猪α-干扰素的原核表达及活性测定

目的：表达并纯化出具有生物学活性的重组猪α-干扰素。方法：根据前期合成的猪α-干扰素基因序列设计引物,用PCR方法扩增出猪α-干扰素基因,并将其定向克隆入原核表达载体pET28中,酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,对表达产物通过镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化、透析法复性后,采用微量细胞病变抑制法测定重组猪α-干扰素的活性。结果：测序结果表明构建了猪α-干扰素原核表达载体pET28-poIFN-α;诱导表达后经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约21×10^3的位置出现明显的诱导蛋白条带,与目的蛋白大小相近;经分析表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的36%,纯化后的目的蛋白纯度约为90%;采用微量细胞病变抑制法测定其活性约为1.67×10^6U/mg。结论：获得了纯度较高并具有较高活性的重组猪α-干扰素,为下一步研究猪α-干扰素药物价值及其生物制剂的生产、应用奠定了基础。     

猪干扰素-α基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:克隆与分析猪干扰素-α(INF-α)基因,构建猪干扰素基因的高效植物表达载体。方法:根据NCBI中DQ248997序列设计引物,以猪的总DNA为模板,PCR扩增出猪的INF-α基因,克隆至pBS-T载体后进行序列分析,构建猪干扰素基因的植物表达载体。结果:实验所克隆序列经Blastn比对,98%的核酸序列相同,98%的蛋白质序列相同,3个非功能性氨基酸与基因库中序列不一致,推测为猪INF-α的一个亚型。构建的2个植物表达载体经BamHⅠ/SacⅠ限制性内切酶消化,均可得到570bp的目的基因。结论:成功克隆了猪的INF-α基因,并构建出含猪INF-α基因的高效植物表达载体pBI121/INF和pCAMBIA1301/INF。     

干扰素基因

干扰素(IFN)是一类蛋白质,它作用于靶细胞产生抗病毒作用,它还具有抑制细胞生长和调节免疫功能等作用。干扰素的研究无论在理论上还是在临床应用上都有重要意义。随着基因工程技术的发展,用基因工程来研究和生产干扰素便成为科学家努力的目标了。目前,从一公斤大肠杆菌菌体可生产2克α-干扰素(IFN-α)。IFN-α基因在酵母中的表达也获得了成功。β-干扰素(IFN-β)及r-干扰素(IFN-r)的基因工程生产也已成功。干扰素基因工程的研究又促进两个方面的研究得到重要发展,一是干扰素基因结构的研究取得十分重要的进展;另一是干扰素的基因人工合     

猪I型与II型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较

干扰素(IFN)是由多种细胞受病毒感染或其他生物诱导剂刺激而产生的天然蛋白质,主要功能为抗病毒增殖、调节免疫反应和激活免疫细胞等。本研究克隆并测序了猪干扰素(PoIFN)α、γ、αγ及ω基因。构建原核表达载体pET-His/PoIFN-α、pET-His/PoIFN-γ、pET-His/PoIFN-αγ和pET-His/PoIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。用细胞病变抑制法在Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明猪α和αγ融合干扰素有较为显著的抗病毒活性,抗PRRSV活性高达108U/mg;猪γ干扰素活性效价约为α干扰素的1/2到1/3;猪ω干扰素几乎未检测到抗病毒活性,需进一步验证。本研究对干扰素在抗病毒、提高机体免疫方面的应用提供了理论依据。     

计算机检查干扰素基因的限制性内切酶位点

电子计算机已广泛用于核酸的研究中,1982年Nucleic Acid Research 10卷1期出了一个专集,专门报道这方面的应用。干扰素基因一般为1Kb,但分为α,β,γ三个主要类型,其基因结构顺序均已了解(图1-3),但各类干扰素又有很多亚型,仅α型就有     

猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究

本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-α,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α。该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107TCID50/mL。RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。     

迄今最长的合成基因

将近两年前,试图合成人类干扰素基因,那是不可能的。从诱导细胞产生干扰素,通过反转录产生DNA,开始测定出干扰素基因的核苷酸顺序,正好是两年了。此后,从mRNA制出CDNA中表明,在人类染色体组中的干扰素基因可能是一个家族——有些相当于白细胞干扰素(α——干扰素),较少的相当于成纤维细胞干扰素(β—干扰素)及更少量的免疫干扰素(γ—干扰素)。这些干扰素中的每种干扰素的氨基酸顺序还没     

猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究

本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-a,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α.该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107 TCID50/mL.RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础.     

迄今最长的合成基因

将近两年前,试图合成人类干扰素基因,那是不可能的。从诱导细胞产生干扰素,通过反转录产生DNA,开始测定出干扰素基因的核苷酸顺序,正好是两年了。此后,从mRNA制出CDNA中表明,在人类染色体组中的干扰素基因可能是一个家族--有些相当于白细胞干扰素(α--干扰素),较少的相当于成纤维细胞干扰素(β-干扰素)及更少量的免疫干扰素(γ-干扰素)。这些干扰素中的每种干扰素的氨基酸顺序还没     

降低诱导温度提高毕赤酵母甲醇代谢关键酶基因转录水平和猪-α干扰素生产性能

以一株表达猪-α干扰素(pIFN-α)重组毕赤酵母为研究对象,考察了诱导温度对pIFN-α表达、细胞代谢活性及甲醇代谢关键酶的影响.在5 L发酵罐开展毕赤酵母高密度流加培养生产表达pIFN-α研究,利用实时PCR技术对不同诱导温度、诱导稳定期的胞内甲醇代谢关键酶(包括解毒酶)基因转录水平进行定量分析.低温(20℃)可以...     

猪脾细胞干扰素与人白细胞干扰素之间的抗原性关系

我们应用中和试验在不同细胞上对干扰素血清与猪脾细胞干扰素(PSIFN)及人干扰素(HuIFN-α)的中和能力进行了试验,结果证明HuIFN-α多克隆抗体具有明显的中和PSIFN的能力。而人免疫干扰素(Hu IFN-γ)抗体具有微弱的中和猪脾细胞干扰素能力。猪脾细胞干扰素不仅可在同源细胞表现出抗病毒活性,而且可在异源细胞表现出较高的抗病毒活性。应用人白细胞干扰素多克隆抗体亲和层析可有效地分离猪脾细胞干扰素,证实猪脾细胞干扰素与人白细胞干扰素之间具有高度的同源性关系。     

猪γ干扰素在家蚕中的表达和抗病毒活性检测

干扰素在畜牧养殖业中可以用于病毒性传染病的治疗和疫苗免疫效力的提高,用杆状病毒表达系统在家蚕中表达了猪γ干扰素。根据已发表的序列对猪γ干扰素基因的密码子进行优化并合成,将其克隆到杆状病毒转移载体p VL1393上,与Bm Bacmid病毒基因组DNA共转染Bm N细胞系,获得重组病毒,猪γ干扰素基因位于重组Bm NPV病毒的多角体基因启动子下游。用该重组病毒感染家蚕获得含有猪γ干扰素的表达产物。Western blotting检测到表达产物中的猪γ干扰素,用微量细胞病变法利用干扰素抑制VSV-GFP感染VERO细胞的方法来测定干扰素活性,结果显示干扰素效价可以达到6×105 IU/m L以上。在家蚕幼虫体内成功表达并获得了有活性的猪γ干扰素。     

病毒诱导I型干扰素产生的机制

病毒的病原体相关分子模式被细胞的相关受体识别后,分别经过Toll样受体途径和核酸结合蛋白途径进行信号转导,启动β-干扰素的转录和合成。从感染细胞分泌的β-干扰素与细胞膜上I型干扰素共有的受体结合后,经Jak/STAT信号途径刺激细胞产生一系列具有抗病毒效应的的干扰素刺激因子。干扰素调节因子7作为一种干扰素刺激因子在启动随后的α-干扰素转录中起着重要作用。α、β-干扰素的产生进一步放大了产生干扰素刺激基因的信号,形成一个正反馈回路,加强了免疫应答的强度和延长免疫应答的时间。     

病毒诱导Ⅰ型干扰素产生的机制

病毒的病原体相关分子模式被细胞的相关受体识别后,分别经过Toll样受体途径和核酸结合蛋白途径进行信号转导,启动β-干扰素的转录和合成。从感染细胞分泌的β-干扰素与细胞膜上Ⅰ型干扰素共有的受体结合后,经Jak／STAT信号途径刺激细胞产生一系列具有抗病毒效应的的干扰素刺激因子。干扰素调节因子7作为一种干扰素刺激因子在启动随后的α-干扰素转录中起着重要作用。母α、β-干扰素的产生进一步放大了产生干扰素刺激基因的信号,形成一个正反馈回路,加强了免疫应答的强度和延长免疫应答的时间。     

CELLTECH公司可提供抗-γ-干扰素

对γ-干扰素日益感兴趣的一个标志是Celltech公司把抗-γ-干扰素列入了它的单克隆抗体的产品目录。这家英国公司的抗-α-干扰素在世界上的销售十分成功。许多干扰素制造者都是将附在载体粒的单克隆抗体装柱,来纯化α-干扰素的。在不纯的混和物通过柱时,单克隆抗体唯独与α-干扰素结合。杂质流出柱外,附在单克隆抗体上的干扰素仍留在载体粒上。从载体粒提取的即是高度纯化的干扰素。在α-干扰素的室内测定中,单克隆抗体也有用。     

基因重组人干扰素的实验室研究

<正>人α-、-β和γ-干扰素的前临床和临床研究的结果证明了其抗病毒、抑制增生和免疫调节的作用,使人们对该制品产生了很大兴趣。直到不久前还用人白细胞干扰素作临床试验,因血源白细胞来源不足而受限。基因工程的成就使干扰素有可能投入工业生产。一些国家使三种干扰素基因在细菌和酵母菌上表达并获得了相应活性蛋白。对基因重组干扰素的研究证明在生物学特性和药理学作用方面与天然干扰素本无本质的区别,同时对人体无害,对于疱疹、肝炎、副流感     

不同型别的基因工程干扰素抗病毒活性的比较

对大肠杆菌生产的不同型别的基因工程干扰素rIFN-α1(α1)、rIFN-αA(αA)、rIFN-β17ser(β17ser)和rIFN-γ(γ),以及自然人白细胞干扰素nIFN-αco,在不同细胞上对不同病毒的抗病毒活性做了比较研究。证明:①α1抗病毒作用的细胞谱较广,尤其在牛肾MDBK细胞和猪肾PK细胞上有很高的活性,分别为在人细胞上的29倍和7倍。β17ser和γ在异种细胞上活性极低,在鼠、猪和牛肾细胞上的活性为人细胞上的1～2％以下。②5种干扰素对麻疹、CoxB1、Sindbis、腺病毒7型和Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒的抗病毒活性无明显差异。但不同病毒对干扰素的敏感性有明显差别,以Sindbis病毒为最敏感,7型腺病毒最不敏感。③5种干扰素对流行性出血热病毒均有明显的抗病毒作用,尤以人α1型和β干扰素作用最强,α1对出血热病毒的抗病毒活性是对滤泡性口膜炎病毒(VSV)的1/2.85,人β干扰素是对VSV的1/4.1。上述结果为人基因工程干扰素的临床应用提供了实验依据。     

从江香猪λ1干扰素基因的克隆及序列分析

[目的]对从江香猪λ1干扰素(interferon-λ1,IFN-λ1)基因进行扩增、克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank登录的猪IFN-λ1基因序列(FJ455508)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从淋巴细胞中扩增IFN-λ1基因CDS区并进行克隆和生物信息分析。[结果]从江香猪IFN-λ1基因CDS全长576 bp,共编码191个氨基酸,其分子式为C949H1543N277O270S7,相对分子质量21.38 k Da;该蛋白等电点为9.42,为亲水性蛋白。从江香猪IFN-λ1含有丰富的二级结构,以α-螺旋(64.40%)和无规卷曲(25.65%)为主,蛋白质三级结构中主要以α-螺旋为主,同源性及系统进化树分析结果表明从江香猪与野猪IFN-λ1核苷酸同源性最高(为100%),亲缘关系最近。[结论]从江香猪IFN-λ1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其抗病毒功能奠定了基础。     

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达

将一个398bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin,LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子-α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪仅乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。     

PNAS：一基因调控或可抑制白血病细胞恶性增殖

来自中国科学院上海生命科学研究院／上海交通大学医学院健康科学研究所、医学基因组学国家重点实验室的研究人员在白血病机理研究方面又获得了一项重要成果：研究人员发现了Rig-I基因可以明显增强干扰素信号通路中STAT1分子的激活，同时通过这一调控作用来抑制白血病细胞的恶性增殖。这一研究成果公布在美国《国家科学院院刊》（PNAS）上。同时Nature系列出版刊物--SciBX（the Science Businesse Xchange）对这一工作进行了跟踪报道。