麻竹同源异型盒基因DlKNOX的克隆及表达分析

为探讨同源异型盒(KNOX)基因在麻竹(Dendrocalamus latiflorus)茎秆发育中的作用,采用RT-PCR和RACE技术,从其幼茎中克隆了1个KNOX同源基因,命名为Dl KNOX,其c DNA序列全长为1511 bp,包含5′UTR 196 bp、3′UTR 238 bp和编码区1077 bp。该基因编码含358氨基酸的蛋白,具有KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN等4个保守结构域,符合KNOX家族的特征,属于I类蛋白。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OSH1的一致性最高(86%)。组织表达特异性分析表明,Dl KNOX在节部的表达丰度最高,其次为幼茎,根中最低。Dl KNOX基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中经诱导表达,获得1条分子量约为82 k Da的重组蛋白,与预期的重组蛋白分子量一致(包含了MBP标签蛋白42.5 k Da和Dl KNOX蛋白39.5 k Da)。该基因在大肠杆菌中的最适表达条件为28℃,0.3 mmol L–1 IPTG诱导2 h。这为进一步研究Dl KNOX在麻竹茎秆发育中的功能奠定了基础。     

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。     

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在E.coli BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

原核表达载体pET30a/ATRX-C_(2193-2492)的构建与诱导表达

[目的]构建大鼠ATRX抗原端氨基酸序列的原核表达载体,为进一步制备ATRX多克隆抗体以及探讨ATRX蛋白在HPV16致宫颈癌中的作用奠定基础。[方法]以IF-GFP-ATRX质粒为模板,PCR扩增获得ATRX-C_(2193-2492)基因片段,并克隆至p ET30a(+)空载体上,转化E.coli BL21感受态细胞,构建原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),经PCR、双酶切以及测序鉴定。将构建好的质粒p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)转化,经IPTG诱导表达,利用镍离子亲和层析法纯化6His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白。[结果]成功获得900 bp的ATRX-C_(2193-2492)基因片段并构建了原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),且该载体能在E.coli中诱导表达分子量约34 k Da蛋白产物。[结论]原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)能成功诱导表达分子量约34 k Da的ATRX-C_(2193-2492)蛋白,该蛋白纯化产物能为后续ATRX多克隆抗体的制备提供实验基础。     

托佩克猪SLA-3原核表达载体构建及表达

目的:研究托佩克猪SLA-3-TPK的原核表达载体的构建及蛋白表达。方法:设计引物扩增SLA-3-TPK胞外区(命名为SLA-3-TPKe),并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector,经双酶切筛选阳性克隆测序,序列正确的克隆片段与表达载体p ET-21a(+)连接,转化宿主菌BL21,并经过诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果:PCR成功扩增获得SLA-3-TPke,大小约为850bp,酶切后插入片段大小约为830bp,经克隆测序,阳性克隆序列与原序列一致,双酶切鉴定证实目的基因与p ET-21a(+)成功连接,经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测,结果显示目的基因成功表达且目的蛋白大小约为31k Da。结论:该研究成功构建了托佩克猪SLA-3原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。     

人骨钙素真核表达载体构建及蛋白表达纯化

[目的]在毕赤酵母真核表达系统中获得人骨钙素(h BGP)蛋白以便用于2型糖尿病新药研究。[方法]人工合成h BGP基因并克隆入真核载体p PIC9K,转化毕赤酵母GS115,0.5%甲醇诱导表达,优化表达时间,实现h BGP的真核表达。获得的目的蛋白经离子交换层析和分子筛等进行纯化,用Tricine-SDS-PAGE检测蛋白表达情况及纯化结果,并以Western blot进行验证。[结果]酶切及基因测序结果显示成功构建了p PIC9K-BGP真核表达载体,经Tricine-SDS-PAGE及Western blot测定均检测到分子量为5.8k Da的目的条带,表明h BGP在毕赤酵母中成功表达并纯化。[结论]构建的p PIC9K-BGP真核表达载体能在毕赤酵母中成功表达分子量为5.8k Da的h BGP蛋白,经纯化后目的蛋白纯度在95%以上。     

苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B基因的克隆及表达

[目的]将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi B)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化。[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增Rpi B基因,经酶切连接表达载体p ET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况。通过LC-MS-MS验证重组酶活性。[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 k Da左右。优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多。重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19%。[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的Rpi B酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性。     

人TRAF3IP3基因剪接异构体2的克隆表达和生物信息学分析

[目的]克隆、原核表达并纯化人类TRAF3IP3基因剪接异构体2(TRAF3IP3iso2),对TRAF3IP3iso2蛋白进行生物信息学分析。[方法]从人骨髓单个核细胞c DNA中扩增TRAF3IP3iso2开放阅读框区,双酶切连入原核表达载体p ET-28a(+),重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达效果,Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白;根据测序结果对TRAF3IP3iso2蛋白进行生物信息学分析。[结果]成功克隆了人类TRAF3IP3iso2编码区并构建了原核表达载体p ET-28a(+)-TRAF3IP3iso2,在大肠杆菌中诱导表达、纯化获得了相对分子量约22.7k Da的融合蛋白;生物信息学分析显示TRAF3IP3iso2蛋白二级结构以α螺旋为主,无TRAF3IP3iso1蛋白的跨膜区结构。[结论]证明了人类TRAF3IP3iso2的存在,为TRAF3IP3功能的研究提供了实验依据。     

细小脲支原体Up3_c0507基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建目的基因细小脲支原体Up3_c0507原核表达载体,进行原核感受态细胞的转化,诱导转化菌表达融合蛋白,制备其多克隆抗体并进行鉴定,为后续研究奠定基础。方法运用PCR从细小脲支原体菌株Up3基因组中扩增第c0507段基因,用限制性内切酶BamH I和Not I分别对目的片段和载体PGEX-6P2进行双酶切,利用T4连接酶进行连接,将其转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白GST-Up3_c0507。将表达的GST-Up3_c0507融合蛋白采用商品化GST-Beads纯化。将纯化后的融合蛋白作为抗原,与Freund佐剂充分混合后免疫6周龄BALB/c雌性健康小鼠,制备多克隆抗体。应用Western blot鉴定多克隆抗体的特异性及相应的效价。结果成功构建细小脲支原体基因Up3_c0507,全长363 bp,所编码的蛋白相对分子质量约为9 100,其表达融合蛋白GST-Up3_c0507相对分子质量约为38 100;将其对小鼠进行免疫后,成功制备出GST-Up3_c0507多克隆抗体;Western blot测得所制备的多克隆抗体特异性高,与其他蛋白无交叉反应,效价为1∶1 600。结论成功制备出特异性高且效价高的GST-Up3_c0507蛋白的多克隆抗体,为细小脲支原体的临床检验诊断试剂的研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白PBPX基因的克隆与表达

[目的]对金黄色葡萄球菌一种新的青霉素结合蛋白(PBPX)进行原核表达,为新型抗菌药物设计提供参考数据。[方法]将ATCC25923基因组数据通过Blast进行比对,从中发现了一个含有PBP保守结构域的基因序列,命名为PBPX。PCR扩增PBPX基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体p ET-32a(+)连接,构建表达PBPX的重组质粒,将该重组质粒转化大肠杆菌TG1内,增菌培养后提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后,再转化大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株诱导后进行10%SDS-PAGE分析。[结果]构建了表达载体p ET-32a(+)-PBPX,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得表达,重组青霉素结合蛋白分子量为52. 2 k Da。[结论]PBPX基因成功克隆到表达载体内并获得了表达。     

Solitalea canadensis源β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因克隆、异源表达和酶学特性

【目的】对细菌Solitalea canadensis中编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因进行克隆,通过原核表达获得重组β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并研究其酶学性质。【方法】以Solitalea canadensis基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖(pNP-β-Glc NAc)为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适p H以及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Solitalea canadensis克隆得到了β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因片段(Gene Bank:WP_014682183.1),全长2586 bp,重组表达所得蛋白表观分子量约为97 k Da,最适pH 6.0,最适温度42°C,但不稳定,半衰期小于5 min。该酶对十二烷基磺酸钠(SDS)敏感,活性受Triton X-100和尿素的抑制。此外二糖分子也能不同程度地抑制该重组酶的活性,特异性抑制剂PugNAc(O-(2-Acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylideneamino)N-phenylcarbamate)对该酶的IC_(50)为2μmol/L。该重组酶蛋白除能水解对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷和对硝基苯酚-β-乙酰氨基半乳糖(pNP-β-GalNAc)外,还能对O-链聚糖核心结构Core Ⅱ末端的乙酰氨基葡萄糖进行水解。【结论】本文首次从Solitalea canadensis中克隆得到能水解末端β1-6连接的乙酰氨基葡萄糖而不能水解β1-4连接键的β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并对其进行了酶学性质研究和底物特异性分析,为开发高效特异性强的糖链分析工具酶提供理论基础。     

金龙胆草鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达

本研究根据金龙胆草转录组数据库筛选获得了皂苷合成途径的一个关键酶基因——鲨烯环氧酶(SQE)。以筛选获得的基因序列,设计带有限制性内切酶Bam HⅠ和XhoⅠ位点的特异引物,通过RT-PCR方法对SQE基因进行克隆,并利用限制性内切酶和T4连接酶的共同作用,构建p ET30b(+)-SQE原核表达载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中,当OD600达到0.6时加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,最终以SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测蛋白的表达情况。结果表明本研究成功克隆了金龙胆草鲨烯环氧酶基因(Cb SQE),该基因开放阅读框为1 575 bp,编码525个氨基酸。系统发育树分析显示Cb SQE与毛曼陀罗及绞股蓝SQE基因亲缘关系比较近;酶切及测序结果表明,成功构建了Cb SQE基因原核表达载体;SDS-PAGE显示成功诱导表达了Cb SQE融合蛋白,蛋白分子量为57 k D,与理论预测结果相符合。本研究结果为解析金龙胆草的皂苷合成途径提供了一定的理论依据。     

C2株贾第虫醛糖还原酶的原核表达与生物信息学分析

[目的]克隆、原核表达、纯化C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)醛糖还原酶(Aldose reductase,AR)基因,并进行生物信息学分析。[方法]从C2株贾第虫基因组DNA中克隆贾第虫AR编码区,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),酶切和测序进行验证,并进行生物信息学分析;将构建成功的重组质粒pET-28a(+)-AR转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并进行诱导表达,SDS-PAGE及Western Blot验证表达效果;镍亲和层析纯化AR蛋白,SDS-PAGE观察纯化效果。[结果]成功克隆了C2株贾第虫AR蛋白编码区并构建了原核表达载体,SDS-PAGE及Western Blot显示,AR表达载体转化的大肠杆菌经诱导可表达出相对分子量约37.2k Da的目的蛋白,与预期一致;重组蛋白通过亲和层析获得了高效纯化;生物信息学分析显示贾第虫AR蛋白主要二级结构为无规则卷曲,整体为一个NADPH依赖的氧化还原酶结构域。AR蛋白在真核生物中相当保守,贾第虫AR蛋白在进化上相对独立。[结论]证实了贾第虫AR蛋白的存在并明确了其结构和进化上的特征,为贾第虫AR抗体的制备和功能的研究提供了基础。     

阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因原核表达质粒的构建及表达

质粒 pMD-18T-ap65-3 经 Xho I 和 BamH I 双酶切, 1.0% 凝胶电泳后纯化回收阴道毛滴虫黏附蛋白 65-3 基因,定向克隆至原核表达载体 pET-32a( ), 构建原核表达质粒 pET32a-ap65-3. 重组质粒转化大肠埃希菌 JM109 感受态细胞中, 筛选阳性克隆, 进行PCR﹑酶切及测序鉴定正确后, 将重组质粒 pET32a-ap65-3 转化于大肠埃希菌 BL21 中,异丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导重组蛋白表达后利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和免疫印迹 (Western blot) 对重组蛋白进行分析鉴定. 本实验为研究阴道毛滴虫病的致病机制及蛋白生物学功能奠定了基础.     

C2株贾第虫醛糖还原酶的原核表达与生物信息学分析北大核心

[目的]克隆、原核表达、纯化C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)醛糖还原酶(Aldose reductase,AR)基因,并进行生物信息学分析。[方法]从C2株贾第虫基因组DNA中克隆贾第虫AR编码区,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),酶切和测序进行验证,并进行生物信息学分析;将构建成功的重组质粒pET-28a(+)-AR转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并进行诱导表达,SDS-PAGE及Western Blot验证表达效果;镍亲和层析纯化AR蛋白,SDS-PAGE观察纯化效果。[结果]成功克隆了C2株贾第虫AR蛋白编码区并构建了原核表达载体,SDS-PAGE及Western Blot显示,AR表达载体转化的大肠杆菌经诱导可表达出相对分子量约37.2k Da的目的蛋白,与预期一致;重组蛋白通过亲和层析获得了高效纯化;生物信息学分析显示贾第虫AR蛋白主要二级结构为无规则卷曲,整体为一个NADPH依赖的氧化还原酶结构域。AR蛋白在真核生物中相当保守,贾第虫AR蛋白在进化上相对独立。[结论]证实了贾第虫AR蛋白的存在并明确了其结构和进化上的特征,为贾第虫AR抗体的制备和功能的研究提供了基础。     

解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

[目的]实现解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,建立有效的透析复性方法,获得有活性的重组淀粉酶。[方法]以解淀粉芽孢杆菌DSM 7基因组DNA为模板,PCR扩增获得无信号肽的α-淀粉酶结构基因,克隆至p ET-22b(+),转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况,采用透析法进行包涵体复性并检测酶活。[结果]成功表达重组蛋白,相对分子量约为54.8k Da,成功复性包涵体,复性效率为22.78%,重组α-淀粉酶酶活力为102.4 U/m L。[结论]实现了解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,包涵体经透析法成功复性,获得具有催化活性的重组淀粉酶。     

拟康氏木霉eg1基因的克隆及在酿酒酵母中的分泌表达

从拟康氏木霉3.3002基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因,该基因全长1566 bp,由3个外显子2个内含子组成,编码461个氨基酸.编码蛋白EGI的N端为22aa组成的信号肽,其后依次为催化结构域、连接肽和结合结构域.采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1,并将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载体pYEα中,构建成pYEα-Peg1重组质粒,转化酿酒酵母.重组转化子经β-半乳糖诱导,检测表达产物的分子大小以及酶活,结果表明,转化子在刚果红平板上可产生明显的水解圈;酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EG I并分泌到胞外;SDS-PAGE电泳显示EGI蛋白分子量比预期目的蛋白稍偏大.     

益母草糖基转移酶基因的克隆及原核表达分析(英文)

通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从益母草(Leonurus heterophyllus Sweet)叶片中克隆获得了一个编码糖基转移酶的基因(LhsUGT)。该基因cDNA全长为1562 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1368 bp,编码455个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为50.47 k D和5.52。生物信息学分析结果显示:LhsUGT编码的酶蛋白含有3种二级结构,其中α螺旋占43.1%,β折叠片占17.5%,无规卷曲占39.4%,其C端还发现了一段高度保守的PSPG结构域,说明LhsUGT编码的酶蛋白属于植物糖基转移酶超家族;对LhsUGT的氨基酸序列进行BLAST同源比对,发现益母草与其它植物的糖基转移酶序列相似性为26.4%~68.0%;系统进化树分析表明,LhsUGT蛋白属于拟南芥糖基转移酶超家族的L组,故推测它可能具有催化简单酚类发生糖基化的功能;SDS-PAGE电泳显示,原核表达系统成功表达出分子量约为69 k D的LhsUGT重组蛋白,其N端含有一段17.9 k D的His标签,且在IPTG诱导5 h后达到最高表达量。本研究结果为进一步开展体外酶促反应、阐明益母草糖基转移酶的生物学功能奠定了基础。     

人溶菌酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:克隆人溶菌酶基因并进行生物信息学分析及构建其原核表达载体方法:采用RT-PCR法扩增人溶菌酶基因,运用相关生物信息学软件对其理化性质、疏/亲水性、功能结构域及蛋白质二级结构等进行分析.将该基因克隆入载体pET32a,PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定.结果:获得约400bp的人溶菌酶基因,其序列与GenBank中公布序列完全一致.生物信息学分析显示人溶菌酶基因编码130个氨基酸,分子量为14.7kDa,理论等电点为9.28,含有一个功能结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重级表达质粒构建成功.结论:该基因的克隆、生物信息学分析及原核表达质粒的构建为进一步研究其功能奠定了基础.     

梅花鹿FSH β亚基基因克隆与融合表达

以原构建的克隆载体为模板,PCR扩增梅花鹿FSHβ亚基基因,TA克隆后经双酶切插入表达载体pGEX-6P-2,阳性克隆导入E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-FSHβ融合蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定.结果显示,FSHβ PCR产物大小约410 bp,测序结果与GenBank序列一致,成功构建了重组表达载体pGEX-6P-2-FSHβ,融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量39.5 kD处,出现特异性蛋白条带,说明梅花鹿FSHβ亚基基因片段已在E.coli BL21中成功表达了FSHβ-GST融合蛋白,融合蛋白功能有待进一步分析.