K88抗原基因的克隆与表达I．K88抗原工程菌的研制

由产肠毒素大肠杆菌引起的仔猪黄痢病是在世界各地广泛流行的一种仔猪急性腹泻病。已经表明K88伞毛抗原在这类致病菌定居在仔猪小肠上起着重要的作用。质粒Ptk82是从国内流行的仔猪黄痢病致病菌——肠杆菌青3菌株中分离出来的。它是一个分子量约为50×10‘道尔顿的非接台型质粒,并含有K88ac抗原基因的决定子。在电子显微镜下可以观察到带有Ptk82的大肠杆菌C₆₀₀的细胞表面存在有K88伞毛。此质粒DNA经限制性内切酶HindI酶解后,使DNA片段连接到同样经内切酶酶解过的的Pbr322 DNA上,得到了一株能产生K88抗原的转化子,经鉴定后,此重组质粒定名为Ptk63。Ptk63dna经Ec0R I都分酶解,然后重新连接起来,得到分子量较小但仍台K88基因的重组质粒Ptk90。免疫学分析的结果表明,带有重组质粒Ptk90的大肠杆菌C₆₀₀所产生的伞毛抗原的性质,与带有Ptk82质粒的大肠杆菌C₆₀₀菌株或大肠杆菌青3菌株所产生的伞毛是相同的,大肠杆菌C₆₀₀／pTK82和大肠杆菌C600／pTK90菌株都是不带肠毒素基因的菌株,初步试验表明用它们制成的菌苗可以有效地预防仔猪黄痢病的发生。     

大肠杆菌K99菌毛fan操纵子的克隆、表达及活性

[目的]在体外克隆和表达猪产肠毒素大肠杆菌(ETEC) K99菌毛操纵子fan结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性.[方法]以猪源分离的表达K99菌毛ETEC C83907株制取模板,成功PCR扩增出编码K99菌毛的fan操纵子,约5.7 kb.将fan操纵子克隆人表达质粒载体pBR322,筛选出含正确阳性质粒的重组菌.进一步将上述的重组质粒DNA转化至不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000株,同时将空载体pBR322质粒转化入SE5000构建阴性对照菌株.[结果]该重组菌能与鼠抗K99菌毛单克隆抗体发生明显的凝集反应,与新生仔猪小肠上皮细胞刷状缘BBV分子有强烈凝集反应.电镜观察到上述重组菌表面大量表达K99菌毛,用热抽提法提纯其表达的K99菌毛,并经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,可以得到分子量约为18.5kDa的主要蛋白条带.纯化菌毛免疫小鼠后制备出高效价的鼠抗血清,能与携带K99菌毛的C83907、C83914、C83260野生株发生强烈的凝集反应,而与携带其他菌毛的ETEC不反应.玻板凝集试验和Western blot结果表明:体外表达的K99菌毛具有和野生K99菌毛相同的抗原性.用表达K99菌毛的重组菌进行HeLa细胞体外黏附试验和黏附抑制实验,结果表明:重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附性,而且用重组菌毛制备的鼠抗血清能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对细胞系的黏附结合.[讨论]本研究为进一步研究K99菌毛生物学作用建立了良好的实验平台.     

乳杆菌对致病性大肠杆菌K88和O138体外存活抑制的动力学研究

研究了一株分离自断奶仔猪小肠黏膜的肠乳杆菌L1（Lactobacillus intestinalis）体外发酵特性,及其代谢产物对病原性大肠杆菌Escherichia coli K88和O138存活的影响。体外发酵结果表明：发酵12h后,L,菌液pH值迅速降至3．90,并产生大量乳酸,为104．08mmol／L。L1菌株代谢产物对K88和O138体外生长抑制的动力学研究表明：L1菌株代谢产物对K88和O138存活具有很强的抑制作用;L1菌株发酵液与含相同浓度乳酸的自制培养液比较结果表明：乳酸在L1菌株代谢物对K88和O138存活抑制中发挥了主要作用：K88和O138对pH4．5的MRS培养液具有一定的耐受能力。     

带有K88与K99两种伞毛抗原基因的重组质粒的构建

产肠毒素大肠杆菌能引起仔猪、犊牛、羔羊等新生幼畜发生急性腹泻,K88与K99是这类产肠毒素大肠杆菌所产生的两种在免疫性质上不同的伞毛抗原。质粒pTK8899—6和pTK8899—8是由来自K99质粒DNA的4．5×10⁶道尔顿大小的BamHI片段与带有K88伞毛抗原基因的质粒pTK90DNA重组而构建成的;带有pTK889g一6或pTK8899—8的大肠杆菌c600菌株均能同时产生K88与K99两种伞毛抗原。限制性酶切图谱的研究表明,pTK88g9—6与pTK8899—8 DNA的分子量均为11．85×10⁶道尔顿,但这两种重组DNA中所带Kg9伞毛抗原基因的片段连接在载体DNA上的方向彼此相反,带有pTK8899—6或pTK8899—8的大肠杆菌c600菌株在产生K88或K99伞毛抗原的能力上没有明显的差别。带有K88与K99两种伞毛抗原基因重组质粒的大肠杆菌菌株有可能用作预防仔猪,犊牛和羔羊急性腹泻的菌苗。     

乳杆菌对致病性大肠杆菌K88和O138体外存活抑制的动力学研究

研究了一株分离自断奶仔猪小肠黏膜的肠乳杆菌L1(Lactobacillus intestinalis)体外发酵特性,及其代谢产物对病原性大肠杆菌Escherichia coli K88和O138存活的影响.体外发酵结果表明:发酵12 h后,L1菌液pH值迅速降至3.90,并产生大量乳酸,为104.08 mmol/L.L1菌株代谢产物对K88和O138体外生长抑制的动力学研究表明:L1菌株代谢产物对K88和O138存活具有很强的抑制作用;L1菌株发酵液与含相同浓度乳酸的自制培养液比较结果表明:乳酸在L1菌株代谢物对K88和O138存活抑制中发挥了主要作用;K88和O138对pH 4.5的MRS培养液具有一定的耐受能力.     

标准大肠杆菌B41的一株突变体K99产生的粘着抗原(F41)有关的体内和体外粘附力

<正>K99株由一种质粒决定的,它有象发丝状的抗原结构,存在小牛、羊羔和偶然是仔猪的肠道致病性大肠杆菌的表面上。在细菌对宿主的肠粘膜的吸附作用方面这种抗原是重要的,在一分离株上它的存在可被作为一种有用的肠道致病性的指征。经吸收过的K99因子血清通常应用于检测抗原,因为K99在18℃生长的微生物上不能表达,有抗生长于37℃的标准株活菌的抗血清常常用生长于18℃的同源菌株进行吸收。     

产肠毒素性大肠杆菌K88菌毛装配

K88菌毛介导产肠毒索性大肠杆菌在小肠上皮细胞的粘附,是引起新生仔猪腹泻的主要致病因子之一.菌毛的合成与装配是由fae操纵子调控的,fae操纵子包含10个基,faeA-fae J,其中有些基因表达菌毛装配所需的各种结构蛋白、分子伴侣和调控因子.菌毛的装配过程是由fae操纵子调控,通过分子伴侣,锚定蛋白的相互协同作用完成,组装成结构蛋白的多聚体.继阐明K88菌毛装配调控机理之后,K88菌毛在非毒素源性大肠杆菌及其它原核生物中装配也取得成功,同时菌毛结构蛋白在真核生物中组装也取得了很大进展.     

幼畜腹泻双价基因工程疫苗(K88、K99)抗原蛋白的生产工艺

本文报道了在幼畜腹泻双价基因工程菌(K88、K99)的高密度发酵和抗原蛋白基因过量表达的研究基础上生产抗原蛋白疫苗的工艺。高密度发酵的工程菌(K88、K99)发酵液经65℃保温处理、离心除去菌体,清液部分含发酵液中抗原量的80％,加聚乙二醇(至最终浓度为7％)沉淀可回收全部抗原蛋白,加消毒的生理盐水溶解及稀释后分装冻干制成抗原蛋白疫苗。疫苗的组成份主要有分子量为52、36、22、18kd的蛋白。此法制备的双价疫苗不经甲醛处理,保持了抗原蛋白的天然空间结构,因此用其免疫怀孕的母猪、分娩后母猪乳汁中含有较高效价的抗体、能中和肠毒素大肠杆苗,有效地保护了仔猪黄痢的危害。     

用原生质体转化技术构建含有大肠杆菌K88acLT-B和0149抗原基因的菌株

毒素源性大肠杆菌(ETEC）是可以引起幼畜腹泻 的致病菌,此类菌具有对宿主特异的起粘附定居作用 的菌毛,还有直接引起腹泻的肠毒素,目前已发现对热 敏感的肠毒素LT和对热稳定的肠毒素ST。在临床 中经常分离到的带有K88菌毛抗原的致病菌主要是 引起新生仔猪的急性腹泻,其发病、流行都比较快,是 新生仔猪死亡的一个重要原因,给畜牧业造成极大的 危害〔‘’。本实验室经过几年的研究,已经构建了具有 K88ac菌毛抗原和LT肠毒素B亚单位抗原的无毒菌 株,并已作为疫苗菌株应用于畜牧业中。但是考虑到 自然界野生型菌株生命力强,还具有多种不同的。抗 原,所以发展口服免疫的活菌苗有必要考虑上述因素。 这样当孕猪口服免疫活菌苗后,即可以产生更好的免 疫应答,刺激细胞和体液免疫系统,产生保护性伉体, 通过初乳给新生仔猪提供保护。本实验利用我们构建 的带有K88ac抗原和LT=B抗原基因的PMM085质 粒（待发表于生物工程学报,1987,和一株带有0149 抗原和K88ac抗原的野生型菌株,在用常规的Ca'十 处理受体菌转化未获成功后,又利用PEG诱导的原 生质体转化方法,把质粒PMM085转化到上述带有 014,抗原基因的野生型菌中,得到了带有K88ac,LT-B 和014,抗原基因的无毒菌株。可望此菌株能更好地 模仿自然感染致病菌株,在免疫中产生更好的预Vi作 用。     

禽病原性大肠杆菌1型菌毛的分离与鉴定

以旋涡混合法使禽病原性大肠杆菌分离株566、1794和TK3菌毛脱落,经硫酸铵沉淀、透析后进行蔗糖密度梯度离心,收集密度为110至115g/cm3的蛋白带,经SDSPAGE测定,3株菌菌毛蛋白的分子量分别在175、170和170kD;提纯菌毛保留了甘露糖敏感性凝集豚鼠红细胞的能力,证明它们为1型菌毛;从1794株提取的1型菌毛免疫BALB/C小鼠产生的高免血清在Western blot中与3个菌株的相应菌毛蛋白均呈阳性反应。上述结果表明,受检的3株禽病原性大肠杆菌均表达了1型菌毛,其分子量在175～170kD之间,3个菌株的1型菌毛间具有较强的抗原相关性。     

大肠杆菌K88ac菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性初步研究

目的：在体外克隆和表达猪肠产毒性大肠杆菌（ETEC）K88ae菌毛操纵子,触结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性。方法：利用长PCR技术以猪ETECK88ae株C83902基因组DNA为模板扩增编码K88菌毛操纵子触基因,克隆入表达质粒载体pBR322,构建和筛选重组质粒pBR322-fae,转化至不含任何菌毛的大肠杆菌EP株;电镜观察重组菌表面菌毛表达情况;用热抽提法提纯表达的重组菌毛;用纯化菌毛免疫小鼠制备高效价抗血清;用SDS-PAGE和Western blot检测重组菌毛的抗原性,用细胞黏附和黏附抑制试验检测其生物学活性。结果和结论：在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88ae菌毛,该重组菌与兔抗K88ae菌毛单因子阳性血清、鼠抗K88ac菌毛单克隆抗体均产生凝集反应;纯化菌毛经SDS-PAGE,结构单位菌毛呈单一的相对分子质量约26×10^3的蛋白条带;纯化菌毛免疫小鼠后可制备出高效价的鼠抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明体外表达的K88ae菌毛具有与K88ae野生菌毛相同的抗原性;猪小肠上皮细胞系黏附和黏附抑制实验结果表明重组EP菌和野生菌株一样具有较强的黏附猪小肠上皮细胞系的能力,而且提纯重组菌毛制备出的鼠抗血清能有效抑制上述重组菌或野生菌株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。     

预防幼畜腹泻双价工程菌苗株的构建及表达

Bam HI部分酶切表达K99抗原的重组质粒pMGK99,将其与相同酶切的含有F41菌毛基因的片段相连接,构建了载有两种抗原基因的质粒pMG611。通过转化大肠杆菌K12HB101、RRI和c600,得到HBlOl(pMG611)、RRl(pMG611)和C600(pMG611)菌株。经甘露糖抗性血凝试验、玻片凝集试验和western blot分析证明K99和F4l两种菌毛抗原在每株菌中均获表达。sDs—PAGE结果表明所表达K99和F4l菌毛亚单位的分子量与其各自野生株所产生的相同,分别是17200和29800Da,ELIsA测定HB101(pMG611)菌株表达K99和K41菌毛抗原的水平与相应出发菌株相同,而高于其野生株。本实验对质粒pMG611表达K99和F41菌毛抗原的影响因素也进行了研究。     

大肠杆菌血清学分型的研究

本文报告1963--1973年间从我国15个地区收集的大肠杆菌3767株血清学分型研究结果。除少量菌株分自动物外,其余均分自婴幼儿腹泻患者粪便。共分离到82个。抗原组和43个H抗原。与流行性婴儿腹泻有关的肠遒致病性大肠杆菌O…菌株占45.66％,O128为9．51％,O114为9．10％,为国内最常见的0抗原组。O111: K11(B4)：H-9 O11：K58(B4)：H29O114：K90(B):H_三个血清型为国内最常见的血清型,共占48．7％。从腹泻患儿分离的普通大肠杆菌中,O1-一O11菌株占半数以上。     

大肠杆菌K88菌毛蛋白发酵工艺的初步研究

采用液体培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基和强化营养肉汤培养基对大肠杆菌K88进行发酵培养,采用不同摇瓶培养时间和不同pH值的培养基观察发酵结果,研究菌体和菌毛生产量的相关性,并通过紫外分光光度计UV751于600nm处测量菌体OD值以对菌种发酵情况进行检测.热激分离菌体和菌毛蛋白,(NH4)2SO4盐析分离纯化K88菌毛蛋白并用分光光度计于280nm处测定其OD值.透析后经SDSP-AGE检测菌毛蛋白纯度.根据实验结果优化发酵培养条件,确定菌种的最佳发酵工艺,以收获最多的K88菌毛蛋白.经过实验研究,最终确定了大肠杆菌K88在pH值为6.5、转速为250r/min的条件下发酵18个h,菌体和菌毛生产量均达到高峰,同时得出菌毛蛋白和菌体成正相关.     

大肠杆菌新的O抗原组

1963一1964年在北京、天津地区,自44例婴儿腹泻患者大便中分离到344株大肠杆菌,经过血清学研究,证明为大肠杆菌新的O抗原组,暂称之为“pt’O抗原组。其O抗原与已知的大肠杆菌。抗原不同,仅与O 114的。抗原有关,它所具有的K抗原为B抗原,与已知的大肠杆菌K．K。。的B抗原亦不相同,为一新的B抗原。经过临床及流行病学观察,证明此。抗原组为我国致病性大肠杆菌肠炎的重要病原之一。     

动物病原大肠杆菌K88的绿色荧光蛋白基因标记及其稳定性研究

成功地将gfp/luxAB双标记基因整合到K88染色体上,得到绿色荧光蛋白基因标记的大肠杆菌K88∶gfp/lux,其菌体和菌落形态与原始菌株K88完全一致,引入的新质粒不影响菌株的基本形态。从含gfp基因的质粒DNA和K88∶gfp/lux基因组DNA上均可扩增出大小约700 bp的gfp基因片段。大肠杆菌特异性基因检测结果表明,从大肠杆菌K88和K88∶gfp/lux基因组DNA上均扩增出大小约260 bp的大肠杆菌特异性基因片段,说明gfp基因标记后的菌株均为大肠杆菌。在相同的培养条件下,K88∶gfp/lux和K88的生长曲线的变化趋势基本相同。通过检测肠毒性基因(estA)发现,从大肠杆菌K88和K88∶gfp/lux基因组DNA上均扩增出大小约158 bp的肠毒性基因片段,说明gfp基因标记后的菌株在肠毒性方面未发生变化。在无选择压力条件下将K88∶gfp/lux菌株每隔12 h连续转接10次后,所有菌落均保持着均匀并且强烈的绿色荧光,说明标记基因在K88∶gfp/lux中的表达稳定性很高。K88∶gfp/lux和K88在中性偏酸性的环境中生长较好,当初始pH值偏碱性时,生长较差。     

用遗传工程技术构建含E．Coil K88ac和 LT(A-B+)两种抗原基因的菌株

用我室克隆的含大肠杆菌K88ac抗原基因的pMM031质粒和含肠毒素LT(A^-B⁺)抗原基因的质粒pPMc4,使用限制性内切酶BamHI酶解,取得了K88ac抗原基因的片段,再经和BamH I消化的质粒pPmc4连接重组,构建了同时具有这两种抗原基因的质粒pMM085羟琼脂糖凝胶电泳分析,pMM085质粒的分子量约为14．6Md,在宿主菌E．CoilC600,经过ELISA和反向间接血凝等几种试验测定K88ac抗原,结果都说明其抗原产量与亲本菌株基本相同。重组菌的抗甘露糖豚鼠红细胞凝集反应也是阳性。对肠毒素抗原用被动溶血试验测定,结果说明其LT-B的产量和亲本菌的产量也基本相同。重组的工程菌株经兔肠结扎试验表明没有毒性反应,因此重组菌株可以作为预防仔猪腹泻的活菌疫苗候选株。     

禽源大肠杆菌的分离及其毒力因子的检测

从临床疑似大肠杆菌感染的病禽组织中分离到69株细菌(其中鹅源29株,鸡源40株);通过常规形态学、培养特性和生化特征的研究,确定为大肠杆菌。PCR检测表明,其中46株(66.7%)为F1 大肠杆菌,10株(14.5%)为F1 HPI 大肠杆菌,2株(2.9%)为HPI 大肠杆菌;通过比较还发现,F1菌毛和HPI在鹅源和鸡源大肠杆菌中以及不同脏器来源的菌株中具有相似的分子流行病学。O抗原鉴定结果表明鹅源大肠杆菌的O抗原型主要有O26、O78、O18、O117,鸡源大肠杆菌的O抗原型主要有O109、O24、O18、O139、O78。药敏试验表明,其中绝大多数菌株对先锋霉素V、呋喃妥因、庆大霉素敏感,对环丙沙星因菌株差异而不同,林可霉素、四环素、多粘菌素多不敏感。     

抗大肠埃希氏菌K88ab、K88ac和K88ad特异单克隆抗体

用MCA对K88粘附素扩原结构进行分析表明：在K88ab、K88ac和K88ad三种血清到中,同一种血清型的菌株至少能表达一个共同的型特异抗原决定簇;K 88ad菌林和K88ac菌株都能稳定地表达一个K88ab菌株不县有的共同的抗原决定簇;某些抗原决定簇仅存在于同一种K88血清型的部分菌株中。     

K88大肠杆菌菌毛蛋白发酵工艺条件优化研究

分别采用LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、强化营养培养基、玉米浆培养基对大肠杆菌K88进行发酵培养,选出最适于大肠杆菌K88生长的玉米浆培养基;采用正交实验对玉米浆培养基的C／N、K2HPO4／KH2PO4、Mg^2＋的配比进行优化,筛选最适于大肠杆菌K88生长的营养配比;研究生长曲线、接种量以及菌体和菌毛生产量的相关性,根据实验结果优化发酵培养条件,确定菌种的最佳发酵工艺,以收获最多的K88菌毛蛋白。研究表明,K88大肠杆菌在玉米浆培养基C／N、K2HP04／KH2PO4的配比分别为5／11、1／1,Mg^2＋为0．1g/mL,pH值为7．2,转速为200r／min,接种量为4．5％的条件下发酵26个小时,菌体和菌毛生产量均达到高峰,同时得出菌毛蛋白产生量和菌体量成正相关。