DLC-1 基因在MCF-7 人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的:探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果:DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论:抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。     

5-氮胞苷对转化后间充质干细胞增殖、衰老及p16~(INK4a)表达的影响

目的观察5-氮胞苷对体外自发转化的间充质干细胞增殖、衰老及p16INK4a基因表达的影响。方法采用细胞计数、SA-β-gal染色、Western Blot和重硫酸盐修饰后测序(BSP)检测体外自发转化的大鼠间充质干细胞在不同浓度5-氮胞苷处理后增殖、衰老、p16INK4a表达及p16INK4a基因启动子区CpG岛甲基化水平的变化。结果细胞计数显示5-氮胞苷可剂量依赖性地抑制转化后间充质干细胞的增殖,但增殖受抑的细胞SA-β-gal染色仍呈阴性。BSP及Western Blot分析显示:转化后间充质干细胞p16INK4a基因启动子区CpG岛呈现高水平甲基化(87.30±2.39%)。5-氮胞苷可在一定程度上降低该基因的甲基化,使p16INK4a表达得以部分恢复;但即使是高浓度高达100μmol/L,5-氮胞苷也只能使p16INK4a基因甲基化降低到46.20±1.65%。结论 5-氮胞苷可显著抑制转化后间充质干细胞的增殖,但并不能促使这些细胞重新恢复衰老状态;其原因是5-氮胞苷单独作用不足以完全解除p16INK4a基因启动子区DNA的高甲基化。     

DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的：探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2＇-脱氧胞嘧啶（5-Aza-CdR）处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果：DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论：抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。     

DNA甲基化抑制鼻咽癌细胞系膜联蛋白A1基因表达

为了研究不同分化程度和转移潜能鼻咽癌(NPC)细胞系膜联蛋白A1(ANXA1)mRNA和蛋白质表达情况及其与基因甲基化的关系．培养NPC细胞系CNE1、CNE2、5-8F、6-10B和永生化非癌性人鼻咽黏膜上皮细胞NP69细胞用于实验,用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测ANXA1基因甲基化状态,同时利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测ANXA1基因的mRNA表达水平．然后用不同浓度的5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2dC)对NPC细胞进行去甲基化处理,MSP和RT-PCR方法检测处理组和对照组细胞ANXA1基因甲基化状况和mRNA表达水平,并用Western-blotting方法检测ANXA1基因蛋白质表达水平．结果发现,NP69细胞ANXA1基因无甲基化,4株NPC细胞系ANXA1基因都存在不同程度的甲基化,甲基化程度与细胞的分化程度和转移潜能相关．NPC细胞ANXA1基因mRNA表达水平降低,低于NP69细胞,其降低的程度与基因的甲基化程度相关．5-aza-2dC能够剂量依赖性地引起ANXA1基因去甲基化,经去甲基化处理后,NPC细胞系ANXA1基因的mRNA和蛋白质的表达水平相应提高．研究证明,NPC细胞系ANXA1基因的mRNA和蛋白质表达水平出现下调,甲基化是导致表达下调的主要原因,5-aza-2dC去甲基化处理能够恢复ANXA1基因的表达水平．     

采用蛋白质组学技术筛选鼻咽癌细胞的甲基化沉默基因

为筛选鼻咽癌的甲基化沉默基因,采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2-dC)处理与未处理鼻咽癌细胞5-8F的蛋白质,PDquest图像分析软件识别差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.然后采用Western blotting和RT-PCR检测差异蛋白质nm23-H1在药物处理与未处理5.8F细胞中的表达水平,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测nm23-H1基因在药物处理与未处理5-8F细胞中的甲基化水平.建立了5-aza-2-dC处理与未处理5.8F细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了49个差异表达的蛋白质点,鉴定了33个差异表达的蛋白质,其中包括rim23.H1在内的15个蛋白质在5-aza-2-dC处理后的5-8F细胞中表达上调,而18个蛋白质表达下调.Western blotting和RT-PCR结果显示,nm23-H1在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后表达上调,MS-PCR结果显示,在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后nm23-H1基因甲基化水平下降,结果证实,nm23-H1基因是5-8F细胞中的甲基化沉默基因.15个5-aza.2-dC处理后表达上调的基因可能是5-8F细胞中的甲基化沉默基因,为筛选鼻咽癌甲基化失活基因提供了科学依据.     

非霍奇金淋巴瘤p73基因甲基化状态及去甲基化再表达的研究

目的:探讨p73基因甲基化状态在非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgk in's lymphomas,NHL)患者中的检测意义以及去甲基化干预对p73基因再表达的效果.方法:检测26例非霍奇金淋巴瘤标本中P73基因的表达以及甲基化状态;用不同剂量(4,8μmol/L)去甲基化因子5氮胞苷(5-A za)诱导P 73基因甲基化的淋巴瘤细胞,RT-PCR和MSP-PCR方法测定p73基因的表达以及甲基化状态.结果:p73基因在非霍奇金淋巴瘤中表达显著下降,26例标本中,13例呈阴性(50%),6例表达下降;p73基因外显子1甲基化的发生率为100%;4μmol/L去甲基化因子5氮胞苷(5-A za)在体外即可诱导的淋巴瘤细胞p 73基因去甲基化再表达,8μmol/L 5-Aza效果较4μmol/L更为明显.结论:p 73基因甲基化与非霍奇金淋巴瘤的发病密切相关,去甲基化干预可能为一种可行的临床治疗手段.     

DNA甲基化对牛Igf-2r表达的影响及其在克隆牛发育中的作用

目前认为克隆效率低的主要原因是供体核的不完全重编程导致发育过程中一些重要的基因异常表达。运用DNA甲基化转移酶抑制剂5′-脱氧胞苷(5′-azacytidine,5′-aza)处理MDBK细胞(牛肾上皮细胞),并通过实时荧光定量PCR方法对Igf-2r基因的表达进行了定量分析;在此基础上,应用亚硫酸盐甲基化测序法检测正常牛及克隆牛脑、肺、心、肝组织Igf-2r印迹调控区DMR2(DNA differentially methylated region,DMR)及非印迹调控区3′-UTR(3′-untranslated region,UTR)的DNA甲基化水平。研究发现,5′-aza处理MDBK细胞后,Igf-2r基因的表达上调。正常牛各组织中Igf-2r DMR2区的DNA甲基化程度差异较大,3′-UTR区较稳定;与正常牛相比,克隆牛DMR2区的甲基化程度变化较大,3′-UTR区无显著性变化。结果表明,DNA甲基化修饰影响Igf-2r基因的表达。正常牛不同组织中Igf-2r基因DMR2区的DNA甲基化程度不同,提示Igf-2r基因的印迹调控方式在不同组织中可能不同。克隆牛发育过程中,调控Igf-2r基因印迹的DMR2表观结构被明显改变,而非印迹调控区3′-UTR则无明显变化,提示Igf-2r基因印迹调控区被破坏,很可能是导致克隆牛发育异常的一个重要原因。     

痰液脱落细胞中p16 基因和RASSF1A 基因甲基化与周边型非小细胞 肺癌关系的研究

目的:探讨p16基因和RASSF1A基因甲基化与肺癌发生发展的关系和应用于诊断的意义。方法:采用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)检测120例周边型非小细胞肺癌患者癌组织、痰液脱落细胞和120例非肺癌人群的痰液脱落细胞中p16基因和RASSF1A基因甲基化,分析它们与临床特征的关系以及非肺癌人群与肿瘤患者之间的差异。结果:(1)120例周边型非小细胞肺癌组织中,p16基因甲基化率46.7%(56例),RASSF1A基因甲基化率53.3%(64例)。P16和RASSF1A基因甲基化与吸烟程度、肿瘤大小和临床分期正相关(P<0.05)。(2)肺癌痰液脱落细胞中有28例p16基因出现甲基化(23.3%),20例RASSF1A基因出现甲基化(16.7%),其中32例至少存在一个基因的甲基化(26.7%);66例重度吸烟者中只有4例痰液脱落细胞出现p16基因甲基化(6%),4例出现RASSF1A基因甲基化(6%);54例非重度吸烟正常人中仅有2例出现p16基因甲基化(3.7%),RASSF1A基因无甲基化。(3)液基痰细胞病理学检查与痰脱落细胞p16和RASSF1a基因甲基化检测结合起来可有效提高诊断的灵敏度(P<0.05)。结论:烟草可能具有潜在的诱导抑癌基因p16和RASSF1A发生甲基化的作用;p16和RASSF1A基因甲基化可能参与肺癌的生长过程。痰脱落细胞p16和RASSF1a基因甲基化检测结合液基痰细胞病理学诊断,可提高非小细胞肺癌诊断的灵敏度。     

DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对AID基因修饰的牛胎儿成纤维细胞的作用

以转AID基因细胞和AID基因敲减细胞为研究对象,旨在探讨5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对其细胞形态、细胞周期、相关基因表达及其基因启动子区甲基化状态变化的影响。此外,还分析了整体基因组去甲基化和位点特异性去甲基化之间存在的差别,探讨提高体细胞重编程效率的方法及其作用机制。通过Real-time PCR、BSP(Bisulfite Sequencing PCR)、Western blotting和流式细胞术等技术分析了5-Aza-CdR对转AID基因细胞和AID基因敲减细胞的影响。结果表明,5-Aza-CdR对转AID基因细胞的影响存在明显的剂量效应,浓度为4μmol/L时,具有明显的细胞毒性,大量细胞死亡(P0.05)。当使用处理浓度为1-3μmol/L时,细胞形态发生改变,细胞增殖被抑制。核型分析显示,3μmol/L浓度组处理就可以导致转AID基因细胞出现异常核型。使用1μmol/L浓度处理细胞,明显增加了表达报告基因细胞的数量,细胞AID和SOX2的表达量都有所提高,并且SOX2基因启动子区的DNA甲基化水平也有所下降。5-Aza-CdR处理AID基因敲减细胞后,OCT4和SOX2的表达量较对照组明显升高,而NANOG却没有发生变化。结果显示,5-Aza-CdR处理转AID基因细胞可改变细胞形态、细胞周期和报告基因的表达,5-Aza-CdR处理后基因组整体去甲基化和AID基因的位点特异性去甲基化协同作用于体细胞重编程。     

5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10基因启动子的去甲基化作用

探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine,5-Aza-dC)对人急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞的增殖抑制作用及对RASSF10基因启动子甲基化状态的影响。体外培养Molt-4细胞,采用不同浓度5-Aza-dC对Molt-4细胞进行处理。采用MTT法检测细胞增殖抑制率,RT-PCR法检测RASSF10 mRNA表达的变化,Westernblot检测RASSF10蛋白表达的变化,COBRA实验检测RASSF10甲基化水平。一定浓度的5-Aza-dC作用Molt-4细胞后,细胞增殖抑制率显著升高,且具有时间和剂量依赖性。对照组Molt-4细胞未检出RASSF10 mRNA及蛋白表达,而5-Aza-dC处理组检出RASSF10基因重新表达。COBRA实验结果提示对照组Molt-4细胞中存在启动子高甲基化的现象,而5-Aza-dC处理组Molt-4细胞的RASSF10基因被部分去甲基化。甲基化抑制剂5-Aza-dC可通过对RASSF10基因的去甲基化作用,重新恢复RASSF10的表达,从而抑制Molt-4细胞的增殖。     

小鼠对天花粉蛋白体内及体外免疫应答的基本特点

C 57 BL/6 J小鼠在应用弗氏全佐剂或铝矾为佐剂结合天花粉蛋白免疫后都能引起抗原特异的IgE类抗体的反应以及其它Ig类抗体的反应;IgE的滴度和总的抗天花粉蛋白抗体的滴度的动态变化趋势基本一致,但并不完全同步。IgE类上升得较IgG等类抗体为慢,但上升的速度要快。脾和肠系膜淋巴结细胞分泌抗体的动态变化也和血清并不完全一致。天花粉蛋白在一定浓度下能抑制小鼠T淋巴细胞在体外的抗原特异的增殖反应和ConA反应。这抑制并不限于增殖过程的启动。补充外源性的IL-2也不能消除这抑制作用。天花粉蛋白加热变性后丧失了对小鼠淋巴细胞的毒性,并能引起经未变性天花粉蛋白体内致敏的小鼠的T淋巴细胞在体外的明显增殖。应用微量的天花粉蛋白为抗原,以及少量的无凝集素的conA条件培液等能在体外诱发致敏的B淋巴细胞产生二次抗体应答。     

对果蝇S期细胞内组蛋白基因的原位定量分析

利用微型计算机控制的荧光显微镜、荧光强度检测仪和图像记录装置并结合荧光原位杂交法对果蝇细胞核内组蛋白基因的复制时期进行了研究,从而建立了一套细胞内直接定量分析的方法。根据果蝇胚胎原代培养细胞核的DAPI染色强度确定处于S期的细胞。用杂交信号的荧光强度与细胞核荧光强度的相关关系来反映组蛋白基因的复制时期。结果表明果蝇组蛋白基因的复制是在DNA合成早期进行的。这套方法至少可直接在细胞上对每套基因组100以上拷贝数的熏复DNA序列进行有效的定量分析。     

内分泌细胞中溶酶体对激素分泌调节的作用

本实验用外源性雄激素引起垂体促性腺激素细胞和睾丸间质细胞分泌抑制,对这两种细胞中的溶酶体及分泌吞噬和自体吞噬活动进行了超微结构形态观察和半定量分析。实验中应用了CMP酶细胞化学技术和免疫胶体金技术。研究结果显示,在分泌受抑制状态下,垂体促性腺激素细胞中溶酶体增多,分泌吞噬活动加强;与此同时,睾丸间质细胞也表现溶酶体增多、自体吞噬活动加强。这些结果不仅再次证明在分泌蛋白质激素细胞中溶酶体以分泌吞噬的方式参与了激素分泌调节,更重要的是初步证明在分泌类固醇激素细胞的分泌调节中,也有溶酶体的参与,其形式是自体吞噬作用。细胞通过自体吞噬作用得以在短时间内清除一部分合成激素的细胞器和其中的激素,这可能是分泌类固醇激素的细胞及时有效地调整激素分泌量的一项重要机制,与分泌蛋白质激素细胞的分泌吞噬有着相同的意义。     

arg-13可能参与鸟氨酸在粗糙脉孢霉线粒体的过膜转运(英文)

arg-13为精氨酸代谢途径里的一个渗露型突变。经研究发展了该突变的严格选择方法。该法省略了基本培养基的氮源而加上相似浓度的鸟氨酸与赖氨酸。此法在严紧山梨糖/葡萄糖条件下能强烈抑制arg-13突变株生长,但在斑点试验条件下允许arg-13突变株生长。由于鸟氨酸是通过线粒体合成和由细胞质至线粒体的过膜转运而积累,我们构建了arg-4,arg-13双突变株,其中arg-4阻断了线粒体鸟氨酸合成。在斑点试验条件下,arg-4,arg-13双突变株能利用鸟氨酸作为唯一氮源与精氨酸合成前体,但受赖氨酸与刀豆氨酸强烈抑制。具正常鸟氨酸转运功能的arg-4单突变株在鸟氨酸基本培养基的生长只受微弱的赖氨酸抑制。已有报道arg-13为嘧啶合成代谢途径里pyr-3(CPSACT~ )突变的部分抑制基因,序列分析表明arg-13编码一线粒体转运酶。本文数据提示arg-13在线粒体鸟氨酸过膜转运过程中起主要作用。arg-13突变株仍携带一定的线粒体鸟氨酸转运功能并受碱性氨基酸赖氨酸、刀豆氨酸抑制,可能为另一线粒体碱性氨基酸转运酶介导。     

烟草合子与二胞原胚在离体培养中的发育

用酶解-研磨法分离烟草与大叶烟草受精后的胚囊,继之以显微解剖分离合子与二胞原胚。将3—5个合子或二胞原胚置于微室的琼脂糖小滴中,以预先培养3—4天、分裂1—2次的烟草、大叶烟草或黄花烟草叶肉原生质体饲养。培养基为KM8p与其它附加成分。在25℃与黑暗下静置培养。培养3—4天,约60%合子完成第一次分裂。多数行不等分裂产生大小两个细胞。12天后形成少数原胚或多细胞团。二胞原胚培养亦分裂为多细胞原胚。研究了合子分离方法、合子发育时期、饲养细胞种类与培养天数等因素对合子离体发育的影响。     

家兔胚泡ICM在体外培养系统中的行为

一、用显微外科方法从兔早期胚泡分离来的ICM在所用的体外培养系统中的行为,因ICM的生长状态而不同。呈带状生长的ICM从近端向远处延伸,而细胞的分化则从远端逐渐向近端进行,它具有明显的极性。细胞的分化秩序井然,层次分明。因此呈带状生长的ICM适用于进行细胞分化和细胞谱系的研究。二、呈团块状生长的ICM,没有明显的极性,细胞分化开始于团块的外表面,逐渐向中央进行。细胞分化开始稍晚一些,速度也较慢,这种生长状态的ICM适用于分离胚胎干细胞。三、兔子胚外内胚层从ICM分化来,它经历了二次分化的过程。第一次发生于培养后第三天(相当于交配后第七天),形成第一胚外内胚层-胚外体壁内胚层,它向远处迁移,远离原始外胚层。培养后四天(相当于交配后第八天),形成第二种胚外内胚层-胚外脏壁内胚层,它尾随体壁内胚层向远处迁移,其后缘的部分细胞向原始外胚层附近的滋胚层下面侵润。四、胚外体壁内胚层和脏壁内胚层的细胞是由少数决定了的和离开ICM的细胞分化和增殖而来。五、文中讨论了早期胚胎细胞分化的谱系问题。     

斑马鱼整胚原位杂交和显微注射转基因技术的建立(简报)

随着人类基因组框架图的完成,解读大量基因的功能和表达调控成为亟待解决的问题。因此通过模式生物从个体水平、细胞水平和分子水平研究基因功能及其表达调控日益成为一个重要的研究领域。斑马鱼(Brachydanio rerio)是近年来崛起的一种模式生物。它的显著优势在于:个体小,便于大批量饲养;产卵量大,胚胎透明,易于观察和操作;体外发育,发育迅速,2—3天即可完成主要器官的建成;可以方便的进行大规模的诱变和突变型筛选等研究。它已成为脊椎动物胚胎发育遗传学和基因功能研究中理想的模式生物。整胚原位杂交技术是     

兰州北山三种蜥蜴春季食性分析

兰州地区密点麻蜥、丽斑麻蜥和草原沙蜥的春季食物均为动物食物。无论在栖息地重叠地区还是非重叠地区,三种蜥蜴的食物种类在种间均无显著差异（Ｆ＝０．８６１,ｄｆＴ＝２,ｄｆＥ＝３６,Ｐ〉０．０５）。种内不同性别和年龄食性无显著差异。     

NO可能作为Ca^2＋的下游信号介导乙烯诱导的蚕豆气孔关闭

以蚕豆（Vicia faba L．）为材料,利用药理学实验,结合激光共聚焦显微技术和分光光度法．探讨Ca^2＋和一氧化氮（nitric oxide,NO）在乙烯（ethylene,Eth）调控气孔运动信号转导中的作用。结果表明．光下乙烯利（0．004％,0．04％,0．4％）可诱导蚕豆叶片气孔关闭,且具有时间和剂量效应：NO清除剂cPTIO、硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）抑制剂NaN3及胞外Ca^2＋螯合剂EGTA可部分逆转乙烯诱导的气孔关闭;乙烯能够明显增加气孔保卫细胞NO水平;提高蚕豆叶片NO含量和NR活性．并且NO的含量变化与NR活性的变化趋势基本一致;NR抑制剂NaN3可抑制乙烯诱导的气孔保卫细胞和叶片NO含量的增加;清除胞外Ca^2＋可减弱乙烯对NO含量和NR活性的诱导效应。说明Ca^2＋和NO均参与乙烯诱导的蚕豆气孔关闭,且NO（主要由NR途径合成）可能位于Ca^2＋下游参与调控这一信号转导过程。     

核体(Karyoplast,细胞去核产物)合成RNA的能力

近十年来由于细胞松弛素B(Cyto-chalasin B,以下简称CB)引起细胞群体去核的方法的建立和不断完善,为细胞核与质的相互作用关系研究提供了一个新的实验手段。为详尽地了解CB处理细胞所获的核体和胞质体的特性,以便利用其进行核质关系方面的研究,我们利用显微与电镜放射自显影技术对CB处理所获各类核体作了RNA代谢的研究。核体(Karyoplast)是外面包被着细胞质膜并带有不同量胞质的细胞核,核体本身就是研究细胞核与质相互关系的好材料。通过对核体的研究,可从中探讨大分