2DE-MS中膜蛋白质组的研究进展

2-维凝胶电泳(2DE)具有高分辨率、高通量等特点,已被广泛地用于蛋白质组的研究.然而,2DE-MS在膜蛋白质组学研究方面却有其局限性,主要因为:膜蛋白具有低丰度、难溶、等电点时易沉淀、难酶解等特点.然而随着亚细胞分离技术和直接的生化方法富集等技术的发展,低丰度问题得到了极大的改善;增溶剂(尿素,硫脲),新的两性离子和非离子去垢剂,以及有机溶剂等的利用极大地改善了膜蛋白质组的溶解性能;同时,一些新的2DE技术的利用扩大了常规2DE的分离范围.在膜蛋白裂解方面,将酶解法与化学法(CNBr)相结合,另外先进的质谱技术的发展使得膜蛋白质组的研究在最近几年取得了较大的发展.现对2DE-MS途径中,膜的富集、膜蛋白的提取、分离、酶解、鉴定方面的进展进行综述.     

基于谱图库的蛋白质鉴定策略研究进展

基于质谱的蛋白质组学快速发展,蛋白质质谱数据也呈指数式增长。寻找速度快、准确度高以及重复性好的鉴定方法是该领域的一项重要任务。谱图库搜索策略直接比较实验谱图与谱图库中的真实谱图,充分利用了谱图中的丰度、非常规碎裂模式和其他的一些特征,使得搜索更加快速和准确,成为蛋白质组学的主流鉴定方法之一。文中介绍基于谱图库的蛋白质组质谱数据鉴定策略,并针对其中两个关键步骤——谱图库构建方法和谱图库搜索方法进行深入介绍,探讨了谱图库策略的进展和挑战。     

尿液蛋白富集方法的比较

人尿液中蛋白含量低,在进行质谱分析时易被高丰度蛋白掩盖。因此,发展高效和高选择性的富集方法,是实现尿蛋白标记物深度覆盖的必要前提。探究不同实验方法对尿液蛋白富集和尿蛋白质组的影响尤为重要。本研究采用超滤法、硝酸纤维素膜富集法和饱和硫酸铵沉淀法,等体积各处理5例健康志愿者和膀胱癌患者10 mL尿液样本,富集尿液蛋白,SDS-PAGE分离尿蛋白,比较不同方法纯化的效率;通过质谱分析,比较不同纯化方法的肽段鉴定效果,确定针对尿液蛋白质组蛋白的最佳富集方法。相对于超滤和硝酸纤维素膜富集法,饱和硫酸铵沉淀法成功地应用于健康人尿蛋白的富集和质谱检测,在保证回收蛋白质量的前提下,可减少高丰度白蛋白的干扰,富集更多低丰度蛋白,提高了质谱鉴定的灵敏度。综上所述,饱和硫酸铵提取尿蛋白的效果较好,该方法具有大规模处理尿液、提高蛋白质组学筛选临床诊断标记物研究的应用潜力。     

真核细胞质膜蛋白质组研究进展

细胞膜（质膜）蛋白质是细胞的“门铃”与“门户”,是许多药物的作用靶标。细胞质膜蛋白质组的研究正成为蛋白质组研究的热点,这方面的研究有利于具有重要功能的低丰度蛋白质的发掘,为药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而,质膜蛋白质组的研究在强疏水性跨膜蛋白质和低丰度膜蛋白质的分离和鉴定上遇到了方法学的挑战。本文对质膜及其微区的纯化、质膜蛋白质组的分离与鉴定、生物信息学,以及亚细胞定位研究的近期进展作扼要介绍。     

质谱兼容的蛋白质银染色法

蛋白质组学是对蛋白质组进行研究的一门新兴学科。它可以揭示细胞内蛋白质组成成分与修饰状态的动态变化．研究蛋白质之间的相互作用．从全局的高度来研究代谢．发育以及调控等复杂的问题。 由于蛋白质组学研究范围十分广泛,所需要的技术手段也多种多样,如双向凝胶电泳（2-DE）．色谱．蛋白质芯片、质谱以及生物信息学等。2-DE分离蛋白质．通过生物质谱以及生物信息学手段对蛋白质进行鉴定是目前最常用的一种研究策略。由于该套技术平台中影响因素较多．很多初学者难以快速掌握．所以本实验方法系列讲座将详细介绍这一常规技术平台中的多项经典实验方案（样品制备．2一DE、染色、质谱鉴定等）．并着重对一些常见问题与难点进行深入的探讨。此外,本实验方法系列讲座还将涉及近年来刚刚兴起的大规模的蛋白质组自动分析系统——液相色谱-质谱联用．旨在为研究者拓宽实验方法的视野。[编者按]     

肝癌亚细胞结构的蛋白质组分比较分析

运用亚细胞蛋白质组学的研究策略,分离纯化亚细胞结构,可以提高低丰度蛋白质在双向电泳中检出的数量。通过对比分析肝癌细胞与正常肝细胞线粒体、细胞核蛋白质组的差异表达情况,为肝癌发病机理的研究提供更多、更有价值的信息。以体外培养的人体肝癌细胞QGY-7703与正常肝细胞LO2为研究模型,通过超离心的方法分离细胞的线粒体和细胞核。双向电泳分离线粒体和细胞核的蛋白质,图像分析筛选差异表达蛋白斑点,MALDI-TOF-MS鉴定蛋白质。从线粒体、细胞核的蛋白质电泳图谱中筛选出54个候选差异表达的蛋白质斑点,质谱鉴定出22种差异表达蛋白质,其中17种在肝癌细胞中表达上调,5种在肝癌细胞中表达下调。筛选出的差异表达蛋白质涉及到细胞的能量代谢、蛋白质合成、细胞骨架与核骨架的改变、mRNA的加工成熟及凋亡调控等许多方面,表明癌变细胞的组织结构和代谢状态都发生了很大的变化。     

质谱兼容的蛋白质银染色法

蛋白质组学是对蛋白质组进行研究的一门新兴学科。它可以揭示细胞内蛋白质组成成分与修饰状态的动态变化．研究蛋白质之间的相互作用．从全局的高度来研究代谢．发育以及调控等复杂的问题。 由于蛋白质组学研究范围十分广泛,所需要的技术手段也多种多样,如双向凝胶电泳（2-DE）．色谱．蛋白质芯片、质谱以及生物信息学等。2-DE分离蛋白质．通过生物质谱以及生物信息学手段对蛋白质进行鉴定是目前最常用的一种研究策略。由于该套技术平台中影响因素较多．很多初学者难以快速掌握．所以本实验方法系列讲座将详细介绍这一常规技术平台中的多项经典实验方案（样品制备．2一DE、染色、质谱鉴定等）．并着重对一些常见问题与难点进行深入的探讨。此外,本实验方法系列讲座还将涉及近年来刚刚兴起的大规模的蛋白质组自动分析系统——液相色谱-质谱联用．旨在为研究者拓宽实验方法的视野。     

番茄幼苗盐胁迫响应蛋白质组分析

采用营养液栽培,以盐敏感型番茄品种M82为试材,利用双向电泳(2-DE)研究盐胁迫处理下幼苗叶片蛋白质的表达谱,并采用基质辅助激光解析飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术进行差异蛋白质的分离及质谱鉴定。结果表明:(1)盐胁迫处理下,利用2-DE获得差异显著蛋白点20个,其中17个蛋白质点丰度上调表达,3个蛋白质点丰度下调表达。(2)通过质谱分析和蛋白质NCBInr数据库检索,共鉴定出19个差异蛋白,分别为果糖-二磷酸醛缩酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等及3个功能未知蛋白;这些鉴定出的差异蛋白质与能量代谢、光合作用、蛋白合成、氧化还原平衡等过程相关,暗示所分离鉴定的蛋白可能参与了番茄的盐胁迫响应,为进一步研究番茄抗逆机制奠定基础。     

蛋白质组中蛋白质鉴定技术的研究近况

蛋白质组学的核心内容之一就是蛋白质的鉴定,基于双向凝胶电泳的图象分析技术可以对组织细胞蛋白质表达的量、表观分子量和等电点等特性进行初步的鉴定,但是对于蛋白质的结构和功能必须借助其它技术手段。目前逐渐形成了以生物质谱为核心的鉴定技术,蛋白质微测和氨基酸组成分析在表达模型分析中也有应用。关于蛋白质组功能模式研究目前可用的方法有酵母双杂交、噬菌体展示、生物传感芯片质谱、蛋白质工程中的定点突变技术等。这些技术对推动蛋白质组学的发展起了一定作用,但是单一技术通常不能确切的鉴定某一蛋白质,常需联合应用几种技术才能准确的鉴定蛋白质。     

基于高覆盖(磷酸化)蛋白质组对人胚胎干细胞干性维持调控网络的解析

目的:对人胚胎干细胞H9的(磷酸化)蛋白质组进行鉴定和深入分析,探讨维持人胚胎干细胞干性的核心调控网络。方法:利用新近发表的TAFT磷酸化肽段富集策略和高精度质谱鉴定技术,采用无标定量方法对H9细胞(磷酸化)蛋白进行定量分析;结合MOTIFX、iGPS、IPA等多种生物信息学分析软件,分析H9细胞的磷酸化基序-激酶、转录因子-靶基因调控网络。结果:获得了目前高度覆盖的H9细胞(磷酸化)蛋白质组数据集,鉴定到8674种蛋白质,其中3898种能够发生磷酸化修饰,包括13 676条磷酸化肽段,高可信度(class 1)磷酸化位点有11 870种。与已有的H9细胞磷酸化蛋白质组数据相比,其中2247种磷酸化蛋白质和10 025种磷酸化位点是本研究新鉴定到的。基于基序和激酶预测分析,推导出与干性维持相关的已知转录调节因子的新的磷酸化修饰基序以及调控其发生磷酸化的激酶。结合多能性转录因子对靶基因的调控信息,构建了多能性调控分子磷酸化修饰及其转录调控的核心网络。此外,还对特定位点的磷酸化修饰水平及其对应蛋白的总体丰度水平进行了比较及功能分析。基于各自的百分位数,比较磷酸化修饰水平与其对应蛋白的总体丰度,发现具有高丰度但低磷酸化修饰水平的蛋白倾向于参与物质转换或物质运输等生物过程,而低丰度但高磷酸化水平的蛋白质倾向于参与信息转导或调控过程。结论:提供了人胚胎干细胞H9高覆盖的(磷酸化)蛋白质组数据,这些数据有助于深入了解蛋白质磷酸化修饰在胚胎干细胞干性维持中所发挥的重要作用,为胚胎干细胞基础和应用研究提供了宝贵的数据资源。     

细胞质膜蛋白质组学

随着基于质谱的大规模蛋白质鉴定技术的建立,蛋白质组学得到迅速发展。同时由于质膜在细胞生命活动中的重要作用,质膜蛋白质组学逐渐兴起,并发展成为蛋白质组学研究中的重要组成部分。但由于膜蛋白尤其是内在膜蛋白的强疏水性、低丰度,造成蛋白质提取、分离和鉴定相对困难,使质膜蛋白质组成为蛋白质组研究中的一个技术难点。     

生物活性肽蛋白质组分分离与鉴定方法的建立

目的:评估大规模蛋白质组分离与鉴定技术策略在生物活性肽研究中的应用价值。方法:采用全溶液酶解及胶内分离与酶解方法分离生物活性肽;肽段离子阱串联质谱鉴定时,采用碰撞诱导解离与电子转移解离2种互补的肽段碎裂模式。结果:几种方法联用,鉴定到复杂生物活性肽样品中236个多肽大分子;不同分离和鉴定策略显示出良好的互补性,基于凝胶电泳分离的策略提供了最好的鉴定效果。结论:大规模的蛋白质组学分离与鉴定技术策略可以有效应用于生物活性肽组分的表征。     

蛋白质组研究的现状与展望

蛋白质组是后基因组时代出现的一个新兴研究领域。蛋白质组的研究主要是先通过双向凝胶电泳等方法分离蛋白质,然后用质谱等技术进行鉴定。它是后基因组重要的研究方向之一,具有巨大的商业应用前景,将会推动整个生命科学的发展。蛋白质组研究取得了很大进展,已经成为生物技术中的一个重要领域。     

小鼠晶体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究

目的应用双向电泳和质谱技术研究5周龄小鼠晶体蛋白质组。方法提取小鼠晶体总蛋白,进行固相pH梯度（IPG）等电聚焦双向电泳,胶体考马斯亮蓝R-250染色,使用PDQuest7．30图像分析软件分析电泳图像。选择主要蛋白点胶上酶解,应用基质辅助激光解析电离飞行时间／飞行时间（MALDI—TOF／TOF）仪器进行串联质谱（MS／MS）鉴定。结果上样量为882μg和190μg时,分别检测370±41蛋白点（n=3）和57±5个蛋白点（n=3）。高上样量能够较好地分离晶体低丰度蛋白,如念珠状纤维结构蛋白BFSP;低上样量可很好地分离高丰度蛋白-晶体蛋白（包括αA、αB;βA1～βA4;βB1～βB3;γA～γF和γS等）。质谱鉴定得到1种细胞骨架蛋白和16种高丰度晶体蛋白。结论双向电泳和质谱技术有效考察了晶体总蛋白质,为分析白内障形成过程中蛋白质的表达改变提供了新的方法和途径。     

毛细管电泳技术在蛋白质翻译后修饰中的应用

蛋白质中翻译后修饰蛋白的鉴定是蛋白质组学研究的主要内容之一。毛细管电泳技术由于其高分辨能力、低样品上样量、易操作性和较少的分析时间等特点,迅速发展成为一种重要的分离技术。通过毛细管电泳与质谱连用,可以得到许多关于蛋白质鉴定、纯化和结构改变方面的十分有价值的信息。对毛细管电泳技术进行了简单介绍,并且就其在蛋白质磷酸化和蛋白质糖基化研究中的应用进行了综述。     

蛋白质组研究新前沿：定量蛋白质组学

在过去几年里,蛋白质组研究取得了令人鼓舞的进展,2DE-MS途径的自动化,多维色谱整合串联质谱的使用,弥补了一些用双向凝胶电泳分离蛋白质的技术缺陷;从稳定同位素标记到ICAT战略的提出,为准确定量在细胞或组织中发挥重要调节功能的低丰度蛋白质提供了一个较为理想的方法。同时,蛋白质芯片技术的不断发展,也极大的丰富了定量蛋白质组学的研究。就定量蛋白质组学及其相关技术研究进展作一简要综述。     

“自顶向下(top-down)”的蛋白质组学——蛋白质变体的规模化鉴定

高分辨率质谱技术的快速发展使得"自顶向下"的蛋白质组学(top-down proteomics)研究逐渐成熟起来.在完整蛋白质水平上研究蛋白质组可以提供更精准、更丰富的生物学信息,特别是对于蛋白质上发生了多种关联性的翻译后修饰的情况.另外,由于基因突变、RNA可变剪接和大量蛋白质翻译后修饰的存在,同一个基因往往最终会产生多个"蛋白质变体"(proteoform),而要准确地鉴定这些蛋白质变体,也离不开"自顶向下"的蛋白质组学.在蛋白质水平上的分离技术、质谱技术与生物信息学技术是完整蛋白质鉴定最关键的三项技术.高效的分离技术是实现规模化蛋白质变体鉴定的前提,有效的质谱碎裂是提供可靠鉴定的核心,而快速准确的质谱鉴定算法则是数据分析效率的保障.本文对这三项技术进行了详细总结,重点集中在生物信息学相关技术上,包括对完整蛋白质的质谱数据预处理、数据库搜索鉴定以及翻译后修饰定位等几个计算问题的讨论.     

亚细胞蛋白质组研究进展

运用蛋白质组学方法对亚细胞组分进行研究是目前的研究热点。传统的亚细胞分离技术结合质谱鉴定技术为亚细胞蛋白质组学的研究提供了技术平台。本文对快速发展的亚细胞蛋白质组研究进展及其所揭示的生物学意义进行了综述。     

蛋白质组研究中的分析技术

蛋白质组分析技术已在生物科学各领域被广泛应用,蛋白质组的研究已成为目前国际上的前沿和研究热点。概述了蛋白质组研究中的常用分析技术,包括样品制备、双向凝胶电泳、凝胶图像分析、质谱鉴定及数据库检索等。直观地列出了蛋白质组研究的技术体系流程图。各种分析技术的连用和分析过程的自动化将是蛋白质组研究技术的发展方向。     

天麻蛋白质的双向电泳和肽质量指纹谱分析与鉴定

采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱技术对天麻染菌球茎皮层和不染菌的新生球茎皮层进行了比较蛋白质组分析与鉴定。双向电泳后在分子量 1 2～97kD、等电点 3～ 1 0范围内 ,每块胶分离到约 90 0个蛋白质点。对新生球茎中表达量明显增加的 5个蛋白质点用基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进行肽质量指纹谱的分析 ,并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测 ,初步认为第 4号蛋白点是一个与转录有关的RNA结合蛋白。同时本文在天麻蛋白质组样品制备、数据库检索策略以及蛋白质鉴定成功率等方面进行了探讨。