pH调控双水相萃取色素蛋白复合体及其分配行为研究

为发展色素蛋白复合体分离纯化新方法,探究pH调控PEG1000/柠檬酸钾双水相系统萃取分离纯化色素蛋白复合体。优化萃取条件,光谱法研究其分配行为,检测产物纯度和生物活性。结果表明,最佳萃取条件为调节pH9.0,相组成CPEG100019.0%/C柠檬酸钾20.0%,蛋白质加量3.42 mg/g,K和萃取率达到最大,分别为8.8及86.0%。响应面分析法揭示,PEG1000和柠檬酸钾质量浓度及pH对分配系数和萃取率影响显著。调节pH7.0,反萃取分配系数和反萃取率最小为0.15及86.6%。蛋白质总回收率为74.2%。pH对色素蛋白复合体分配行为具有调控作用,pH大于8.5体系,色素蛋白趋于分配上相,反之分配于下相,PEG1000/柠檬酸钾以及蛋白质加入量不影响色素蛋白复合体分配于上相。电泳表征发现,萃取(pH9.0)上相存在2个蛋白质组分,相对分子量(MW)为7.0 kD及14.0 kD。反萃取(pH7.0)使相对分子量7.0 kD蛋白质组分分配于下相,该组分为LH2β亚基,经萃取和反萃取产物生物活性稳定。pH可调控PEG1000/柠檬酸钾双水相系统萃取分离色素蛋白复合体,产物纯度高,生物活性稳定。     

蛋白质的染料亲和色谱分离纯化

介绍了三嗪染料配基亲和色谱(包括高效亲和色谱)分离纯化蛋白质的基本原理和方法,并介绍了染料亲和色谱固定相制备方法及应用的最新发展。     

AOT/异辛烷反胶束萃取纯化胰蛋白酶及酶变性失活问题的解决

用反胶束技术分离纯化蛋白质,具有高选择性、易于大规模操作等优点,具有良好的工业应用前景。但是离子型表面活性剂形成的反胶束体系萃取蛋白质容易引起蛋白质的变性,这是由于离子型表面活性剂的强电荷作用所导致的。对用AOT/异辛烷反胶束体系从胰酶粗提物中萃取胰蛋白酶进行了研究,通过在反胶束相加入乙醇,解决了反胶束萃取蛋白质时蛋白质变性失活的问题。并且由于乙醇的加入大大减少了分相的时间,简化了实验步骤,优化了实验方法,使此技术在工业上的大规模应用成为可能。通过优化各种实验条件,胰蛋白酶的前萃取率达到90%,反萃取率接近100%。最终得率为88%。纯化后的比活提高了5倍多,从300U/mg左右提高到了1800U/mg。     

用乙醇消除AOT/异辛烷反胶束体系萃取过程中蛋白质的变性失活

用反胶束技术分离纯化蛋白质,具有高选择性、易于大规模操作等优点,具有良好的工业应用前景。但是离子型表面活性剂形成的反胶束体系萃取蛋白质容易引起蛋白质的变性,这是由于离子型表面活性剂的强电荷作用会导致蛋白质发生变性,从而在两相界面上产生沉淀。这也是离子型反胶束体系用于蛋白质萃取所存在的最大的困难。本文对用AOT/异辛烷反胶束体系从胰酶粗提物中萃取胰蛋白酶进行了研究,通过在反胶束相加入乙醇,解决了反胶束萃取蛋白质时使蛋白质变性失活的问题,并且大大减少了分相的时间。前萃取和反萃取之后的分相时间只需要10分钟左右,简化了实验步骤,优化了实验方法,在工业上的大规模应用成为可能。在本研究中,胰蛋白酶的前萃取率达到90%,反萃取率接近100%。最终得率为88%。纯化后的比活提高了5倍多,从300U/mg左右提高到了1800U/mg。     

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的AOT反胶束纯化研究

研究微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)反胶束纯化的工艺和条件,调节MTGase离心上清液等电点,除去部分杂蛋白,MTGase活力升高7.5倍;用截留分子量为10000的超滤膜除去小分子杂蛋白,MTGase活力升高1.33倍;用0.05mol/L的AOT/异辛烷反胶束进一步纯化MTGase,其最适萃取条件是粗MTGase蛋白质浓度20mg/mL,[Na ]0.12mol/L,水相pH4.80～5.20,相比1:1(v/v);荷载MTGase的AOT反胶束用2.0mol/LKCl进行反萃取,MTGase活力为14.2U/g,纯化8.875倍;冷冻干燥脱盐反萃取液,获得MTGase冻干粉,其活力为110.3U/g,与粗酶液相比较,纯化689.4倍。经过AOT/异辛烷反胶束萃取纯化的MTGase,其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为一条带。Ca2 与表面活性剂非极性尾上丁二酰羰基氧、极性头磺酸基硫氧基氧及MTGase分子表面具有孤电子对的基团的配位结合放大了AOT反胶束的另一种萃取作用——配位萃取,致使其对MTGase的萃取率高于K 而接近Na 。     

反胶束萃取技术分离胰激肽原酶

研究了用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）/正己醇/正辛烷反胶束溶液萃取和反萃取商业用胰激肽原酶时,水相pH值、离子强度和种类、CTAB浓度和助表面活性剂浓度等因素对分离效率的影响,并从反胶束微观结构给予解释。结果表明：［CTAB］＝0.02 mol•L-1,正己醇／正辛烷(V/V)＝1：5,萃取pH＝9.0,反萃pH＝7.0,萃取［KBr］＝0.1 mol•L-1,反萃［KBr］＝1.5 mol•L-1,反萃取加15％乙醇(V/V)时,萃取率接近100%,反萃取活性回收得率在80%以上。商业用酶的纯化倍数最高为1.97倍,粗酶为7.15倍,且粗酶纯化后比活在200U／mg以上,电泳分析证实了纯化效果,显示了很好的工业前景。     

重组MBP-SUV39H1在大肠杆菌中表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中获得具有甲基转移酶活性的重组MBP-SUV39H1蛋白。[方法]通过在大肠杆菌中同时表达异染色质蛋白1(HP1)与重组MBP-SUV39H1蛋白的方法,实现了MBP-SUV39H1的表达,采用his亲和纯化与分子筛Superdex200(SD200)两步分离纯化方案,并利用质谱和ELISA检测MBP-SUV39H1的甲基转移酶活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达了MBP-SUV39H1融合蛋白,经纯化后目的条带单一,并具有良好的甲基转移酶活性。[结论]纯化的具有甲基转移酶活性的MBP-SUV39H1可用于抑制剂筛选等后续研究。     

拟南芥SHORT-ROOT基因稀有密码子分析及其在原核细胞中的表达和纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达拟南芥SHORT-ROOT(SHR)蛋白并纯化。方法:将SHR基因编码区克隆至p GEX-4T-2表达载体,构建重组质粒p GEX-4T-2-SHR并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),表达产物经谷胱甘肽亲和层析凝胶4B分离纯化,SDS-PAGE分析和Western印迹鉴定。结果:SHR融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的86×103,且经Western印迹确证。结论:获得了拟南芥SHR融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z结构域串联体的克隆、表达和筛选

筛选一种高效重组金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)用于制备抗体纯化亲和介质。首先通过基因操作获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因,将目的基因分别克隆至pET-22b表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得不同串联个数的Z结构域基因工程菌,经诱导表达和Ni2+亲和层析纯化得到Z结构域单体和二-五串体蛋白。纯化后的目的蛋白偶联至琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,对人免疫球蛋白G(IgG)进行分离纯化。分析比较Z结构域串联体蛋白产量及其偶联的亲和介质对抗体吸附载量的差异。结果表明,构建的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因工程菌能有效表达目的蛋白,制备的凝胶亲和介质可特异性吸附人IgG。增加Z结构域串联数,重组蛋白产量和单位摩尔数多聚体蛋白吸附载量获得提高,其中,重组四串体蛋白产量大(160 mg/10 g湿菌体),对抗体的吸附载量高(34.4 mg人IgG/mL胶),更适合作为配基用于亲和层析介质的制备。     

反胶束萃取胰蛋白酶的研究

本文以含有反胶束的有机溶剂作为萃取剂,进行了将胰蛋白酶从水相传入有机相,再从有机相传入另一水相的研究。结果表明：影响萃取率的主要因素为水相ｐＨ值、离子强度和种类,以及反胶束溶液中表面活性剂浓度等;在适宜的条件下,酶的单级萃取和反萃取率都很高,显示了良好的工业应用前景。     

蓝细菌PCC6803染色体上的毒素蛋白Slr0664与抗毒素蛋白Ssr1114的相互作用

【目的】证明蓝细菌PCC6803染色体上的毒素-抗毒素系统(TA,toxin-antitoxin system)ssr1114/slr0664中毒素蛋白Slr0664与抗毒素蛋白Ssr1114之的相互作用。【方法】构建在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达H6-Ssr1114或共表达H6-Ssr1114和Slr0664的重组质粒,诱导表达后借助亲和捕捉技术在不同的条件下纯化H6-Ssr1114或共纯化重组蛋白H6-Ssr1114和Slr0664,并通过肽谱分析共纯化的重组蛋白,证明H6-Ssr1114与Slr0664之间存在相互作用。【结果】诱导Slr0664表达对细胞产生毒性作用导致生长抑制或细胞死亡,诱导H6-Ssr1114和Slr0664共表达时细胞能能正常生长,在非变性条件下可纯化共表达的重组蛋白H6-Ssr1114和Slr0664,在变性条件下仅H6-Ssr1114被纯化,肽谱分析结果表明共纯化的的重组蛋白为H6-Ssr1114和Slr0664。【结论】ssr1114/slr0664TA系统中抗毒素蛋白Ssr1114与毒素蛋白Slr0664之间存在相互作用。     

蓝色染料配基亲和纯化眼镜蛇心脏毒素的研究

探索了蓝色染料（Cibacron Blue F3G-A）亲和分离中华眼镜蛇心脏毒素的可能性。采用环氧基活化法制备蓝色染料亲和介质,中性条件下提取眼镜蛇粗毒中的心脏毒素。Tricine系统SDS-PAGE多肽电泳和Lowry法蛋白定量分析纯化效果,发现蓝色染料琼脂糖一步纯化中华眼镜蛇心脏毒素的纯度达到84%,结合量为6.9mg/ml介质。这是首次利用小分子亲和配基纯化心脏毒素。与生物大分子配基相比,活性染料分子具有价格便宜,易于合成,性质稳定,不易降解和适合大规模生产等优点。     

以噬菌体作为配基的一种新型亲和材料的制备方法研究

目的:针对亲和层析材料制备困难的问题,本文拟研究以聚丙烯酰胺冷凝胶为基质,以噬菌体展示多肽为配基制备亲和材料方法的可行性.方法:以低温聚合制备的聚丙烯酰胺冷凝胶作为基质,将筛选噬菌体展示人肝脏cDNA文库获得的噬菌体作为配基,通过两种不同的化学键合方法键合于凝胶表面,制备亲和材料.通过高效液相色谱法(HPLC)分析此亲和材料对药物分子是否具有亲和能力.结果:聚丙烯酰胺冷凝胶具有较大的孔径及良好的亲水性,适用于生物大分子如噬菌体的键合,键合特异噬菌体展示多肽的凝胶材料与键合未筛选噬菌体文库的亲和材料比较,对药物分子具有明显的高亲和力.结论:以展示特异多肽的噬菌体为亲和配基,以聚丙烯酰胺冷凝胶为基质,通过化学键和方法制备亲和材料是具有可行性的,此种亲和材料在生物分子纯化特别是药物分析纯化、蛋白质分离纯化以及细胞分离分析等方面将具有一定的应用前景.     

短芽孢杆菌低温弹性蛋白酶酶学特性分析

旨在从短芽孢杆菌(Bacillus brevis)XZE116发酵液中分离纯化低温弹性蛋白酶,并对酶学性质进行研究。利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析等方法进行纯化。结果显示,分离纯化到了均一的酶蛋白,酶纯度提高了37.21倍,回收率为35.3%。SDS-PAGE及Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析显示酶蛋白为单亚基蛋白,分子量是32.6 kD。最适作用温度25℃。在pH7.5-10.5范围内酶活性及稳定性较高,最适作用pH9.0,Mg2+对酶有明显激活作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂强烈抑制酶活性,表明所纯化到的弹性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶。酶对阴离子表面活性剂(0.1%SDS)、阳离子表面活性剂(0.1%CTAB)和非离子型表面活性剂(1%Tween80)均具有很强的稳定性。鉴于短芽孢杆菌XZE116弹性蛋白酶具有以上优良酶特性,它在肉品嫩化领域具有潜在的应用价值。     

单链抗体scFv-GCN4在大肠杆菌中的重组表达及活性检测

目的:重组表达融合GST或MBP标签的单链抗体scFv-GCN4,对其进行分离纯化,并检测其生物学活性。方法:构建pBAD-MBP-scFv-GCN4及pBAD-GST-scFv-GCN4表达载体,使用大肠杆菌(Escherichia coli)Top10菌株表达并亲和纯化重组蛋白MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4。构建p ET30a-Nus-GCN4载体,使用E.coliBL21(DE3)菌株表达重组蛋白Nus-GCN4及Nus。以重组的GCN4为特异性抗原,通过Pull-down技术和WesternBlot技术,检测MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4的抗体活性及特异性。结果:重组菌株E.coli Top10可高效表达可溶性的MBP-scFv-GCN4和GST-scFv-GCN4蛋白,通过亲和纯化,均得到了高纯度的重组蛋白。重组菌株E.coliBL21(DE3)可高效表达可溶性的Nus与Nus-GCN4蛋白。Pull-down及WesternBlot结果显示,重组蛋白MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4均可以高效、特异地识别重组的GCN4抗原。结论:重组抗体GST-scFv-GCN4及MBP-scFv-GCN4均可在E.coli中高效表达,并且具有良好的抗体活性及特异性。     

用反胶束萃取法提取与分离蛋白质和酶

本文介绍了反胶束萃取的概念、体系、萃取原理及分配影响因素,综述了这一技术在蛋白质和酶的分离与纯化中的应用。     

亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用

亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介绍了亲和标签的组合使用策略,His6-MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。     

重组人基质金属蛋白酶12的原核表达与纯化

目的:利用原核系统表达重组对人基质金属蛋白酶12(MMP-12)并纯化,获得高纯度的人MMP-12蛋白。方法:在MMP-12氨基酸序列的N端加入His标签和肠激酶位点序列,构建MMP-12融合蛋白的原核表达载体,通过表达和亲和纯化获得MMP-12融合蛋白,以肠激酶对融合蛋白进行酶切和二次纯化,获得高纯度的人MMP-12。结果:构建了pET-MMP-12表达载体,并在大肠杆菌中实现了稳定高效表达。重组融合蛋白MMP-12经亲和层析纯化后,相对分子质量为42×10~3,纯度约95%。利用肠激酶对融合蛋白MMP-12进行酶切,酶切效率接近100%,通过二次纯化获得了MMP-12,相对分子质量为40.8×10~3,纯度大于95%。结论:利用原核表达系统高效表达了MMP-12融合蛋白,通过亲和纯化和肠激酶酶切的方法可以获得高纯度的MMP-12,为后续抗体制备和配基筛选奠定了基础。     

纯化小麦α-淀粉酶的亲和层析法

纯化α-淀粉酶有多种方法。Mac Gregor等以及Kruger和Tkachuk分别应用羧甲基纤锥素离子交换层析与丙酮分部、糖元沉淀和离子交换层析,各自从大麦及春小麦分离了α-淀粉酶。Tkachuk又发展了以α-环化糊精为配基的α-淀粉酶分离纯化的亲和层析法。由于亲和层析法简便、快速、高效,因而获得了广泛的应用。我们以β-环化糊精(β-Cyclodextrin)为配基,分离纯化了小麦α-淀粉酶。现介绍如下。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。