通过构建三段T-DNA载体高频率获得无标记转基因大豆植株的研究

高频率获得无选择标记转基因植株有利于转基因植物的环境释放和安全性生产,农杆菌介导的共转化法是获得无标记转基因植株的方法之一。含二段T-DNA载体的共转化法已被人们成功应用,而二段以上T-DNA载体的共转化法还未见报道。基于这一目的,通过几个中间质粒构建了含有三段T-DNA的双元表达载体pNB35SVIP1,其中包含1个拷贝bar基因选择标记基因表达盒和2个拷贝VIP1目的基因表达盒。利用EHA101农杆菌菌系介导法转化大豆子叶节,经过在含3~5mg/Lglufosinate培养基上多次筛选,获得了一定数量抗性再生植株,然后对抗性再生植株进行叶片涂抹除草剂、Southernblot和Northernblot检测,共鉴定出51棵T0代转基因植株,转化频率0·83%~3·16%,二个基因的共转化频率为86·4%。在对T1代群体进行叶片涂抹除草剂检测的基础上,不抗除草剂植株进行PCR、Southernblot和Northernblot检测,共鉴定出41棵无选择标记转基因植株,无标记植株获得率为7·6%。检测结果还表明,T1代群体中22·7%的株系发生了基因丢失现象,27·3%的株系发生了bar基因沉默现象,目的基因在37·1%的无标记植株中发生了沉默现象。三段T-DNA的双元表达载体是获得无标记转基因植株的理想途径。     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T₀代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T₁代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

甜菜(Beta vulgaris L.)叶绿体转化体系建立及抗虫和抗除草剂植株的获得

为建立外源基因甜菜叶绿体转化体系,利用分子生物学方法构建了包含有编码苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因Bt cry1Ac和编码膦丝菌素乙酰转移酶基因bar的甜菜叶绿体转化载体pSKARBt/bar,以甜菜叶绿体基因组中atpB/rbcL做同源片段,以甜菜叶绿体16S启动子和终止子为调控基因,以bar基因为筛选标记基因．基因枪法转化甜菜叶柄,经筛选获得抗性转基因植株．对转基因植株进行外源基因Bt cry1Ac和bar的PCR检测、DNA印迹分析,结果表明：外源基因Bt cry1Ac和bar确已导入到甜菜叶绿体基因组中．转基因植株除草剂抗性鉴定及其离体叶片虫试鉴定结果表明：转基因植株具有较强的杀虫活性和抗除草剂特性,表达了相应的蛋白质．研究结果还表明：bar基因在植物叶绿体转化中,既可以用作抗性基因,又可用作转化体筛选的标记基因．建立了甜菜叶绿体转化体系．     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法.通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm.载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA.利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59.2%.对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19.5%的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ.这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物.研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与 bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20.0%～47.4%,低于使用双T-DNA转化的共转化频率.     

农杆菌介导抗储粮害虫转基因小麦(Triticum aestivum L.)的获得及分析

以本实验室选育的小麦优良品系的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞,经筛选获得抗卡那霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR和实时PCR检测、PCR-Southern和Southern blot验证,确定了3株独立再生植株为含有CpTI的转基因植株。农杆菌菌浓度、侵染时间及转化处理方式对小麦转化率均有明显影响。3株转基因植株正常可育并结籽,形成转基因株系。外源基因在转基因植株T₁代中的分离呈多样性,部分株系（转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ）表现出孟德尔遗传规律。抗虫试验表明,3株转基因植株T₂代籽粒对储粮害虫麦蛾具有一定的抗性,转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ及非转基因植株的T2代籽粒虫蛀率分别为19.8%、21.9%、32.9%和58.3%。转基因植株T₁代群体农艺性状调查显示,3个株系具有良好的农艺性状,为小麦的遗传改良提供了新的种质抗虫材料。     

利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记转基因植株的方法

获得无选择标记转基因植株是进行重复转基因及消除转基因植株中标记基因潜在危害性的关键。实验采用了Ac/Ds转座子系统在水稻(Oryza sativa L.)中进行无hpt选择标记的转基因。将含有目的基因bar的Ds元件和hpt标记基因置于同一个T-DNA中,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105介导将Ac-T-DNA及Ds-T-DNA分别转入到不同的水稻植株,再将单拷贝的Ac-T-DNA植株与单拷贝的Ds-T-DNA植株杂交得到同时含有Ac和Ds元件的F₁植株,F_{1自交产生F2后代,F2植株中转座后的Ds元件与T-DNA独立分离,在总共100株F2水稻植株中筛选得到2株只含有Ds元件插入而无hpt标记基因的转基因水稻植株。结果表明,利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记的转基因植株是可行的。}     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法。通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm。载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA。利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59．2％。对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19．5％的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ。这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物。研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20．0％～47．4％,低于使用双T-DNA转化的共转化频率。     

表达γ-亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定

对所获得的9株无筛选标记基因的T1代莆豆8008转基因大豆的T2代进行了分析。PCR和Southern杂交检测表明标记基因已不存在于转基因株系中,同时目的基因以纯合或者杂合状态存在于部分株系中,除草剂抗性分析也表明这些转基因株系已不再具有抗除草剂的能力。Northern杂交检测表明Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因株系中可以转录。GC分析表明其中6个转基因植株富含GLA。     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T0代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T1代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

转OvDREB2B基因陆地棉鉴定及其对水分渗透胁迫的分析

通过花粉管通道技术,以该实验室自育陆地棉品系TH₁和TH₂为材料,将诸葛菜(Orychophragmus vidaceus)抗逆转录因子OvDREB2B基因构建到植物表达载体后,导入棉花基因组,经卡那霉素筛选和分子鉴定表明目的基因已整合到棉花基因组中并表达。将T₁代转基因植株和受体对照在温室中栽培,待植株生长至四叶一心时,用不同渗透势的PEG-6000水溶液进行渗透胁迫处理,分析探讨转基因植株的抗旱效果及其抗旱机理。结果显示:当渗透势为0和0.5 MPa处理时,转基因植株和对照无明显差异;当渗透势为0.8 MPa和1.1 MPa处理时转基因植株较对照抗旱性明显提高。当渗透势为1.1 MPa处理96 h时,对照植株F_v/F_m降至0.2左右,而转基因植株仍正常生长,F_v/F_m值约为0.51,而且初始荧光（F₀）值、净光合速率（P_n）、胞间CO₂浓度（C_i）、蒸腾速率（T_r）等一系列参数转基因植株都明显优于对照,表明DREB2B基因能够提高棉花对水分胁迫的耐受性。     

Astragalar morphology of late Eocene anthropoids from the Fayum Depression (Egypt) and the origin of catarrhine primates

The phylogenetic relationships of the late Eocene anthropoids Catopithecus browni and Proteopithecus sylviae are currently a matter of debate, with opinion divided as to whether these taxa are stem or crown anthropoids. The phylogenetic position of Catopithecus is of particular interest, for, unlike the highly generalized genus Proteopithecus, this taxon shares apomorphic dental and postcranial features with more derived undoubted catarrhines that appear in the same region 1-2 Ma later. If these apomorphies are homologous and Catopithecus is a stem catarrhine, the unique combination of plesiomorphic and apomorphic features preserved in this anthropoid would have important implications for our understanding of the crown anthropoid morphotype and the pattern of morphological character transformations that occurred during the early phases of stem catarrhine evolution.Well-preserved astragali referrable to Proteopithecus, Catopithecus, and the undoubted early Oligocene stem catarrhine Aegyptopithecus have provided additional morphological evidence that allows us to further evaluate competing hypotheses of interrelationships among Eocene-Oligocene Afro-Arabian anthropoids. Qualitative observations and multivariate morphometric analyses reveal that the astragalar morphology of Proteopithecus is very similar to that of early Oligocene parapithecids and living and extinct small-bodied platyrrhines, and strengthens the hypothesis that the morphological pattern shared by these taxa is primitive within crown Anthropoidea. In contrast, Catopithecus departs markedly from the predicted crown anthropoid astragalar morphotype and shares a number of apomorphic features (e.g., deep cotylar fossa, laterally projecting fibular facet, trochlear asymmetry, mediolaterally wide astragalar head) with Aegyptopithecus and Miocene-Recent catarrhines. The evidence from the astragalus complements other independent data from the dentition, humerus and femur of Catopithecus that support this taxon's stem catarrhine status, and we continue to maintain that oligopithecines are stem catarrhines that constitute the sister group of a clade containing propliopithecines and Miocene-Recent catarrhines.     

中国兰科二新记录种

兰科植物资源调查是掌握地区兰科本底资料的基础,对研究兰科植物的地理分布和资源多样性具有重要意义。该文报道了分别产自中国西藏自治区墨脱县和巴宜区的石豆兰属(Bulbophyllum Thou.)中国分布新记录种——尼泊尔大苞兰(B.raskotii J.J.Verm.,Schuit.&de Vogel)和曲唇兰属[Panisea(Lindl.)Steud.]中国分布新记录种——林芝曲唇兰(P.panchaseensis Subedi)。此二新记录种均生长在海拔约2000 m的常绿阔叶林中的树干或岩壁上。此外,还提供了二新记录种的形态特征描述和彩色图片等信息,并附有国产曲唇兰属的分种检索表。该研究结果扩充了我国兰科植物的记录,为我国兰科植物多样性和保护研究提供了新资料。     

中国异极衣科地衣二新记录种

该文综合运用形态学、解剖学和化学等方法对山东大型地衣进行分类研究,发现了两个中国新记录种,即德氏蜂窝衣(Heppia despreauxii)和多孢小极衣(Lichinella myriospora)。德氏蜂窝衣隶属于蜂窝衣属(Heppia),生于光线充足且裸露的土壤上,主要识别特征为下皮层缺失、子实层IKI+蓝色;多孢小极衣隶属于小极衣属(Lichinella),生于干燥的钙质岩石上,主要识别特征为其子实层IKI+酒红色变为蓝色。该文对这两个中国新记录种进行了详细描述,与近似物种进行了对比讨论,并且提供了其地衣体、子囊盘及其解剖特征图片。同时,该文还补充报道了白棋盘蜂窝衣(Heppia solorinoides)的有性繁殖结构特征和数据。蜂窝衣属和小极衣属均为山东新记录属。以上研究结果为中国异极衣科(Lichinaceae)地衣研究提供基础资料。     

藏药多刺绿绒蒿种子萌发特性研究

多刺绿绒蒿(Meconopsis horridula)为罂粟科绿绒蒿属一年生草本植物,是一种极具观赏价值和药用价值的高山植物,目前处于濒危状态,因此研究多刺绿绒蒿种子的萌发特性对其种子育苗及人工栽培具有重要意义。为了提高多刺绿绒蒿的种子发芽率,该研究以多刺绿绒蒿的种子为材料,分析了不同消毒剂、浸种时间、温度和外源植物激素对种子萌发特性的影响。结果表明:(1)最适消毒方法为75%乙醇1 min+3%H2O25 min,最适浸种时间为24 h,最适温度和光照条件为20℃/10℃(光照12 h/黑暗12 h),用无菌水浸种后的种子发芽率为49.67%。(2) GA_3100～600 mg·L~(-1)和NAA 5～30 mg·L~(-1)可以提高种子的发芽率、发芽势和发芽指数,缩短发芽启动时间和发芽持续时间,对种子的萌发有促进作用。(3) 6-BA 5 mg·L~(-1)和10 mg·L~(-1)对种子的萌发有一定的促进作用,但不显著,6-BA浓度≥15 mg·L~(-1)则抑制种子的萌发。(4)用GA3500 mg·L~(-1)浸种后的种子发芽指标最好,发芽率、发芽势和发芽指数分别为69.67%、33.00%、4.51,种子的发芽起始时间和发芽持续时间分别为10.67 d、11.67 d。     

scabrous Modifies Epithelial Cell Adhesion and Extends the Range of Lateral Signalling during Development of the Spaced Bristle Pattern in Drosophila

The role of scabrous (sca) in the evenly spaced bristle pattern of Drosophila is explored. Loss-of-function of sca results in development of an excess of bristles. Segregation of alternately spaced bristle precursors and epidermal cells from a group of equipotential cells relies on lateral inhibition mediated by Notch and Delta (Dl). In this process, presumptive bristle precursors inhibit the neural fate of neighbouring cells, causing them to adopt the epidermal fate. We show that Dl, a membrane-bound ligand for Notch, can inhibit adjacent cells, in direct contact with the precursor, in the absence of Sca. In contrast, inhibition of cells not adjacent to the precursor requires, in addition, Sca, a secreted molecule with a fibrinogen-related domain. Over-expression of Sca in a wild-type background, leads to increased spacing between bristles, suggesting that the range of signalling has been increased. scabrous acts nonautonomously, and we present evidence that, during bristle precursor segregation, Sca is required to maintain the normal adhesive properties of epithelial cells. The possible effects of such changes on the range of signalling are discussed. We also show that the sensory organ precursors extend numerous fine cytoplasmic extensions bearing Dl molecules, and speculate on a possible role for these structures during signalling.     

荨麻科三新种

该文描述了荨麻科三新种:(1)自中国重庆市发现的荨麻科荨麻属一新种,城口荨麻。此种与异株荨麻有亲缘关系,区别特征为此种的茎被少数刺毛,叶片多为心形,雄、雌花序均不分枝,瘦果在中央稍凹陷。(2)自中国广西发现的荨麻科赤车属一新种,来宾赤车。此种与特产云南东南部的富宁赤车相近缘,与后者的区别在于本种茎的毛开展或向上弯曲,叶片长椭圆形,基部斜楔形,雌花具3~4枚花被片,其中1~2枚较大花被片在背面顶端具一长筒状突起。(3)自缅甸北部发现的荨麻科楼梯草属一新种,克钦楼梯草。此种在体态上与骤尖楼梯草甚为相似,与后者的区别在于本种的每一茎节具正常叶和一退化叶,托叶狭披针状条形和无脉,雌总苞苞片无角状突起,雌小苞片较大,呈楔状长圆形,雌花具一小花被片,以及雌蕊具一宽倒卵球形柱头。     

Stratigraphy, artefact industries and hominid associations for Sterkfontein, member 5

A revised stratigraphy for the early hominid site of Sterkfontein (Gauteng Province, South Africa) reveals a complex distribution of infills in the main excavation area between 2.8 and 1.4 m.y.a, as well as deposits dating to the mid to late Pleistocene. New research now shows that the Member 4 australopithecine breccia (2.8-2.6 Ma) extends further west than was previously thought, while a late phase of Member 4 is recognized in a southern area. The artefact-bearing breccias were defined sedimentologically as Member 5, but one supposed part of these younger breccias, the StW 53 infill, lacks in situ stone tools, although it does appear to post-date 2.6 Ma when artefacts first appear in the archaeological record. The StW 53 hominid, previously referred to Homo habilis, is here argued to be Australopithecus. The first artefact-bearing breccia of Member 5 is the Oldowan Infill, estimated at 2-1.7 Ma. It occupies a restricted distribution in Member 5 east and contains an expedient, flake-based tool industry associated with a few fossils of Paranthropos robustus. An enlarged cave opening subsequently admitted one or more Early Acheulean infills associated in Member 5 west with Homo ergaster. The artefacts attest to a larger site accumulation between ca. 1.7 and 1.4 Ma, with more intensive use of quartzite over quartz and a subtle but important shift to large flakes and heavier-duty tools. The available information on palaeoenvironments is summarized, showing an overall change from tropical to sub-tropical gallery forest, forest fringe and woodland conditions in Member 4 to more open woodland and grassland habitats in the later units, but with suggestions of a wet localized topography in the Paranthropus -bearing Oldowan Infill.     

表皮葡萄球菌SarA对atlE、lipA和zinC基因表达调控的研究

表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermids) 是一种条件致病菌，SarA(Staphylococcal accessory regulator A)是该菌中一个全局性调控因子，它控制着细胞中许多与毒性相关的基因表达. 报道了SarA在转录水平直接调控atlE、lipA和zinC基因的表达. RT-PCR和lacZ报告基因的分析结果显示，在表皮葡萄球菌ATCC35984中，SarA对atlE (自溶酶基因) 表达起负调控作用，而对lipA (脂肪酶基因) 和zinC (膜相关锌金属蛋白酶基因) 的表达则有正调控作用. 生物信息学分析表明，SarA控制atlE，lipA和zinC 3种基因表达可能是通过与被调控基因上游的特定DNA序列的结合来实现的，该DNA结合区保守并富含AT碱基. 根据已报道的金黄色葡萄球菌中SarA的结合位点序列，利用Omiga软件分析并推测了SarA结合atlE，lipA和zinC的可能区域. 基于SarA是一种多功能的毒素相关调控因子，结果提示，SarA能调控众多因子，可以作为防治表皮葡萄球菌感染的一个药物筛选靶点.     

中国星文衣属地衣型真菌的分类研究

星文衣属(Sarcographa)隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、茶渍纲(Lecanoromycetes)、厚顶盘目(Ostropales)、文字衣科(Graphidaceae),该属地衣体为壳状,子囊盘为放射分支状,多具子座,子囊含8孢子,子囊孢子褐色,横隔透镜型或亚砖壁型,主要分布于热带亚热带地区。该文通过形态学、解剖学、化学与分子生物学等方法进行该属分类学研究,共报道了中国该属9种,其中变黄星文衣[Sarcographa flavescens(Dal-Forno & Eliasaro)L. W. Chen & Z. F. Jia]为新组合(≡ Phaeographis flavescens Dal-Forno & Eliasaro); 曲线星文衣[Sarcographa labyrinthica (Ach.)Müll. Arg. ]为中国大陆新记录种。同时,该文对近似属拟星文衣属(Sarcographina)的1物种——异孢拟星文衣[Sarcographina heterospora(Nyl.)Z. F. Jia & Lücking]进行了描述,并提供了10个物种的特征提要及与其近似种的区别特征,并编制了分种检索表。该研究为中国地衣型真菌生物多样性研究提供了基础资料。     

OsIMA1增强水稻对镉逆境的适应性

铁(Fe)是植物生长发育所必需的营养元素而镉(Cd)是对植物有害的元素且对植物Fe和Cd的吸收存在拮抗作用。OsIMA是一类正调控水稻Fe吸收的一类小肽,其过表达可以促进Fe的积累。为探究OsIMA是否参与水稻对Cd胁迫的适应性,该研究以水稻为研究材料,利用荧光定量PCR分析了OsIMA基因的表达水平,通过遗传转化和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了OsIMA1过表达植物和ima1突变体植物,评估了OsIMA1过表达和突变体植物在Cd逆境条件下的株高,并利用电联耦合等离子体质谱法测量了根和地上部的Fe和Cd含量。结果表明:(1)Cd处理后,OsIMA1和OsIMA2的转录水平上调。(2)OsIMA1过表达植物比野生型植物对Cd胁迫更耐受。(3)ima1功能缺失突变体比野生型植物对Cd胁迫更敏感。(4)OsIMA1过表达植株根系的Cd含量较高,而ima1突变体植株地上部的Cd含量较高。综上所述,OsIMA1通过限制Cd从根向地上部的转运以增强水稻对Cd逆境的适应能力,该研究结果为定向培育耐Cd作物提供了理论参考。