚硝基化等多种翻译后修饰机制相互作用,共同参与调节GPCRs的功能.GPCRs的棕榈酰化修饰酶学机制以及GPCRs蛋白复合体棕榈酰化修饰胞内动力学过程将是未来的研究热点.     

增龄引起复制性衰老细胞胞内钙信号转导的变化

为了观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )引起复制性衰老细胞胞内游离钙的变化以及衰老对其的影响 ,初步阐明衰老引起胞内游离钙变化的机制 .选用人胚肺二倍体成纤维细胞WI 38细胞株 ,利用逆转录PCR(RT PCR)技术及Northern杂交技术检测衰老细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1R)、血管紧张素Ⅱ 2型受体 (AT2R)mRNA水平的表达 ;利用激光共聚焦显微成像技术 (LSCM )观察WI 38细胞在AngⅡ刺激 ,Valsartan阻断条件下细胞内钙离子荧光强度的改变 .AngⅡ通过AT1受体介导增加WI 38细胞内游离钙的水平 ,并随着WI 38细胞传代增加至衰老状态 ,AT2受体高表达 ,AT1受体介导的钙离子信号转导的活性逐渐降低 .提示WI 38细胞衰老过程中钙离子信号的转导活性降低 ,并且AT1R和AT2R在血管紧张素Ⅱ介导的细胞内钙信号活性中具有不同的作用与机制 .为探讨WI 38衰老细胞内钙信号变化机制提供了实验依据     

NOK与Akt相互作用并增强Akt的活化

NOK是一个新近鉴定的受体型蛋白酪氨酸激酶分子,它能够促进肿瘤的形成和转移.前期的研究表明,NOK在小鼠前B细胞(BaF3)中能够激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路.但是,人们并不清楚NOK在细胞内是如何激活PI3K信号通路的.研究发现,NOK与PI3K下游的效应分子蛋白激酶B(Akt)具有直接的相互作用.并且,在人胚肾细胞(HEK293T)中,NOK能明显增强Akt的活性.通过NOK缺失突变体的免疫共沉淀实验,确定了Akt能直接结合NOK的激酶结构域.同时,Akt的激酶活性缺失体并不影响其与NOK的结合,但也观察到,持续活化的Akt跟NOK具有更强的相互作用.最后,发现NOK对胰岛素介导的Akt激活并没有产生叠加效应.实验结果显示,NOK可以与Akt直接相互作用并增强PI3K/Akt信号通路的活化.     

死亡受体6的胞内结构域对其亚细胞定位的调节

死亡受体6(death receptor 6,DR6)是死亡受体家族的一员,在免疫系统和神经系统中发挥着重要功能,然而,其亚细胞定位和调节机制尚不清楚。作者研究发现DR6不仅能够定位在细胞质膜表面,同时也存在于细胞内体系统。膜表面的DR6可以发生内吞,功能性单克隆抗体能够加速其内吞。通过构建一系列胞内结构域的缺失突变体,结果显示单独缺失丝氨酸/脯氨酸富集结构域,DR6在细胞膜表面定位显著增加,在内体定位显著减少。而分别缺失另外三个胞内结构域,DR6主要定位在细胞内体。以上结果提示DR6的胞内不同结构域在调控DR6的亚细胞定位和功能中发挥着重要作用。     

病毒蛋白脂酰化及其功能

脂酰化是一种重要的蛋白翻译后修饰,主要包括棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊烯化和糖基化磷脂酰肌醇(GPI)共价结合4种方式。不同的病毒蛋白可发生不同类型的脂酰化,其生物学功能也会发生相应改变。棕榈酰化通常能增强病毒跨膜蛋白的疏水性,调节这些蛋白的胞内运输及定位,进一步影响病毒感染过程中的膜融合、病毒颗粒装配及释放等步骤。豆蔻酰化则可调控病毒蛋白表面的正电荷强度,使病毒蛋白与脂质膜的亲和力改变,如preS1豆蔻酰化加强乙型肝炎病毒(HBV)和丁型肝炎病毒(HDV)的受体识别能力及感染性,而人类免疫缺陷病毒(HIV)Nef豆蔻酰化为病毒感染及免疫应答所必需。异戊烯化能使病毒游离的蛋白与膜结合,并介导蛋白间的相互作用,如大HDV抗原(L-HDAg)异戊烯化有利于其运输至内质网膜上,与HBV表面抗原(HBsAg)及HDV RNA共同形成HDV颗粒。此外,一些病毒蛋白与GPI通过共价结合形成复合物,GPI基团可改变感染细胞的膜结构及胞质内磷脂构成,如GPI与朊蛋白(PrP)结合导致细胞型朊蛋白(PrPc)交联或羊痒疫朊蛋白(PrPsc)聚集,与朊病毒引起的海绵样病变有关。进一步了解病毒蛋白脂酰化机制,有利于设计和开发以此为靶点的特异性抗病毒新药。     

小鼠TET1蛋白核定位信号的预测与鉴定（英文）北大核心CSCD

TET(ten-eleven translocation)家族蛋白能够介导DNA的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)的氧化,产生5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)。通过TET蛋白的催化,可以诱导特定靶基因的启动子区域Cp G岛的去甲基化,从而激活基因的转录。TET1蛋白是一个拥有2039个氨基酸的DNA去甲基化酶,通过预测,TET1拥有18个核定位信号(nuclear localization signals,NLSs),其中13个为单分型NLS,5个为双分型NLS。本文利用绿色荧光蛋白和各种突变体,首次确定了小鼠TET1蛋白的2个NLSs,分别存在于CXXC结构域和催化结构域,而且这2个NLSs对全长TET1的和定位都是必需的。我们的研究对深入理解TET1的蛋白结构与功能研究具有重要意义。     

小鼠TET1蛋白核定位信号的预测与鉴定（英文）

TET(ten-eleven translocation)家族蛋白能够介导DNA的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)的氧化,产生5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)。通过TET蛋白的催化,可以诱导特定靶基因的启动子区域Cp G岛的去甲基化,从而激活基因的转录。TET1蛋白是一个拥有2039个氨基酸的DNA去甲基化酶,通过预测,TET1拥有18个核定位信号(nuclear localization signals,NLSs),其中13个为单分型NLS,5个为双分型NLS。本文利用绿色荧光蛋白和各种突变体,首次确定了小鼠TET1蛋白的2个NLSs,分别存在于CXXC结构域和催化结构域,而且这2个NLSs对全长TET1的和定位都是必需的。我们的研究对深入理解TET1的蛋白结构与功能研究具有重要意义。     

原型泡沫病毒Bel1蛋白核定位信号精细定位及相互作用核输入蛋白初探

Bel1是原型泡沫病毒(Prototype foamy virus,PFV)的反式激活因子,在病毒的复制周期中发挥关键作用。研究表明,Bel1含有核定位信号(Nuclear localization signal,NLS),但其精确氨基酸组成尚不明确,介导其入核的核输入蛋白亦未见报道。本研究利用插入Bel1截短片段的EGFP-GST融合表达体系,通过绿色荧光观察其亚细胞定位,首次精确确定Bel1NLS序列为215PRQKRPR221;定点突变明确了K218、R219和R221为Bel1核定位的必需残基,证明Bel1NLS属单分型核定位信号;GST-Pulldown实验显示这段序列可与α核输入蛋白(Importinα/Karyopherin alpha,official symbol:KPNA)KPNA1、KPNA6和KPNA7相互作用,即Bel1可能藉此转运入核。     

NHE1的结构研究及其在缺血再灌注中的作用

钠氢交换体1(sodium/hydrogen exchanger 1,NHE1)是已知唯一一种在心肌细胞膜上显著表达的钠氢交换体(NHE)亚型,由N端的介导离子转运的跨膜结构域和C端胞内调节结构域两部分构成,对于维持正常心肌细胞内的pH值具有重要的作用,并且在代偿心肌缺血再灌注造成的细胞内pH值的变化中发挥主要作用。本文主要论述NHE1的结构以及其在心肌缺血再灌注中的研究进展。     

麻黄碱对小鼠输精管平滑肌的作用

麻黄碱(2×10~(-4)-1.6×10~(-3)M)和去甲肾上腺素(6×10~(-7)-7.5×10~(-5)M)均能引起并增强离体小鼠输精管自发性收缩。酚妥拉明(10~(-6)M)可明显对抗麻黄碱的作用。小鼠经利血平处理后,输精管对去甲肾上腺素的反应有所增强,但不明显影响麻黄碱的作用。在半钙营养液(含CaCl_21.25mM)中,麻黄碱的作用明显减弱;在无钙溶液中作用完全消失。但去甲肾上腺素的作用在半钙营养液中不明显减弱;无钙溶液中仍有大部分标本对去甲肾上腺素产生微弱反应。钙道阻断剂戊脉安可明显减弱或取消麻黄碱兴奋小鼠输精管的作用,而对抗去甲肾上腺素的作用较弱。麻黃碱在较低浓度(5×10~(-7)-1.6×10~(-5)M)时,尚能抑制输精管对电场刺激所致收缩反应,这种抑制作用可被α_2受体对抗剂育亨宾(10~(-7)M)所对抗。降低营养液中钙离子浓度,可增强麻黄碱的抑制作用。高浓度麻黄碱完全抑制电场刺激所致收缩,而出现明显增强的自发收缩。以上表明,麻黄碱对小鼠输精管突触前膜α_2受体和突触后膜α_1受体都有激动作用。麻黄碱引起并增强输精管平滑肌收缩的作用,主要是其对突触后α_1真受体的直接作用,并需要有钙离子的参与。     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化

将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因构建重组表达质粒pKKFPGA ,pKKFPGA再转化宿主菌DH5α,所得重组菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶 ,表达量达 2590u L ,比野生型粪产碱杆菌表达量高432倍 ,其菌体比活力达300 (u L) A₆₀₀。菌体破碎后的上清液经DEAE-SepharoseCL 6B离子交换层析和Butyl-SepharoseCL 4B疏水层析 ,即可得纯度提高 20倍、比活为 686u mg的青霉素G酰化酶 ,两步纯化的总收率达 91%。Western印迹分析表明5%的原前体青霉素酰化酶在胞内形成了包涵体 ,说明其成熟的限速步骤在胞内的运输阶段.     

国外研究信息

<正>白细胞介素1受体相关激酶1旁路引发和直接连接Toll样受体至快速核苷酸结合寡聚化结构域样受体含热蛋白结构域3炎性体激活致病性感染和组织损伤引发炎性体的组装,这种胞质蛋白复合物激活半胱天冬酶-1(caspase-1),促进白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和pro-IL-18的切割成熟,还能调节caspase-1依赖的程序性细胞死亡(pyroptosis)。众所周知,微生物识别Toll样受体(TLR)主要是诱导激活caspase-1,但已知的TLR功能仅限于上调炎性体的作用。感染致命微生物后,TLR和核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)有可能同时     

白血病细胞系来源的P2X7受体的功能研究

P2X7受体是ATP门控的离子通道。从白血病细胞系J6-1细胞中扩增P2X7受体编码区全序列,克隆到pTARGET真核表达载体,经DNA序列分析后转染Ramos细胞,获得稳定表达细胞株;应用RT-PCR、Westernblot和流式细胞术检测P2X7受体在Ramos中的表达;荧光分光光度计检测P2X7受体介导的胞内钙离子浓度变化。结果显示,J6-1细胞来源的P2X7受体在第559位有一个A→G的有义突变,导致Asn187→Asp187,可在Ramos细胞中表达,在特异性激动剂BzATP作用下可引起胞内钙离子浓度的升高,但所需激动剂浓度高于常规浓度。     

组蛋白甲基转移酶G9a的表观遗传调控在肿瘤发生中的作用

抑癌基因的表达抑制是肿瘤发生发展中的关键步骤,其中表观遗传学调控机制在抑制表达的过程中起重要作用。组蛋白赖氨酸甲基转移酶G9a,含有经典的SET结构域,主要介导染色质中组蛋白H3中第9位赖氨酸的一甲基化和二甲基化(mono-and di-methylation of histone H3 Lys9,H3K9me1/H3K9me2)。G9a在多种肿瘤中的表达上调,并且G9a的表达异常增高与肿瘤预后不良有密切相关性。本文就G9a的结构及其在表观遗传上的功能做综述,重点描述G9a在肿瘤发生上的作用,并分析其作为靶点对肿瘤诊断和治疗的指导性意义。     

Eph-ephrin介导反向信号传递的研究进展

双向信号传递是细胞间通讯领域中新近阐明的机制,酪氨酸激酶受体-配体(Eph-ephrin)介导的双向信号传递是此机制中的一个重要代表.Eph酪氨酸激酶家族受体及其配体ephrin家族成员是在神经发育、血管新生等方面起重要作用的分子,通过Eph向细胞内传递的信号称为正向信号,通过其配体ephrin的信号称为反向信号.Ephrin家族又可根据分子结构分为2个亚家族,其中ephrinB为跨膜蛋白,可通过酪氨酸磷酸化依赖和PDZ结合结构域介导2种方式向胞内传递反向信号,活化FAK、JNK、Wnt等信号通路,ephrinA为糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白,也具有反向信号传递功能.     

G蛋白偶联的雌激素受体在体内的表达与功能

G蛋白偶联的雌激素受体(Gprotein-coupled estrogen receptor1,GPER)曾被命名为G蛋白偶联受体30(Gprotein-coupled receptor30,GPR30),是近年发现的一种有别于雌激素经典核受体的功能性膜性受体,该受体广泛表达于海马、下丘脑、子宫、卵巢、乳腺、骨和心血管等全身多个系统、器官和组织,在细胞内主要定位于细胞膜、内质网、线粒体和高尔基体。GPER与雌激素结合,通过激活胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol 3 kinases/phosphorylated proteinkinaseB,PI3K/AKT)、Ca2+和环磷酸腺苷(3'-5'-cyclic adenosine monophosphate,cAMP)等第二信使途径发挥快速非基因效应,在神经系统、生殖系统、运动系统和心血管系统中发挥重要的生理作用。     

氨甲酰胆碱增加大鼠心室肌细胞收缩机制的初步研究

目的:本文研究非选择性M受体激动剂氨甲酰胆碱(Cch)对心肌细胞收缩的作用,并同时观察L-型钙流,探讨其机制.方法:以分离大鼠的单个心室肌细胞为对象,采用膜片钳和单细胞收缩测量技术,在35℃恒温,细胞外钙离子浓度1.8 mmol/L,0.2 Hz,1.0 Hz刺激下测量细胞收缩幅度和ICa(L)、INa/Ca.结果:①大鼠心肌细胞收缩与刺激频率呈负相关;②选择△L0.2 Hz/△L1.0 Hz≥1.25(n=6)的细胞给予1.0 Hz的刺激,100 μmol/L Cch增加大鼠心室肌细胞收缩28%.③ Cch作用能被非选择性M受体阻滞剂阿托品阻滞,选择性M1受体激动剂MCN-A-343 100 μmol/L对细胞收缩无影响.④ 100 μmol/L Cch对ICa(L)无影响,但增加从 10 mV复极到-40 mV所产生的晚期尾电流,提示INa/Ca加大.结论:Cch能加强大鼠心室肌细胞收缩,它的作用由M2受体介导,其机制可能是通过加强INa/Ca,增加肌质网(SR)内的钙内容和钙释放,导致细胞收缩加强,而非通过L-型钙流.     

病原菌效应蛋白翻译后修饰宿主免疫防御通路

病原菌效应蛋白破坏宿主细胞的正常信号转导是病原菌和宿主相互作用的重要体现.效应蛋白往往具有独特的生化活性,针对宿主细胞内与抗细菌感染相关的重要通路进行阻断.近年来,在病原菌效应蛋白作用机制的研究中,人们发现了几种由效应蛋白介导的全新的蛋白质翻译后修饰.OspF(outer Shigella protein F)效应蛋白家族具有磷酸化苏氨酸裂合酶活性,通过"消去"修饰和失活宿主MAPK激酶.NleE(non-LEE encoded effector E)效应蛋白则通过半胱氨酸甲基化修饰来抑制感染诱导NF-κB炎症通路的激活.NleB(non-LEEencoded effectorB)蛋白抑制宿主的死亡信号通路,则依赖于其N-乙酰葡萄糖胺转移酶活性介导的对死亡结构域蛋白的精氨酸糖基化修饰.而VopS(Vibrio outer protein S)和IbpA(Immunoglobulin-binding protein A)等含有Fic结构域的蛋白,则可以将AMP基团转移到Rho家族小G蛋白的保守苏氨酸或酪氨酸上,导致小G蛋白的失活和肌动蛋白细胞骨架的紊乱,从而引起细胞毒性.以上效应蛋白作用机制及生化活性的阐明,有助于全方位了解病原菌的致病毒力机制,也开辟了蛋白质翻译后修饰介导病原-宿主相互作用研究的新方向,同时对真核生物的信号转导研究也具有重要指导意义.