汉坦病毒的基因分型及其序列分析

为了探讨从核苷酸水平耐汉坦病毒进行分型,设计两对型特异性引物,采用反转录和聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,对亚太地区１８株汉坦病毒进行了扩增鉴定,并对其中７株汉坦病毒的ＰＣＲ产物进行了测序分析。ＰＣＲ的分型结果表明,Ⅰ型引物只能扩增血清Ⅰ型病毒的ｃＤＮＡ;Ⅱ型引物也只能扩增血清Ⅱ型病毒,其间无交叉反应。采用巢式ＰＣＲ和限制性内切酶验证了ＰＣＲ产物的特异性。序列分析结果表明,Ｒ３６Ｍ片段Ｇ１区的核苷酸序列与血清Ⅰ型病毒代表株７６－１１８的同源性为７８．４％,而与血清Ⅱ型病毒Ｒ２２的同源性为６８．１％;Ｒ３６与汉坦病毒序列同源性的成对比较结果也表明,Ｒ３６与血清Ⅰ型病毒的同源性均高于血清Ⅱ型病毒;Ｌｅａｋｅｙ虽然能被Ⅱ型引物扩增,但其序列与血清Ⅱ型病毒Ｒ２２的同源性仅为４４．９％,故不属于血清Ⅱ型病毒。上述研究结果表明,反转录聚合酶链反应能对多数汉坦病毒准确分型,但最终结果尚有赖于序列分析。     

汉坦病毒基因组G1区部分酶切位点的研究

用分型RT -PCR方法对 34份武汉地区肾综合征出血热患者外周血标本扩增 ,扩增的目的片段为汉坦病毒M片段G1基因部分序列 ,应用HincⅡ和SacI两种限制性内切酶消化扩增产物 ,可将汉坦病毒区分为HTN型和SEO型 ,结果与分型PCR有很高的一致性 ,并可迅速筛查在HincⅡ和SacI酶切位点有基因变异的变异株     

汉坦病毒基因组G1区部分酶切位点的研究

用分型RT-PCR方法对34份武汉地区肾综合征出血热患者外周血标本扩增,扩增的目的片段为汉坦病毒M片段G1基因部分序列,应用Hinc Ⅱ和Sac I两种限制性内切酶消化扩增产物,可将汉坦病毒区分为HTN 型和SEO型,结果与分型PCR有很高的一致性,并可迅速筛查在 Hinc Ⅱ和Sac I酶切位点有基因变异的变异株.     

逆转录—聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性分析对我国肾综合征出血热病毒分型的研究

建立准确、快速、灵敏的汉坦病毒基因分型方法,可弥补传统血清学方法的不足,对防治该病毒所致的肾综合征出血热（HFRS）具有重要意义。本试验采用逆转录－聚合酶反应（RT－PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）和限制性片段长度多态性（RFLP）方法,对流行于我国的两型汉坦病毒代表株－汉滩型（HTNV）76－118 和汉城型（SEOV）R22株进行基因分析。根据病毒DNA序列的电脑软件分析。不同HFRSV囊膜糖蛋白编码基因M节段1199－1497间核苷酸序列上RsaI,TaqI和HindⅢ的酶切位点存在差异（Fig.I),可用于进行限制性内切酶基因多态性分析,以确定HFRV的型别。首先,以一对引物扩增该片段（Fig.2)。然后,分析用这三种内切酶（Fig.3,4,5)进行酶切分型,共分析了从我国不同地区,不同宿主分离的毒株18株,及国际标准毒株2株,酶切图谱显示,这些毒株可以被分为三组（Table.a)：9株可定为HTNV型,8株可定为SEOV型,3株无法确定其型别（X型）,该法分型结构与血清学经典的空斑减数中和试验分型结构基本一致,说明该酶切分型方法具有一定的可行性。     

逆转录-聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性分析对我国肾综合征出血热病毒分型的研究(英文)

建立准确、快速、灵敏的汉坦病毒基因分型方法,可弥补传统血清学方法的不足,对防治该病毒所致的肾综合征出血热(HFRS)具有重要意义。本试验采用逆转录－聚合酶反应(RT-PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)和限制性片段长度多态性(RFLP)方法,对流行于我国的两型汉坦病毒代表株??汉滩型(HTNV)76－118和汉城型(SEOV)R22株进行基因分析。根据病毒DNA序列的电脑软件分析,不同HFRSV囊膜糖蛋白编码基因M节段1199~1497间核苷酸序列上RsaI、TaqI和HindIII的酶切位点存在差异(Fig.1), 可用于进行限制性内切酶基因多态性分析,以确定HFRV的型别。首先,以一对引物扩增该片段(Fig.2)。然后,分别用这三种内切酶(Fig.3,4,5)进行酶切分型。共分析了从我国不同地区,不同宿主分离的毒株18株,及国际标准毒株2株,酶切图谱显示,这些毒株可以被分为三组(Table.1)：9株可定为HTNV型,8株可定为SEOV型,3株无法确定其型别(X型)。该法分型结果与血清学经典的空斑减数中和试验分型结果基本一致,说明该酶切分型方法具有一定的可行性。     

PCR-测序法对啮齿类动物汉坦病毒的检测和基因分型

目的探讨PCR-测序法在啮齿类动物汉坦病毒临床检测中的应用价值。方法以Genbank 7种血清亚型24株汉坦病毒代表性毒株为基础,从病毒基因S片段序列设计引物,采用邻位相连法进行系统进化分析,以该方法对浙江省近年从野生啮齿类动物中临床分离的汉坦病毒毒株进行分型鉴定。结果所建系统发育树将所分析的毒株分为5个区域,引起HFRS的四种血清型具有较稳定的拓扑结构,且能与引起HPS的血清型进行区分。11株实验毒株进行PCR扩增和测序,结果表明该引物具有高度的敏感性和特异性,其中9株浙江省分离的血清型未知毒株的系统发育分析发现其包含引起HFRS的3株HTN和1株SEO血清型,其他5株属两种未知血清型。讨论所建立的PCR-测序法具有用于临床检测汉坦病毒的价值。     

抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。     

幽门螺杆菌的基因分型方法及其应用

近几年,有关幽门螺杆菌（ＨＰ）基因分型方法及其应用的研究取得了很大进展。基因分型方法包括：质粒分型、限制性内切酶分型（ＲＥＡ）、核糖分型、染色体ＤＮＡ脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）分型、多聚酶链反应限制性内切酶消化（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）分型、任意引物ＰＣＲ（ＡＰ－ＰＣＲ）分型、ＰＣＲ单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分型和核苷酸序列分析等。基因分型方法广泛用于ＨＰ的研究,如基因图的构建、感染复发、耐药机     

汉坦病毒沟3株PCR分型

汉坦病毒(HV)沟3株在以往报道的免疫学中和效价检测,为一株中和抗原广谱的毒株。本研究对这一毒株经过两次挑斑纯化,并经PCR方法进行分型检定,初步认为沟3毒株为SEO型HV病毒。     

汉坦病毒单克隆抗体的研制和应用概况

本文介绍了汉坦病毒单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的研究概况,包括已经研制出的汉坦病毒ＭｃＡｂｓ的类型和种类有小鼠源性、大鼠源性ＭｃＡｂ、欧洲棕背鼠平源性、人源性和抗Ｉｄ人源性等多种多样的汉坦病毒ＭｃＡｂ,以及ＭｃＡｂｓ在汉坦病毒的诊断、抗原性分析、对核壳蛋白和包膜蛋白抗原决定簇位点的分析、临床治疗和疫苗研究等方面的应用     

汉坦病毒沟3株PCR分型

汉坦病毒 (HV)沟 3株在以往报道的免疫学中和效价检测 ,为一株中和抗原广谱的毒株。本研究对这一毒株经过两次挑斑纯化 ,并经PCR方法进行分型检定 ,初步认为沟 3毒株为SEO型HV病毒。     

汉坦病毒的新威胁

本文介绍了有关汉坦病毒人到人传播的研究进展。通过对１９９６年在阿根廷的一次汉坦病毒暴发流行的流行病学分析和分子流行病学研究,人们初步认识到汉坦病毒存在着人到人传播的可能性,人到人传播的途径可能有接触病人的污染物、吸入病人的感染性飞沫和性传播三种。作者提出了相应的研究对策和预防国外毒株传入我国以及预防实验室感染的措施。     

汉坦病毒糖蛋白G1酵母双杂交诱饵载体的构建及初步鉴定

拟利用Ras募集系统(RRS)构建并鉴定含汉坦病毒囊膜糖蛋白GI的诱饵载体。将汉坦病毒76—118株囊膜糖蛋白GI基因与Ras基因连接,构建嵌合基因Ras—G1及Ras—G1’(G1’无前导肽序列)。将两个嵌合基因克隆入酵母表达载体pMet25,并转染至酵母温度敏感株cdc25-2,检测其对RRS系统的激活作用。限制性内切酶酶切鉴定表明,Met—G1和Met—G1’载体构建正确。激活试验为阴性。说明Met—G1和Met—G1’载体可用于从cDNA库中筛选汉坦病毒受体。     

汉坦病毒东方田鼠分离株ZT10的M基因序列的特性分析

分析东方田鼠分离汉坦病毒ZT10株M基因分子特征。提取汉坦病毒ZT10株感染细胞的总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增ZT10株M片段全基因,克隆于T载体并测序,对其进行序列分析。结果显示汉坦病毒ZT10株的基因组M片段长度为3651个核苷酸,编码1133个氨基酸。序列分析表明其为Seoul型汉坦病毒。与八株Seoul型汉坦病毒的M片段同源性为84.0%～96.3%,而与HTN型汉坦病毒的同源性则较低,与从田鼠分离的汉坦病毒(ProspectHillvirus,Tulavirus,Khabarovskvirus,Islavistavirus)核苷酸同源性仅为57.5%～60.9%,且与浙江省Seoul型分离株Guo3同源性较低,表明浙江省可能存在着另一Seoul亚型的汉坦病毒。     

汉坦病毒东方田鼠分离株ZT10的M基因序列的特性分析

分析东方田鼠分离汉坦病毒ZT10株M基因分子特征.提取汉坦病毒ZT10株感染细胞的总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增ZT10株M片段全基因,克隆于T载体并测序,对其进行序列分析.结果显示汉坦病毒ZT10株的基因组M片段长度为3651个核苷酸,编码1133个氨基酸.序列分析表明其为Seoul型汉坦病毒.与八株Seoul型汉坦病毒的M片段同源性为84.0%～96.3%,而与HTN型汉坦病毒的同源性则较低,与从田鼠分离的汉坦病毒(Prospect Hill virus, Tula virus, Khabarovsk virus, Isla vista virus)核苷酸同源性仅为57.5%～60.9%,且与浙江省Seoul型分离株Guo3同源性较低,表明浙江省可能存在着另一Seoul亚型的汉坦病毒.     

汉坦病毒结构蛋白的鉴定及其应用

对差速离心纯化的汉坦病毒R84-1毒株进行了SDS-PAGE和免疫印迹试验。发现有67k和43k两条蛋白区带能与汉坦病毒抗体起反应。经单克隆抗体鉴定,67k多肽可能属病毒囊膜蛋白,43k多肽未定。用免疫印迹法对出血热患者进行检测,初步证明野鼠型感染者具有上述两种蛋白抗原的抗体,大鼠型患者仅具有67k蛋白的抗体,这对出血热患者血清学分型有重要意义。     

汉坦病毒结构蛋白抗原表位的研究进展

汉坦病毒结构蛋白抗原表位的研究对于阐明该病毒结构蛋白的结构与功能及其基因工程疫苗研制至关重要,本文综述了近年来汉坦病毒抗原表位研究中应用的各种生物新技术以及汉坦病毒结构蛋白B细胞表位和T细胞表位的最新进展。     

汉坦病毒受体

汉坦病毒感染可引起两种严重威胁人类生命的传染性疾病:肾综合征出血热(HFRS)和肺综合征出血热(HPS)[1,2],这两种疾病都与急性血小板减少和血管渗透性变化有关[3].因此,弄清汉坦病毒与宿主细胞的相互作用及其机制,对控制汉坦病毒性疾病显得尤为重要.整合素对维持血管壁的渗透性和完整性具有重要作用.一种整合素可以在不同的细胞上表达,同一种细胞也可以表达多种不同的整合素,并且不同类型整合素的作用也各有不同.在汉坦病毒与内皮细胞相互作用研究中,细胞整合素受体起到了关键性的作用,致病性汉坦病毒通过细胞膜上β3整合素感染细胞,而非致病性汉坦病毒通过细胞膜上β1整合素感染细胞[4,5].这些都为汉坦病毒的受体和发病机制研究奠定了一定的基础.本文拟对该研究近况作一综述,为汉坦病毒致病机制的深入研究提供参考.     

应用聚合酶链反应对我国不同来源肾综合征出血热病霉的型别分析

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）,对分离自不同地区、不同宿主来源的２６株肾综合征出血热病毒进行了分型,其中包括４个型别的国际标准株,用异硫氰酸胍－酚－氯仿方法从感染的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞中提取总ＲＮＡ,设计了５对寡核苷酸引物,一对为汉坦病毒特异性引物;４对为不同型特异性引物。ＰＣＲ分型表明,２６株中除１株Ｒｒ可同时被汉坦（ＨＹＮ）和Ｓｅｏｕｌ（ＳＥＯ）两型特异性引物扩增外,其余２５株分别只被４个型别引物中的一个所扩增,依次为ＨＴＮ１６株,ＳＥＯ７株,Ｐｕｕｍａｌａ（ＰＵＵ）１株,ＰｒｏｓｐｅｃｔＨｉｌｌ（ＰＨ）１株。ＰＣＲ分型的结果与空斑减少中和试验完全一致,表明ＰＣＲ可以对肾综合征出血热病毒准成分型。应用限制性内切酶分析了扩增产物,结果与理论基本一致,证实了扩增产物的特异性。     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G1基因重组腺病毒载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

拟构建汉坦病毒Gl基因重组腺病毒载体并在VeroE6细胞中表达,为汉坦病毒基因疫苗的研究提供实验基础。PCR法从含汉坦病毒-76118株M基因的M56质粒扩增糖蛋白G1基因片段,利用穿梭质粒pShuttle,将其克隆入Adeno—X病毒DNA,获得重组腺病毒DNA,转染HEK293细胞,包装、扩增后得到汉坦病毒Gl基因重组腺病毒原种,感染VetoE6细胞,用IFA法和ELISA法检测表达产物。得到了含汉坦病毒G1基因的重组腺病毒,其滴度约为10^11pfu／ml,感染VeroE6细胞后检测到汉坦病毒糖蛋白G1的表达。