靶向CD138的第四代CAR-T细胞的构建及功能研究

该研究构建了靶向CD138的第四代CAR-T细胞(分泌IL-7和CCL19),通过与靶向CD138的第二代CAR-T细胞进行生物学功能比较,探讨第四代CAR-T细胞应用于临床的优势。使用慢病毒转染健康人外周血的T细胞制备出靶向CD138的第二代和第四代CAR-T细胞,CFSE标记法检测T细胞的增殖能力,Transwell实验检测T细胞的趋化能力,ELISA检测细胞因子分泌水平,流式细胞术检测T细胞的CAR表达率和亚型。荧光素酶生物发光法检测CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞株的体外杀伤功能;构建人多发性骨髓瘤NCG小鼠模型,通过生物发光成像系统监测CAR-T细胞输注后小鼠肿瘤的消退情况。结果显示,靶向CD138的第四代CAR-T细胞(CD138-BBZ-7×19)在体外的生物学功能优于第二代CAR-T细胞(CD138-BBZ),而且在人多发性骨髓瘤动物模型中具有明显的抗肿瘤作用。     

稳定表达CD19-FLUC-GFP的CT26细胞系的构建及鉴定

实体瘤缺乏明确的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T)治疗靶点。因此,通过慢病毒将已经明确的靶点分子CD19带入实体瘤细胞系,研究CD19 CAR-T细胞对其的杀伤,能够为CAR-T细胞针对实体瘤的治疗提供潜在的支撑。本研究利用三质粒慢病毒系统构建了稳定表达CD19、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, FLUC)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的结肠癌CT26细胞系CT26-CD19-FLUC-GFP。该细胞系与CT26细胞系的生长活性一致。通过流式细胞术检测不同代次CT26-CD19-FLUC-GFP细胞,证实了CT26-CD19-FLUC-GFP细胞连续传代至第5、10、22代后CD19及GFP的稳定表达。进一步证实,连续传代至第22代的CT26-CD19-FLUC-GFP细胞中的CD19 mRNA及FLUC表达水平显著高于对照组CT26细胞。与T细胞相比,CD19 CAR-T细胞能够显著杀伤CT26-CD19-FLUC-GFP细胞及MC38-CD19细胞。CT26-CD19-FLUC-GFP细胞腹腔植入小鼠体内1周后,通过活体成像仪可以检测到腹腔区域的FLUC表达。上述结果表明,成功构建了稳定表达CD19-FLUC-GFP的CT26细胞系,且该细胞系能够被CD19 CAR-T细胞特异性杀伤。     

定点突变优化信号肽对嵌合抗原受体T细胞功能的影响

信号肽(signal peptide, SP)参与调节嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)结构的分泌水平及跨膜易位过程,对嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)行使功能至关重要,本研究通过定点突变技术优化SP序列,并研究其对CD19-CAR-T杀伤功能的影响。首先,利用基因合成和分子克隆技术,构建含野生型SP (SP-wtY)、2种突变型SP (SP-muK或SP-muR)的靶向CD19的CAR载体;对构建成功的载体进行慢病毒包装,并使用慢病毒侵染T细胞,利用流式细胞术检测细胞的转染效率,钙黄绿素释放法检测对靶细胞的体外杀瘤能力,酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测2种细胞因子[干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和干扰素-α (interferon-α, TNF-α)]的分泌水平。结果显示,构建了野生型和信号肽突变的重组慢病毒质粒,慢病毒转导T细胞后,携带3种信号肽(SP-wtY、SP-muK或SP-muR)的CD19-CAR转染效率分别为33.9%、35.5%、36.8%。进一步杀伤实验显示,与SP-muK和SP-wtY细胞相比,SP-muR细胞的肿瘤杀伤效果显著提高,当效靶比为10:1时共培养24 h后,SP-muR组CAR-T细胞的细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌水平显著高于SP-muK和SP-wtY组。本研究揭示信号肽N端正电荷数的增加可以提高CAR的表达效率和对CD19⁺靶细胞的杀伤作用,为CAR结构的优化改造和临床高效应用提供了科学依据。     

靶向CS1的CAR-T细胞构建及其抗肿瘤活性的体外研究

文中利用基因工程方法构建包含4-1BB或ICOS的第二代Anti-CS1慢病毒表达载体,以及同时包含这两个共刺激因子的第三代Anti-CS1慢病毒表达载体,通过制备相应慢病毒感染人CD3+T细胞,分别获得靶向CS1的第二代和第三代CAR-T细胞。研究结果表明：以ICOS为共刺激因子及以4-1BB为共刺激因子的第二代CAR-T抗肿瘤活性相似,且在效靶比为1︰1时,含ICOS共刺激因子比含4-1BB共刺激因子的第二代CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤效力更高;在效靶比为1︰1、2︰1和5︰1时,第三代CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤效力低于第二代;在效靶比为10︰1时,二代和三代CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤效力都达到85%以上, 显著高于对照组。综上所述,该研究成功构建了靶向CS1的第二代和第三代CAR-T细胞,其可高效杀伤高表达CS1的肿瘤细胞,且靶向CS1的第二代CAR-T细胞比第三代对肿瘤细胞的杀伤效力更强。     

敲低SOX2基因抑制乳腺癌干细胞的含量

目的:构建敲低SOX2基因的慢病毒表达载体,研究敲低SOX2基因对乳腺癌干细胞含量的影响。方法:将SOX2基因短发夹RNA(sh RNA)序列构建到慢病毒表达载体,利用293T细胞包装并获得敲低SOX2基因的病毒,后在MCF-7、T47D细胞系中构建敲低SOX2基因的稳定克隆,Western印迹检测SOX2蛋白的表达水平,q RT-PCR检测SOX2 m RNA水平的变化,利用流式细胞术检测敲低SOX2基因后乳腺癌干细胞含量的变化。结果:构建了表达SOX2基因sh RNA的慢病毒表达载体,在乳腺癌细胞中敲低SOX2基因后,CD44+/CD24-/low及乙醛脱氢酶阳性(ALDH+)细胞的比例明显降低。结论:敲低SOX2基因抑制了乳腺癌干细胞的含量。     

基于逆转录病毒载体构建稳定表达人CD19和荧光蛋白的SW620细胞株

摘要 目的：构建表达人CD19和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和荧光素酶（LUC）的SW620细胞株。方法：构建MFG-CD19质粒,进行逆转录病毒载体包装,与MFG-EGFP-P2A-LUC逆转录病毒载体共同转导SW620细胞,筛选出稳定且强表达的单克隆细胞株SW620-CD19-EGFP-LUC并扩大培养。通过流式细胞术与qPCR技术检测细胞CD19的表达、通过荧光素酶法对细胞系表面荧光素酶的表达和细胞系功能进行鉴定。结果：流式检测构建完成的细胞株中CD19阳性的细胞占比为99.9%,EGFP阳性的细胞占比为99.2%;荧光显微镜下能够明显观察到细胞的绿色荧光;qPCR检测结果表明细胞株中CD19的表达水平相比原始细胞株明显上调,并且能够激活CD19 CAR-T细胞对其进行杀伤。结论：成功构建了能够稳定表达人CD19和荧光蛋白的SW620细胞株。     

靶向BCMA的第二代/三代CAR-T细胞构建及其抗肿瘤活性的体外研究

该研究利用基因工程方法构建包含4-1BB或ICOS的第二代Anti-BCMA慢病毒表达载体,以及同时包含这两个共刺激因子的第三代Anti-BCMA慢病毒表达载体,通过制备相应慢病毒感染人CD3+T细胞,分别获得靶向BCMA的第二代和第三代CAR-T细胞。研究结果表明,以ICOS为共刺激因子及以4-1BB为共刺激因子的第二代CAR-T抗肿瘤活性相似,且在效靶比为2:1时,含ICOS共刺激因子比含4-1BB共刺激因子的第二代CAR-T细胞对U266-lucgfp细胞的杀伤效力更高;在效靶比为2:1、5:1和10:1时,第三代CAR-T细胞对U266-lucgfp细胞的杀伤效力低于第二代;在效靶比20:1时,第二代和第三代CAR-T细胞对U266-lucgfp细胞的杀伤效力都达到90%以上,显著高于对照组。综上所述,该研究成功构建了靶向BCMA的第二代和第三代CAR-T细胞,其可高效杀伤高表达BCMA的肿瘤细胞,且靶向BCMA的第二代CAR-T细胞比第三代对肿瘤细胞的杀伤效力更强。     

靶向GPC3的第四代嵌合抗原受体T细胞 (分泌IL-7和CCL19) 的构建以及功能

基于嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)的过继免疫疗法已被证明是治疗恶性肿瘤最有希望的策略之一,但是目前其在实体瘤中的应用依然有限。研究表明磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)对肝细胞癌来说是一种有意义的诊断、治疗和预后生物标志物,且已有利用第二代/第三代GPC3靶向的CAR-T细胞治疗肝细胞癌的研究报道。为了进一步提高治疗效果,构建同时表达GPC3 CAR、人源IL-7和CCL19细胞因子的第四代慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒并感染人T淋巴细胞制备靶向GPC3的第四代CAR-T细胞(GPC3-BBZ-7×19)。利用细胞计数、趋化小室、荧光素酶生物发光法以及流式细胞术等比较其与第二代GPC3 CAR-T细胞(GPC3-BBZ)在增殖、迁移、杀伤以及亚型分布方面的区别,评估GPC3-BBZ-7×19 CAR-T细胞对免疫缺陷小鼠体内GPC3阳性的肝细胞癌腹腔移植瘤生长的作用。结果表明与GPC3-BBZ CAR-T细胞相比,GPC3-BBZ-7×19 CAR-T细胞具备更强的增殖能力、趋化能力以及记忆干细胞(Stem memory T cell,Tscm)组成比(P值均0.05),而在体外特异性杀伤GPC3阳性的肝细胞癌细胞以及细胞因子分泌水平方面无显著差异。此外,GPC3-BBZ-7×19 CAR-T细胞能够明显抑制免疫缺陷小鼠体内的GPC3阳性肝细胞癌移植瘤模型。因此靶向GPC3的第四代CAR-T细胞(分泌IL-7和CCL19)有望比第二代GPC3靶向的CAR-T细胞更持久有效地对抗肿瘤,并产生针对肿瘤的记忆功能,为以后的临床试验提供了临床前研究基础。     

靶向人源BCMA的嵌合抗原受体T细胞构建及体外抗肿瘤活性研究

摘要 目的：通过对CAR结构的ScFv单链可变区进行改造,构建并筛选具有更强杀伤肿瘤细胞功能的新型靶向人源B细胞成熟抗原（BCMA）的嵌合抗原受体 (CAR)-T细胞。方法：构建靶向人源BCMA的CAR分子,用逆转录病毒载体包装成功后转导健康志愿者的T细胞,制备Anti-BCMA-CAR-T细胞。将Anti-BCMA-CAR-T细胞作为观察组,普通T细胞作为对照组,将其与RPMI-8226细胞共培养,采用CFSE染色的T细胞增殖实验观察两组体外增殖能力。采用荧光素酶化学发光实验检测两组细胞在不同效靶比（1:8、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1）对RPMI-8226细胞的杀伤效率,采用流式细胞术检测两组细胞在不同效靶比（1:4、1:2、1:1、2:1、4:1）对RPMI-8226细胞的杀伤效率。结果：CFSE检测结果显示,与对照组比较,观察组FITC信号明显左移,表明T细胞增殖能力越强。流式细胞术检测结果显示,相同效靶比时,观察组对RPMI-8226细胞的杀伤效率均高于对照组（P均<0.05）;荧光素酶化学发光实验结果显示,相同效靶比时,观察组对RPMI-8226细胞的杀伤效率均高于对照组（P均<0.05）。在效靶比为4:1时,CAR170-T（未经改造的传统的ScFv）细胞和CAR174-T（经改造的ScFv）细胞的杀伤效率分别达到了88.5±0.3 %和98.5±0.7 %。结论：通过对CAR结构的ScFv单链可变区进行改造后成功构建出的新型靶向BCMA的CAR-T细胞,它能保持较强的增殖活性且具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力。     

慢病毒介导的靶向沉默信息调节因子1（SIRT1）的RNA干扰对肝癌细胞生长及凋亡的影响

目的探讨慢病毒介导的靶向SIRTlshRNA对肝癌细胞生长和凋亡的影响。方法Western印迹分析SIRT1在多个肝癌细胞系中的表达;通过慢病毒介导的shRNA干扰技术靶向沉默SIRT1的表达,并通过Western印迹验证SIRTl基因的沉默效果。台盼蓝排斥实验分析SIRT1基因沉默对肝癌细胞生长的影响;流式细胞术和Western印迹检测PARP蛋白的剪切物观察细胞凋亡状态。结果SIRT1在多个肝癌细胞系中表达水平明显上调;慢病毒介导的shRNA能显著抑制细胞中SIRT1的表达。流式细胞术及Western印迹结果均显示SIRT1表达沉默显著诱导了肝癌细胞的凋亡。结论慢病毒介导的靶向SIRT1shRNA显著地抑制SIRT1的表达;SIRT1基因沉默抑制肝癌细胞生长并促进了细胞凋亡。     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Comparative morphology of the carpel in the Liliaceae: Hewardieae, Petrosavieae, and Tricyrteae

The young pistils in the melanthioid tribes, Hewardieae, Petrosavieae and Tricyrteae, are uniformly tricarpellate and syncarpous. They lack raphide idioblasts. All are multiovulate, with bitegmic ovules. The Petrosavieae are marked by the presence of septal glands and incomplete syncarpy. Tepals and stamens adhere to the ovary in the Hewardieae and the Petrosavieae but not in the Tricyrteae. Two vascular bundles occur in the stamens of the Hewartlieae and Tricyrtis latifolia. Ventral bundles in the upper part of the ovary of the Hewardieae are continuous with compound septal bundles and placental bundles in the lower part. Putative ventral bundles occur in the alternate position in the Tricyrteae and putative placental bundles in the opposite. position in the Petrosavieae. The dichtomously branched stigma in each carpel of the Tricyrteae is supplied by a bifurcated dorsal bundle.     

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失.自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的.     

Development of a Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2

In conclusion, the novel visual RT-LAMP assay is a simple, rapid, and sensitive approach for detection of SARS-CoV-2, and it is ready for application in primary care and community hospitals or health care centers, and even patients' own houses in response to the current SARS-CoV-2 epidemic because the assay does not require sophisticated equipment and skilled personnel. Furthermore, it is also ready to be used in fields for screening samples from wild animals and environments to facilitate the identification of potential intermediate hosts that mediate the cross-species transmission of SARS-CoV-2 from bats to humans.     

Perinatal Vertical Transmission of Chikungunya Virus in Ruili,a Town on the Border between China and Myanmar

正Dear Editor,Chikungunya virus (CHIKV), an arbovirus in the family of Togaviridae, genus Alphavirus, is transmitted by the A.aegyptii or A. albopictus mosquito, and causes disease in humans characterized by fever, rash, and arthralgia (Silva and Dermody 2017; Suhrbier 2019). It was first reported in 1953 in Tanzania, and caused only a few outbreaks and sporadic cases in Africa and Asia in last century. However, in the epidemic in 2004, CHIKV acquired mutations that conferred enhanced transmission by the A. albopictus mosquito(Schuffenecker et al. 2006). Since then, it has successively caused outbreaks in Africa, the Indian Ocean, South East Asia, the South America, and Europe (Zeller et al. 2016).