大肠杆菌K88ac菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性初步研究

目的：在体外克隆和表达猪肠产毒性大肠杆菌（ETEC）K88ae菌毛操纵子,触结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性。方法：利用长PCR技术以猪ETECK88ae株C83902基因组DNA为模板扩增编码K88菌毛操纵子触基因,克隆入表达质粒载体pBR322,构建和筛选重组质粒pBR322-fae,转化至不含任何菌毛的大肠杆菌EP株;电镜观察重组菌表面菌毛表达情况;用热抽提法提纯表达的重组菌毛;用纯化菌毛免疫小鼠制备高效价抗血清;用SDS-PAGE和Western blot检测重组菌毛的抗原性,用细胞黏附和黏附抑制试验检测其生物学活性。结果和结论：在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88ae菌毛,该重组菌与兔抗K88ae菌毛单因子阳性血清、鼠抗K88ac菌毛单克隆抗体均产生凝集反应;纯化菌毛经SDS-PAGE,结构单位菌毛呈单一的相对分子质量约26×10^3的蛋白条带;纯化菌毛免疫小鼠后可制备出高效价的鼠抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明体外表达的K88ae菌毛具有与K88ae野生菌毛相同的抗原性;猪小肠上皮细胞系黏附和黏附抑制实验结果表明重组EP菌和野生菌株一样具有较强的黏附猪小肠上皮细胞系的能力,而且提纯重组菌毛制备出的鼠抗血清能有效抑制上述重组菌或野生菌株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。     

大肠杆菌K99菌毛fan操纵子的克隆、表达及活性

[目的]在体外克隆和表达猪产肠毒素大肠杆菌(ETEC) K99菌毛操纵子fan结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性.[方法]以猪源分离的表达K99菌毛ETEC C83907株制取模板,成功PCR扩增出编码K99菌毛的fan操纵子,约5.7 kb.将fan操纵子克隆人表达质粒载体pBR322,筛选出含正确阳性质粒的重组菌.进一步将上述的重组质粒DNA转化至不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000株,同时将空载体pBR322质粒转化入SE5000构建阴性对照菌株.[结果]该重组菌能与鼠抗K99菌毛单克隆抗体发生明显的凝集反应,与新生仔猪小肠上皮细胞刷状缘BBV分子有强烈凝集反应.电镜观察到上述重组菌表面大量表达K99菌毛,用热抽提法提纯其表达的K99菌毛,并经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,可以得到分子量约为18.5kDa的主要蛋白条带.纯化菌毛免疫小鼠后制备出高效价的鼠抗血清,能与携带K99菌毛的C83907、C83914、C83260野生株发生强烈的凝集反应,而与携带其他菌毛的ETEC不反应.玻板凝集试验和Western blot结果表明:体外表达的K99菌毛具有和野生K99菌毛相同的抗原性.用表达K99菌毛的重组菌进行HeLa细胞体外黏附试验和黏附抑制实验,结果表明:重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附性,而且用重组菌毛制备的鼠抗血清能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对细胞系的黏附结合.[讨论]本研究为进一步研究K99菌毛生物学作用建立了良好的实验平台.     

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

定居因子抗原(CFA)是肠毒素大肠杆菌(ETEC)的重要毒性因子和保护性抗原,大多以菌毛的形式存在。此类抗原的表达及菌毛的装配需要2类基因的共同作用,即亚基结构基因和辅助蛋白结构基因。亚基是纤毛抗原的基本组成单位,而辅助蛋白则参与亚基蛋白分子的输送及装配过程。CS3亚基结构基因位于辅助蛋白结构基因的下游,处于CS3操纵子的3′端。CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析揭示,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核     

大肠杆菌分子伴侣GroE系统及其协助的Rubisco蛋白装配

分子伴侣协助蛋白质在体内正确组装,对分子伴侣结构和作用机制的研究不仅在生物大分子结构和功能研究中具有重要的理论意义,而且还具有广泛的应用价值。大肠杆菌分子伴侣GroE系统是迄今为止研究得最为透彻的分子伴侣。本文侧重总结了GroE系统的作用机制以及在该系统的帮助下光合细菌核酮糖1,5二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco蛋白)的装配情况。     

硫矿硫化叶菌P2分子伴侣基因的克隆表达及其性质

[目的]研究重组表达的硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基体外同源聚合体的结构和生化功能.[方法]利用PCR技术从硫矿硫化叶菌P2的基因组DNA中克隆得到分子伴侣β亚基的基因,将该基因克隆到表达载体pET-21a( )上并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达.对纯化后的β亚基单体进行体外聚合,利用透射电镜观察β分子伴侣的结构,并对其促蛋白折叠性质进行了研究.[结果]硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基基因在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,纯化后的分子伴侣β亚基单体在ATP和Mg2 存在的条件下可自组装形成分子伴侣聚合体.透射电镜观察表明:该β分子伴侣具有Ⅱ型分子伴侣典型的双层面包圈结构,每个环由8个亚基构成.该β分子伴侣具有ATPase活性,最适反应温度为80℃;它不仅能够促进变性的绿色荧光蛋白(GFP)重新折叠,而且还能有效的提高木聚糖酶的热稳定性.[结论]本文根据P2基因组序列分析预测的分子伴侣基因设计引物,克隆表达了硫矿硫化叶菌P2分子伴侣的β亚基,纯化后对其进行体外聚合,透射电镜观察表明该聚合体具有Ⅱ型分子伴侣的经典结构,功能分析表明该β分子伴侣能够在体外促进异源蛋白质的折叠、提高其它酶分子的热稳定性.这为进一步深入研究嗜热古菌耐热抗逆的分子机制,奠定了良好的基础.     

大肠杆菌热激反应研究及其在重组蛋白表达中的应用

当大肠杆菌所处的环境温度忽然升高时, 细胞体内会激发热激反应, 体内会迅速合成多种热激蛋白, 由热激转录因子调控的热激蛋白主要包括一些分子伴侣、蛋白降解酶、折叠辅助蛋白等。热激蛋白可以促进蛋白正确折叠, 降解错误折叠的蛋白。主要介绍大肠杆菌热激蛋白的表达调控及其功能, 利用热激转录因子发展的新型温控分泌表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用, 以及热激分子伴侣与重组蛋白共表达的研究进展。     

动物源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)黏附素研究进展

动物源产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起动物(尤其是幼龄动物)腹泻的主要病原菌。已知黏附素和肠毒素是ETEC中两种重要的毒力因子,在致病性中两者缺一不可。其中黏附素结合到宿主易感肠上皮细胞是ETEC感染的第一步,也是最重要的关键步骤。动物源ETEC的菌毛黏附素主要包括K88、K99、987P、F18、F17和F41等。人们从20世纪60年代就开始了ETEC菌毛黏附素的相关研究,包括菌毛的基因、结构组成、生物合成、菌毛表达的调控机制以及黏附素和宿主受体相互作用等,这些研究基础有助于我们深入了解ETEC病原菌的感染机理;并且在疾病诊断和新疫苗的开发中具有重大意义。     

大肠杆菌分子伴侣GroF系统及其胁助的Rubisco蛋白装配

分子伴吕协助蛋白质在体内正确组装,对分子伴侣结构和作用机制的研究不仅在生物大分子结构和功能研究中具有重要的理论意义,而且还具有广泛应用价值。大肠杆菌分子伴侣ＧｒｏＥ系统是迄今为止研究得最为透彻的分子伴侣。本文侧重总结了ＧｒｏＥ系统的作用机制及在该系统的帮助下光合细菌核酮糖１,５－二磷酸羧化／加氧酶（Ｒｕｂｉｓｃｏ）的装配情况。     

分子伴侣参与调控动、植物的发育和进化进程

近年来, 人们对分子伴侣的功能研究取得了很大进展, 阐明了它参与细胞新合成蛋白多肽的折叠、组装、运输和蛋白质的降解过程。在这些过程中, 伴随着分子伴侣表达量的高低变化, 细胞线粒体数量也会发生相应的变化。文章综述了分子伴侣参与调控动、植物的发育和进化进程, 如: 动、植物育性调控, 抗逆境能力提高及热休克蛋白-多肽复合物的肿瘤免疫治疗探索等。     

大肠杆菌棉子糖操纵子

大肠杆菌(Escherichiacoli)棉子糖(raf)操纵子位于质粒,它编码能够使大肠杆菌吸收和利用三糖棉子糖的蛋白,即一个主动运输系统(Raf透性酶),α半乳糖苷酶和蔗糖水解酶。raf操纵子包括启动子rafP,调节基因rafR,操纵基因rafO以及rafA,rafB,rafD三个结构基因。这个操纵子由一个阻遏蛋白RafR负控制,同时以环腺苷代谢降解物基因激活蛋白(cAMPCAP)为中介的正调控也参与调节。