丁酸钠对CHO-EPO工程细胞株rhEPO表达量的影响

以稳定整合有ｐＥＤＥＰＯ的ＣＨＯＥＰＯ工程细胞株为研究对象,在无血清条件下,系统观察了０５、１０、２５和５０ｍｍｏｌ／Ｌ４个浓度的丁酸钠作用于该细胞株的情况,结果表明：丁酸钠对ＣＨＯＥＰＯ工程细胞的生长有明显的抑制作用;影响ＣＨＯＥＰＯ工程细胞ＥＰＯ表达,浓度１０ｍｍｏｌ／Ｌ可提高ＥＰＯ表达量２５倍左右,并可持续较长的一段时间;延缓ＣＨＯＥＰＯ工程细胞在无血清培养时的细胞脱落;提高ＣＨＯＥＰＯ工程细胞ＥＰＯｍＲＮＡ水平     

用填充床生物反应器大规模培养表达重组人红细胞生成素的细胞株

目的：用填充床生物反应器培养表达重组人红细胞生成素的工程细胞株C2W,使其达到高密度高表达。方法：将工程细胞株用含5％小牛血清的DF培养基复苏放大培养,当细胞达到10^9时,接种到5L生物反应器中,先用含血清培养基生长培养,再换为无血清培养基表达培养;在整个培养过程中,采用流加方式连续培养,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定细胞的表达水平。结果：接种量约为10^9细胞;细胞罐培养57d,包括含血清生长培养6d,无血清表达培养51d：重组人红细胞生成素平均表达水平为5636U／mL,最高时达7880U／mL;收集无血清培养上清476L,平均每日灌流量8.3L,最高时达12L／日。结论：在适当的条件下,利用填充床生物反应器可使工程细胞株的培养达到长时间、高表达。     

酿酒酵母培养基中主要因素对海藻糖积累的影响

在对实验室保藏菌种Saccharomyces cerevisiae HY01优化前的摇瓶发酵观察的基础上,采用单因子与响应曲面相结合的实验设计方法研究了酿酒酵母培养基中的初始葡萄糖浓度、无机氮源硫酸铵浓度、酵母浸出粉浓度、碳源与无饥氮源的交互作用以及无机盐和微量元素浓度对海藻糖积累的影响。实验证明碳氮源交互作用明显,并得到了以上各因素的最优值,即初始葡萄糖浓度为20g／L,(NH4)2SO4浓度为4．5g／L,酵母浸出粉浓度为5g／L,微量元素溶液5．0ml／L;硫酸镁0．3g／L;磷酸氢二钠3．67g／L;磷酸二氢钾0．76g／L时,酿酒酵母中海藻糖的干重含量可以达到14．74％,比优化前海藻糖的干重含量12．24％提高了20．41％．     

H_2O_2对人心房肌细胞I_(Kur)和I_(Ca,L)的浓度依赖性双向影响

本实验旨在观察活性氧（reactive oxygen species,ROS）对人心房肌细胞电生理活动特性的影响。取有心房颤动（atrial fibrillation,AF）和非AF心脏手术患者（各12例）右心耳组织,用酶消化法得到单个心房肌细胞。两组细胞（每组n=75）分别随机分为三个亚组：对照组（n=12）、H2O2组（0．1、0．2、0．5、0．75、1、2、5、10μmol／LH2O2,每个浓度n=7）和维生素C（ROS清除30）组（1gmol／L维生素C,n=7）。实验采用全细胞膜片钳方法记录电生理活动。与非AF对照组相比,AF对照组超快速延迟整流钾电流（ultrarapid delayed rectifier K^＋current,KKw）和L-型钙电流（L—type calcium current,ICaL）电流密度（pA／pF）均明显降低（6．27±0．67VS3．77±0．56,P〈0．05;6．31±0．60 vs 3．34±0．32,P〈0．05）,动作电位时程（action potential duration,APD）（ms）也明显缩短（405±13 vs 354±12,P〈0．05）。在非AF和AF组中,H2O2对心房肌细胞,IKw和,ICa,L的电流密度均有浓度依赖性双向影响——高抑低促。非AF组中,H2O2浓度为0．2gmol／L时有最大增强作用,而0．75Bmol／L为分界浓度,人于0．75Bmol／L时,随H2O2浓度增加IKw和,ICa,L的电流密度逐渐降低;在另一方面,0．2、1、2、5和10μmol／LH2O2孵育的心房肌细胞APD90与同组对照组相比均明显缩短（P〈0．05）,而与AF对照组相比无明显差异。在AF组中,H2O2的最大效应浓度为0．5Bmol／L,而1gmol／L为分界浓度。维生素C可以逆转H2O2的上述作用,但单独给予维生素C并不改变通道特性。H2O2诱导正常人心房肌细胞发生电生理活动特性改变与AF时心肌电重构（atrial electrical remodeling,AER）相似,显示ROS可能诱发AF;同时,H2O2又能加重AF时AER,对AF有维持作用。以上结果提示ROS清除剂可能对预防和治疗AF有重要意义。     

丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响

抗p185erbB-2基因工程抗体是一种有潜力的抗肿瘤药物。以稳定表达抗p185嵌合抗体的重组工程CHO细胞株为对象,分别用不同浓度丁酸钠(0~2mmol/L)和丙酸钠(0~10mmol/L)对处在对数生长期的细胞进行处理,在连续5d的培养过程中,每隔24h取样测活细胞数量,并用ELISA检测上清中抗体含量,5d后结束培养用FACS检测细胞周期。同时还用丁酸钠和丙酸钠处理长至90%满度的细胞,然后每隔12h取样一次检测葡萄糖和乳酸的含量。结果表明丁酸钠和丙酸钠可以有效地提高嵌合抗体在工程CHO细胞中的表达,表达量最高时可达58.3~59.6mg/L,是对照组的1.5倍。同时抑制细胞生长和阻断细胞周期在G1期,并且可减少培养过程中葡萄糖的消耗和乳酸的生成。和丁酸钠相比,丙酸钠具有较小的细胞毒性,是一种有潜力的替代品。     

乳酸堆积和二氯乙酸钠对肝癌细胞凋亡及bax、bcl-2表达和caspase-3活性的影响

目的：探讨乳酸堆积和二氯乙酸钠（OCA）对肝癌细胞（HepG2）凋亡和bax、bcl-2表达及caspase-3活性的影响。方法：通过体外培养HepG2,建立稳定的体外培养模型,配制成终浓度分别为0mmol／L、1．0mmol／L、2．0mmol／L、4．0mmol／L、8．0mmol／L的乳酸培养液以及在不同浓度乳酸组中加入终浓度为10^-3mmol／LDCA培养液与HepG2共同培养,其中以0mmol／L乳酸组为对照组。采用MTT法检测乳酸对HepG2的抑制率,流式细胞仪检测乳酸和DCA对HepG2的凋亡百分率,用Real-time PCR法测定bax及bcl-2mRNA的表达,用免疫荧光法检测caspase-3的活性。结果：乳酸对HepG2的IC50值为13．6mol／L,与对照组比较,随着乳酸浓度的增加,HepG2凋亡率增加,baxmRNA表达升高,bcl-2mRNA的表达降低,caspase-3活性增加,其中1．0mmol／L乳酸组与对照组比较（P〉0．05）,2．0mmol／L,4．0mmol／L和8．0mmol／L乳酸组与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。加入DCA后．HepG2凋亡减少,2．0mmol／L乳酸＋DCA组、4．0mmol／L乳酸＋DCA组、8．0mmol／L乳酸＋DCA组与同浓度的乳酸组比较,baxmRNA表达减少（P〈0．05）,bcl-2mRNA表达增加（P〈0．05）,caspase-3活性减低（P〈0．05）。结论：乳酸可诱导HepG2凋亡,且随着乳酸浓度的增高,HepG2的凋亡率增加,其机制可能是通过对bcl-2及baxmRNA表达的改变以及激活caspase-3活性而实现,DCA可以降低HepG2凋亡,对乳酸堆积造成的HepG2凋亡有抑制作用。     

安菜的组织培养与植株再生

通过对安菜组织培养的培养基种类、激素配比、碳源的研究,得出适于安菜侧芽分化生长的最佳培养基为MS＋6-BA0．5mg／L＋NAA0．2mg／L。诱导愈伤组织以2,4-D浓度在0．2mg／L～0．5mg／L之间最佳。碳源以蔗糖,浓度3％最佳。以IBA0．5mg／L～1．5mg／L浓度诱导生根效果最好。     

LXRs激动剂T0901317对成人骨骼肌细胞FAT／CD36基因mRNA表达的影响

目的：探讨肝核受体LXRs激动剂T0901317对正常人骨骼肌细胞中FAT／CD36基因mRNA表达的影响。方法：将原代培养的5例成人骨骼肌细胞分为用肝核受体LXRs激动剂39901317（1μmol／L）作用组、T0901317（0．5μmol／L）作用组和阴性对照组,作用24h后采用sYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法检测各组成人骨骼肌细胞FAT／CD36基因mRNA表达水平,并用2^-^△△Ct方法进行比较分析。结果：①以浓度为1μmol／L的T0901317作用组和0．5μmol／L的T090131作用组和对照组样本的均数进行方差分析,差别有统计学意义（P〈0．01）。②浓度为1μmol／L的T0901317作用组和0．5μmol／L的T090131作用组成人骨骼肌细胞中FAT／CD36基因的mRNA表达分别是对照组的3．03倍和2．91倍。结论：肝核受体LXRs激动剂T0901317能够提高成人骨骼肌细胞中FAT／CD36基因mRNA的表达水平,提示30901317有加快骨骼肌细胞内脂肪酸的堆积作用,推测IXRs激动剂T0901317可能会增加糖尿病患者骨骼肌胰岛素抵抗的风险。     

高羊茅组织培养再生体系及GUS基因瞬间表达研究

以成熟种子为外值体,对高羊茅纰织培养和植株再生体系进行了优化,分析了不同浓度2．4-D、6-BA和激动素对高羊茅愈伤组织诱导和愈伤组织分化成苗的影响．结果表明：9．0mg／L 2．4-L)对愈伤组织的诱导效果最佳．0．2mg／L激动素是愈伤组织分化成苗的最适浓度．二者的诱导率和分化率分别达到68．08%和45．83％。在愈伤组织继代培养基中附加1．0mg／L 2．4-D、0．5mg／L 6-BA和1．25mg／L CuSO4;有利于胚性愈伤组织的形成,可以明显促进愈伤组织分化。同时．采用基因枪法将GUS基因导入高羊茅愈伤组织中,通过组织化学染色检测到了GUS瞬间表达活性;并对影响CUS基因瞬间表达的因素进行了分析．以期为提高基因枪法遗传转化效率提供参考。     

高浓度糖发酵制备乙醇

以树干毕赤酵母为发酵菌株,混合糖（木糖、葡萄糖）为发酵底物,通过培养基和培养条件的改变来确定树干毕赤酵母高糖浓度发酵时所需的条件。研究结果表明：在24h发酵周期内初始木糖质量浓度为63．0g／L较适宜;在36h发酵周期内初始木糖质量浓度为72．0g/L较适宜。24h发酵周期内,在36．0g／L木糖中添加的葡萄糖质量浓度以54．0g/L为最佳,发酵结束乙醇质量浓度达32．9g／L;36h发酵周期内,添加的葡萄糖质量浓度以72．0g／L为最佳,发酵结束乙醇质量浓度为36．9g／L。以（NH4）2SO4为N源时较适合戊糖发酵制备乙醇,（NH2）2SO4的最佳质量浓度为1．1g／L。发酵前8h摇床转速为90r／min,后16h为150r／min,乙醇质量浓度较高,可达17．5g/L。     

培养基成分对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响

以Bs＋0．5mg／L NAA＋0．5mg／L BA为基本培养基,研究了B5培养基中8种主要无机盐浓度对杜仲愈伤组织生长及绿原酸和总黄酮两种次生代谢产物含量的影响。结果表明：在1000～5000mg／L范围内增加培养基中KNO3的含量有利于愈伤组织生长,B5培养基中当KNO3的浓度达到2／3时,绿原酸和总黄酮含量及产量最高;(NH4)2SO4以4／3原浓度时对愈伤组织生长量、总黄酮含量及产量最高,对绿原酸的含量则是其为原浓度的1／3时最高;MgSO4以2／3浓度对生长量及1／3浓度对绿原酸、总黄酮积累最高;NaH2PO4、CaCl2和MnSO4以原浓度的愈伤组织生长和次生代谢产物合成最好;ZnSO4和FeSO4的原浓度愈伤组织的生长量最大,而1／3浓度的绿原酸和总黄酮含量最高。     

荧光素酶基因luc在大肠杆菌中表达条件优化

对重组荧光素酶大肠杆菌菌株M15／pQE30-luc进行了表达条件的优化研究。单因素结果表明：在初始pH值7．0,装液量为20％,2％的接种量,终浓度为0．5mmol／L的IPTG,添加10—30mmol／L的Mg^2＋,摇床转速为200r／min,37℃诱导3．5h酶的表达量最高。正交试验结果表明：初始pH值为7．0,添加40mmol／LMg^2=,接种量2％,装液量为20％时表达量最高,比酶活达1．63×10^8RFU／mg蛋白。     

Marc-145细胞无血清培养液组分的优化筛选

目的：对Marc-145细胞无血清培养液组分及浓度进行优化筛选。方法：采用Plackett-Burman设计和中心组合旋转设计对不同的营养成分进行优化筛选。结果：经Plackett-Burman设计,利用20组实验对14种不同营养成分进行考察,发现孕酮、抗氧化试剂、乙醇胺、维生素B12、维生素B12和脂肪酸复合剂对Marc-145细胞无血清悬浮生长的比生长速率有显著影响;针对该6种因素进行中心组合旋转实验设计,利用53组实验筛选出它们的最优使用浓度分别为孕酮5．5mg／L、抗氧化试剂250μL/L、乙醇胺2．1mL／L、维生素B12 2．86mg／L、维生素B6 44μg/L和脂肪酸复合剂215μL/L。结论：经2种实验设计方法优化,确定了Marc-145细胞无血清培养液组分及最适浓度,为无血清悬浮培养Marc-145细胞及增殖猪繁殖及呼吸综合征病毒提供了实验基础。     

硝酸镧对霍霍巴多芽苗生长的促进作用及植株再生

在增殖培养基(改良MS 2mg／L6-BA 0．5mg／LG3)中添加1～3．5mg／L硝酸镧,对霍霍巴试管苗生长有显著促进作用,2．5mg／L硝酸镧对多芽分化有极显著的促进;在生根培养基(改良1/2MS 3mg／LIBA 1．5mg／LNAA)中,1～2mg／L的La(NO3)3对根的分化有显著的促进作用,生根率提高,最佳浓度为2．0mg／L。过高的浓度对试管苗生长有一定抑制。试验表明,不同器官对硝酸镧的敏感程度不同。取2cm高以上的霍霍巴试管苗,用25mg／L IBA或NAA处理30min,扦插于沙基质中。保持室温20～30℃。50d后揭去覆膜,保持光强3000 lx,相对湿度85％以上。正常管理条件下成活率达75％。     

费尔干猪毛菜愈伤组织的诱导、分化及植株再生体系的建立

探讨了植物生长调节剂、外植体等因子对费尔干猪毛菜（Salsola fergartica Drob．）愈伤组织诱导、分化与植株再生的影响。结果表明：2,4-D与6-BA组合使用时,在一定浓度范围内均有愈伤组织产生,最佳的诱导培养基为MS＋2,4-D2．0mg／L＋6-BA0．2mg／L,下胚轴为诱导愈伤组织的最佳材料;愈伤组织继代培养较好的培养基为MS＋NAA0．1mg／L＋6-BA1．0mg／L;愈伤组织不定芽分化培养基为MS＋6-BA0．5mg／L＋NAA0．05mg／L;根分化的培养基为1／2MS＋IBA0．2mg／L,且生根率可达72％。以带柄子叶为外植体,诱导丛生芽的最佳分化培养基为MS＋6-BA1．0mg／L,再生频率可达90．74％。     

慢性高原病血清血管生成因子的变化

目的：慢性高原病（CMS）以红细胞过度增生、肺动脉高压和低氧血症为特征,但对该病的发病机制尚未完全阐明。本研究以CMS患者和高原世居藏族健康人为研究对象,探讨血管生成相关因子在CMS发生、发展过程中的作用。方法：以海拔4380m地区的CMS患者35例（CMS组）和高原世居藏族健康人13名（世居组）为研究对象,西宁地区（海拔2260m）世居健康人17名为对照组,采用固相双抗体夹心ELISA方法测定血清碱性成纤维生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和血小板源生长因子（PDGF）浓度,同时测定血红蛋白（Hb）浓度、红细胞比积（Hct）和动脉血氧饱和度（SaO2）。结果：血清bFGF浓度CMS组（107．26±7．86）ng／L与世居组（37．01±9．16）ng／L和对照组（40．58±5．34）ng／L比较,有显著差异（P〈0．01）;血清PDGF浓度CMS组（630．18±9．89）ng／L与世居组（292．16±6．88）ng／L和对照组（287．68±8．33）ng／L比较,有显著差异（P〈0．01）;血清VEGF浓度CMS组（543．74±6．76）ng／L与世居组（125．51±7．26）ng／L和对照组（76．26±4．60）ng／L比较,有显著差异（P〈0．01）,世居组与对照组比较,也有显著差异（P〈0．01）。CMS患者血红蛋白（Hb）浓度与其血清bFGF、PDGF和VEGF水平均呈正相关（P〈0．01）。血清bFGF、PDGF、VEGF之间亦呈正相关（P〈0．01）。结论：CMS患者血清bFGF、PDGF和VEGF水平显著高于居住在同一个海拔高度的健康人和居住在西宁地区的健康人,提示CMS患者血管生成因子过度表达,血管新生可能是CMS病理生理的重要方面;血清VEGF水平高原健康人高于西宁地区健康人,提示VEGF高表达可能是高原健康人对高原环境适应机制的组成部分;CMS患者Hb浓度与其血清bFGF、PDGF和VEGF水平均呈正相关,提示在CMS患者中,bFGF、PDGF和VEGF可能与红细胞生成有?     

水杨酸提高香蕉幼苗的抗冷性与H2O2代谢有关

探讨了水杨酸(salicylic acid,SA)提高香蕉幼苗抗冷性的可能机理。在常温下(30／22℃)用不同浓度(0—3．5mmol／L)的SA水溶液喷洒叶片1d,置于7℃低温下冷胁迫3d,随后于常温下恢复2d后测定电解质泄漏率,结果表明：SA0．3～0．9mmol／L能显著提高香蕉幼苗的抗冷性,以0．5mmol／L效果最佳。若把冷胁迫温度降到5℃,SA0．5mmol／L预处理可显著减少幼苗叶片的萎蔫面积。但当SA浓度高于1．5mmol／L时,恢复期间的电解质泄漏甚至高于对照(蒸馏水处理),表明它们加剧了冷害。SA提高香蕉幼苗的抗冷性可能需要H2O2的参与：1)SA0．5mmol／L常温处理诱导了H2O2的积累和活性氧造成的膜脂过氧化——三氯乙酸反应物质(TBARS)的增加,这可能与H2O2的清除酶——过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的受抑和H2O2的产生酶—超氧化物歧化酶(SOD)活性几乎不受影响有关;2)外源H2O2(1．5—2．5mmoL／L)也能显著降低低温胁迫期间的电解质泄漏,表明也能提高抗冷性;3)而用H2O2的捕捉剂——二甲基硫脲(DMTU)可明显抑制SA诱导的抗冷性;4)在低温胁迫与恢复期间,SA预处理明显提高了CAT和APX的活性,抑制了H2O2与TBARS的快速上升。     

分泌重组抗体的CHO细胞体外培养条件的优化

目的：对生物反应器细胞培养时培养时培养基组成进行优化。方法：以稳定转染了抗CD3人源化抗体的CHO细胞为模型,以无血清培养基经生物反应器高密度细胞培养后分子量小于50kDR的超滤液为基础培养基,在细胞培养板中考察添加氨基酸、丁酸钠、柠檬酸铁等多种成分对细胞生长状态和蛋白表达量的影响、结果：2mmol/L丁酸钠可以有效地诱导蛋白的表达,丁酸钠和柠檬酸铁对于促蛋白表达有协同作用,适量添加培养过程中消耗较快的氨基酸可提高细胞数和蛋白的表达量。结论：利用所述方法可快速优化培养基成分,显著提高生物反应器中细胞的蛋白表达量。     

盾叶薯蓣组织培养技术的优化

以盾叶薯蓣的根状茎、茎段、叶柄、幼叶为材料,进行愈伤组织诱导、分化及再生植株形成的研究。结果表明：盾叶薯蓣不同外植体均能诱导出愈伤组织,其中茎段愈伤组织的诱导率最高;不同激素配比的培养基对愈伤组织的形成有很大的影响：以LS为基本培养基,2,4-D浓度为4．0mg／L、6-BA浓度为1．0mg／L的激素配比诱导率最高,达62．5％;以改良MS为基本培养基,2,4-D浓度为2．0mg／L、6-BA浓度为0．5mg／L的激素配比诱导率最高,达71．4％。筛选到优化的分化培养基为改良MS附加2．0mg／L的6-BA和0．5mg／L的Vc,且能直接诱导出根,并形成完整植株。     

激素种类及其浓度对矮牵牛试管苗增殖及生根率的影响

以MS培养基为基本培养基,以矮牵牛试管苗为材料,并用不同浓度的细胞分裂素6-BA、KT、Ad分别与生长素NAA（0．10mg／L）进行配比试验,并用一定浓度的细胞分裂素6-BA、KT、Ad两两分别组合配比试验,探讨了不同浓度的细胞分裂素对矮牵牛试管苗的影响,以及两类生长素IBA和NAA对生根的影响。结果表明,适合于矮牵牛试管苗增殖的培养基有：（1）MS＋1．60mg／L 6-BA＋0．10mg／LNAA;（2）MS＋0．80mg／L 6-BA＋1．60mg／LKT＋0．10mg／L NAA;（3）MS＋0．80mg／L 6-BA＋0．20mg／LAd＋0．10mg／LNAA;（4）MS＋1．60mg／L KT＋0．20mg／L Ad＋0．10mg／L NAA。适合于矮牵牛试管苗生根的培养基有（1）1／2MS;（2）1／ZMS＋0．20mg／L1BA;（3）1／2MS＋0．20mg／LNAA。