孤雌胚胎干细胞基因印迹及X染色体失活状态初步研究

目的:研究孤雌胚胎干细胞(phESC)与受精卵来源胚胎干细胞(hESC)在印迹基因表达、X染色体失活等方面的异同。方法:运用实时荧光相对定量PCR、甲基化特异性PCR和免疫荧光染色等方法检测phESC与hESC在父系印迹基因IGF2R,母系印迹基因SNRPN,IGF2相对表达量及X染色体失活状态。结果:①母系印迹基因SNRPN,IGF2在phESC细胞中不表达,而父系印迹基因IGF2R表达量则相对于hESC有近2倍的上调;②XIST基因在第35代phESC细胞中没有表达,意味着早期的phESC没有进行X染色体失活,而到了第55代,XIST基因开始表达并随着分化时间的延长表达量逐渐上调;③XIST启动子甲基化状态及组蛋白H3赖氨酸27三甲基化免疫荧光染色阳性证实phESC在长期培养后启动了X染色体失活。结论:phESC的X染色体失活状态在培养过程中存在不稳定的情况,建议对phESC进行更深入的表观遗传稳定性研究,以确保这种细胞未来安全、高效的应用。     

IGF2基因组印迹系统人重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带IGF2印迹系统的腺病毒载体,并验证其在肿瘤细胞及正常细胞中的功效,为IGF2印迹在肿瘤靶向治疗中的应用提供理论基础.方法:将人源的IGF2印迹系统启动子H19、增强子enhancer及甲基化区域CTCF克隆至穿梭质粒pDC-312中构建IGF2基因印迹系统,从pDC-315-EGFP质粒中扩增出EGFP片段插入到构建好的IGF2印迹系统中,然后与腺病毒骨架Ad5通过脂质体Lipofectamine2000介导共转染HEK293细胞,包装成有感染能力的腺病毒Ad-H19-CTCF-enlmncer-EGFP,命名为Ad-EGFP;构建好的腺病毒分别感染IGF2基因印记保持的细胞MCF-7和GES-1及IGF2基因印迹丢失的细胞HRT-18,荧光显微镜下观察EGFP在三种细胞中表达的差异.结果:转染腺病毒载体的HEK293细胞表达EGFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,EGFP在HRT-18细胞中有大量表达,在MCF-7和GES-1细胞中不表达或仅有少量表达.结论:成功构建了携带IGF2基因印迹系统的腺病毒载体,证明其在IGF2基因印迹丢失的肿瘤细胞中特异性的表达,在正常细胞及IGF2基因印迹保持细胞中不表达,为IGF2基因印迹系统应用于肿瘤细胞的靶向治疗提供了理论基础.     

单细胞测序分析人类胚胎干细胞神经分化的分子机制

目的探讨人类胚胎干细胞 (ESCs)分化为神经细胞的关键性靶基因及分子机制,为临床靶向治疗神经康复患者提供分子理论依据。方法基于GEO数据平台芯片,采用单细胞测序方法 (scRNA-seq),利用R语言从多分子维度(单细胞差异基因、蛋白互作网络和基因通路等)分析人类ESCs分化过程中的关键Marker基因并利用质控和数据过滤、PCA、TSNE分析、细胞轨迹分析、GO富集分析、KEGG富集分析、KEGG通路分析等论证Marker基因调控人类ESCs分化作用机制。结果 GO功能富集分析结果为:Marker基因在胚层分化、细胞外基质和信号转导中作用显著;Marker基因互作网络及KEGG通路显示了特征性纤维连接蛋白1(FN1)、同源域蛋白 (NANOG)、生长因子受体结合蛋白2 (GRB2)为关键基因;KEGG通路分析显示:(1)FN1在调控细胞外基质通路中作用显著;(2)NANOG、GRB2在调控干细胞多能性信号通路作用显著。结论 FN1可能通过调控细胞外基质通路介导人类ESCs基质环境的变化;NANOG、GRB2上调在干细胞多能性信号通路中高表达介导人类ESCs定向分化为神经组织。     

成年核移植山羊生长相关基因的表达分析

体细胞核移植过程有可能影响克隆动物生长相关基因尤其是印迹基因的表达水平。本研究运用同源引物 PCR 扩增、RACE 技术并结合同源克隆策略, 克隆了 7 个山羊生长相关基因包括 3 个印迹基因(H19、IGF2 和 IGF2R)和 4 个非印迹基因(IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR)的完全 CDS 或者部分 cDNA 序列, 经生物信息学技术确认后, 用荧光实时定量 PCR 对 8只成年克隆山羊中这些基因的表达水平进行分析, 结果表明 3 个印迹基因中 IGF2R 基因表达水平极显著高于对照组的自然繁殖山羊(P<0.01), 而 H19 和 IGF2 的表达则没有很大区别; 4 个非印迹基因中只有 IGF1R 的表达水平极显著高于对照组(P<0.01), IGF1、GHR 和 GHSR 的表达与对照组相似。表明即使在表型正常的成年克隆动物也存在一定的表观遗传异常。通过对获得完全 CDS 和 3′UTR 的 IGF2 基因经过生物信息学分析表明, 山羊 IGF2 基因包含一个 540 bp 的开放阅读框 (ORF)编码 179 个氨基酸。IGF2 基因 cDNA 序列和氨基酸序列以及其它基因部分序列比较分析表明, 山羊所有这些基因与绵羊的同源性要高于同牛的同源性。     

肿瘤抑制基因ARHI的研究进展

ARHI是Ras超家族中第一个被报道的肿瘤抑制基因,定位于人染色体lp31,属小GTP结合蛋白,与Ras拥有相似的GTP／GDP结构域,却具有抑癌作用。ARHI是母源性印迹、父源性表达,可参与细胞周期调控和信号通路转导,从而负向调节细胞生长。在正常人类多种组织中都存在ARHI基因的表达,但在肿瘤组织中其表达却下调。ARHI的表达异常可能与印迹基因的杂合性丢失,DNA甲基化和染色体乙酰化修饰等转录水平的调节失常有关。     

从异常核型人胚胎干细胞中筛选不同X染色体失活状态的亚系

目的:从异常核型人胚胎干细胞系中分离两种不同X染色体失活(XCI)状态的细胞,建立亚系,并进行对其XCI状态特征和多能性标记进行鉴定。方法:G显带鉴定人胚胎干细胞系ch HESC-3早晚期代数细胞的核型,H3K27me3免疫荧光染色鉴定早晚期ch HESC-3表观遗传差异,RT-PCR检测早晚期ch HESC-3中XIST基因的表达。利用单细胞克隆的培养分选亚系,H3K27me3、RNA polymeraseⅡ以及DAPI三种标记的共染后每种表观标记各选两株进行RT-PCR,检测两种亚系中XIST基因的表达。并对这四株细胞进行干细胞标记鉴定。结果:G显带结果证明早期ch HESC-3为正常核型,晚期代数核型为异常核型,牵涉到8条染色体的复杂结构变异。H3K27me3免疫荧光染色证明异常核型ch HESC-3中有部分细胞出现了H3K27me3凝集点,而正常核型细胞中未发现。正常核型细胞(ch HESC-3N)没有XIST基因表达,异常核型细胞(ch HESC-3C)中有表达。在RNA polymeraseⅡ着色缺口中发现H3K27me3凝集点的细胞亚株XIST基因表达阳性,polymeraseⅡ着色缺口中未发现H3K27me3凝集点的细胞亚株XIST基因表达阴性,XIST阳性和阴性细胞各选两株进行多能性标记免疫荧光染色均为阳性。结论:成功从异常核型人胚胎干细胞系中分离两种不同XCI状态的细胞并建立亚系,两种表观类型的亚系均保持多能性标记并能在长期培养中保持各自特性。     

印记基因与肿瘤的发生

印记基因是仅表达等位基因中的亲本一方,而亲本另一方基因沉默的表观遗传学现象.印记基因中双亲等位基因携带特异性表观遗传标记,通过不同的机制(例如,lncRNA模型、绝缘子模型)使相应的等位基因沉默或表达.印记基因的正常表达使得个体正常发育,而印记基因的异常表达则与肿瘤发生有关.主要概述印记基因的结构、表达机制及IGF2/...