葡萄球菌蛋白A活性机制与现代应用

葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A,SPA)是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁上的一种黏连蛋白.经过几十年的研究,由于其对免疫球蛋白IgG的亲和特性,SPA已作为一种工具在抗体的检测、纯化以及疾病诊断中得到了广泛应用.SPA衍生物的构建适应了现代生产的需要,改造后的SPA可以与多种报告分子相偶联,使得免疫诊断更加快速准确.本文综述了SPA基于其免疫学特性,在抗体纯化和现代免疫分析应用中的发展状况及前景.     

兔抗五种鱼免疫球蛋白抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗鱼类免疫球蛋白抗体并进行辣根过氧化酶标记,为鱼类血清学检测系统的建立提供工具。方法利用proteinA亲和层析的方法纯化鱼血清免疫球蛋白,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鱼免疫球蛋白的抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鱼免疫球蛋白的抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting来考察标记抗体与其他常见鱼类血清蛋白间的交叉反应。结果纯化了鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗这五种鱼免疫球蛋白的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼类免疫球蛋白的抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶10000左右,Western blots显示标记抗体与部分其他鱼类免疫球蛋白之间存在不同程度的交叉反应。结论成功制备了HRP标记的兔抗鱼类免疫球蛋白抗体,为鱼类血清学检测体系的建立提供了工具。     

一种新型免疫亲和层析介质的研究

以国产琼脂糖介质为原料,合成了含肼琼脂糖介质。抗体Fc段的糖基经氧化后,可与此种含肼琼脂糖介质偶联,制成高亲和率的免疫亲和层析介质。与溴化氰法相比,这种对抗体上的糖特异的偶联方法制成的免疫亲和层析介质,容量高、稳定性强。用这种含肼琼脂糖介质分别与肿瘤坏死因子和γ-干扰素等的抗体偶联,制成的免疫亲和层析介质可用于分离纯化相应的基因工程产物抗原。     

抗溶葡萄球菌酶N端合成多肽抗体的制备与鉴定

为了制备抗溶葡萄球菌酶N端合成多肽抗体,合成了溶葡萄球菌酶(lysostaphin)分子的3-13位的11个氨基酸的多肽(THEHSAQWLN),并利用戊二醛双功能试剂将人工合成多肤成功地与KLH进行偶联.免疫新西兰兔制备抗lysostaphin合成多肽的抗体,并经亲和层析进行了纯化.对此抗体进行鉴定的结果表明,抗溶葡萄球菌酶合成多肽抗体可与重组溶葡萄球菌酶分子发生特异性反应,并可用于蛋白免疫印迹.该抗体的制备为使用亲和层析纯化溶葡萄球菌酶提供了有用的配基.     

恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白自身偶联条件的优化及其聚体蛋白的制备

目的探讨影响恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白(25 k Da Plasmodium falciparum sexual stage protein,Pfs25)偶联的因素,优化Pfs25蛋白的偶联反应条件,制备具有免疫原性的Pfs25纯化聚体蛋白。方法通过对偶联反应时Pfs25蛋白浓度、偶联反应的酸碱度、不同的缓冲液及偶联试剂添加方式的探索,考察不同反应条件对Pfs25蛋白偶联的影响。凝胶过滤层析纯化Pfs25偶联反应产物,双抗体夹心ELISA和SDS-PAGE对凝胶柱洗脱液进行检测,Western blot检测纯化的Pfs25聚体蛋白。结果 Pfs25蛋白偶联反应选择1/15 mol/L Na_2HPO_4-KH_2PO_4为偶联缓冲液,反应体系在pH 5.6～6.0时偶联效果更好,而Pfs25蛋白反应质量浓度为25 mg/m L时可获得最佳的Pfs25偶联效率(68.67%),凝胶过滤层析法获得Pfs25聚体蛋白,经双抗体夹心ELISA和Western blot检测,形成的Pfs25聚体蛋白保持了与Pfs25蛋白相同的抗体结合能力。结论优化了Pfs25蛋白最佳偶联反应条件,获得具有免疫原性的Pfs25纯化聚体蛋白。在形成Pfs25聚体中,以二聚体(Pfs25)2为主要形式,兼有少量三聚体(Pfs25)3和四聚体(Pfs25)4。     

天花粉蛋白及其与抗体的复合物对蛋白质合成的抑制作用(简报)(英文)

天花粉蛋白在无细胞系统中显示强烈的抑制蛋白质生物合成的能力,其活性与经巯基试剂还原开裂的蓖麻毒蛋白相当。天花粉蛋白对BEL-7402人肝癌细胞的毒性甚低,但当它通过二硫键与抗肝癌单抗Hepama-1偶联后,其毒性增强五十倍。张学军和王家槐不久前发现天花粉蛋白与蓖麻毒蛋白A链的一级结构有很大的相似性~[5]。我们的实验结果与他们的发现互相印证。天花粉蛋白与抗体偶联后,可能通过抗体与细胞表面抗原的结合而内化,从而增强了它的细胞毒性。考虑到天花粉蛋白与其他植物单链致核糖体失活蛋白(RIPs)有不少特性十分相似,我们推断天花粉蛋白是RIP家族中的一员。天花粉蛋白与抗体偶联过程中,双功能试剂SPDP的修饰使天花粉蛋白的活性降低一个数量级,似乎意味着天花粉蛋白上的某些氨基可能对其活性至关紧要。发展新的偶联方法的工作正在进行。如能在双功能试剂修饰后保留其大部分活性,天花粉蛋白作为免疫毒素的“弹头”药物可能颇具潜力。     

金黄色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z结构域串联体的克隆、表达和筛选

筛选一种高效重组金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)用于制备抗体纯化亲和介质。首先通过基因操作获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因,将目的基因分别克隆至pET-22b表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得不同串联个数的Z结构域基因工程菌,经诱导表达和Ni2+亲和层析纯化得到Z结构域单体和二-五串体蛋白。纯化后的目的蛋白偶联至琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,对人免疫球蛋白G(IgG)进行分离纯化。分析比较Z结构域串联体蛋白产量及其偶联的亲和介质对抗体吸附载量的差异。结果表明,构建的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因工程菌能有效表达目的蛋白,制备的凝胶亲和介质可特异性吸附人IgG。增加Z结构域串联数,重组蛋白产量和单位摩尔数多聚体蛋白吸附载量获得提高,其中,重组四串体蛋白产量大(160 mg/10 g湿菌体),对抗体的吸附载量高(34.4 mg人IgG/mL胶),更适合作为配基用于亲和层析介质的制备。     

树鼩IgG纯化鉴定及其多克隆抗体制备和检测

目的:比较两种抗体纯化方法在分离纯化树鼩IgG抗体的应用,制备抗IgG的多克隆抗体及检测。方法:采用两种商品化IgG抗体纯化试剂盒分离树鼩血清IgG抗体,采用SDS-PAGE和蛋白定量测定提纯IgG。以树鼩IgG作为抗原,与等量弗氏完全佐剂(第一次)、弗氏不完全佐剂(第二次)混合皮下注射免疫兔,对分离血清进行多克隆抗体纯化及Western Blot检测及定量分析。结果:两种方法均能有效分离纯化树鼩IgG,在经过Montage PROSEP-A试剂纯化后的IgG在纯度和含量方面均优于Protein A/G Matrix试剂。通过纯化后的树鼩IgG免疫兔制备的抗IgG抗体能有效识别树鼩IgG。结论:纯化的树鼩IgG具有良好免疫原性,由此制备的抗体具有高度特异性。研究结果为利用树鼩作为实验动物提供了必要的实验基础。     

爬行动物的体液免疫

爬行动物针对颗粒性和可溶性抗原,能够快速、有效的产生抗体。爬行动物血清中的抗体主要包括高分子量的免疫球蛋白（HMWIg）和不止一种的低分子量免疫球蛋白（LMWIg）,爬行动物中还有在亲代和子代间传递的免疫球蛋白Ig Y。目前爬行动物免疫球蛋白的纯化方法主要有：硫酸铵沉淀法、联合凝胶过滤层析和离子交换层析法、Protein A亲和层析法。研究爬行动物体液免疫对研究动物免疫的进化及对病原控制具有重要意义。     

硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。     

姜老师信箱

蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,您的授课让我获益良多。学习期间我曾向您请教过用NHS柱偶联抗原来纯化多克隆抗体的问题。关于偶联抗原蛋白量的计算,NHS柱商品说明书上显示配体密度为16-23μmol/ml干介质(ligand density:16-23μmol/ml drained medium),我使用的抗原分子量约为     

用免疫亲和层析法纯化萝卜 PHGPx 天然蛋白

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (RsPHGPx) 是一个定位于线粒体的蛋白质 . 为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的 RsPHGPx. 用重组 RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗 RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组 RsPHGPx 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗 RsPHGPx 的抗体 . 将纯化好的抗体偶联到一个 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗 RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱 . 经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案 . 按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质 . 免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗 RsPHGPx 的抗血清特异识别 . 酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的 PHGPx 活性 . 这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的 RsPHGPx 天然蛋白 . 这是首个关于定位于植物细胞器的 PHGPx 蛋白纯化的报道 . 这一结果为准确测定 RsPHGPx 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物 PHGPx 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究 .     

磷酸酪氨酸蛋白专一抗体的制备和纯化

以偶联磷酸化酪氨酸的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为免疫原免疫兔获得抗血清。自抗血清中分离获得抗体。自酪胺合成磷酸酪胺,并偶联到溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上。抗体经磷酸酪胺－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和柱纯化,所得抗体专一性强,Ｄｏｔ ｂｌｏｔ显示：抗体仅对酪氨酸磷酸化的蛋白质包括酪氨酸磷酸化的血清白蛋白,溶菌酶,卵清蛋白起抗原抗体反应,而不识别非酪氨酸磷酸化的溶菌酶,卵清蛋白,也不识别作为免疫     

A蛋白定向固定抗体用于椭偏光学生物传感器免疫检测

椭偏光学生物传感器是在椭偏光学显微成像技术的基础上发展的一项生物传感技术。它能够直接观测固体表面上的生物分子面密度,毋需任何标记辅助,适合发展成为一种无标记免疫检测技术。研究了在硅片表面上通过A蛋白定向固定抗体分子用于椭偏光学生物传感器免疫检测的可能性。实验结果表明,通过A蛋白固定抗体得到的抗体膜层的均一性和固定量的重复性能够保证椭偏光学生物传感器免疫检测结果的质量。通过A蛋白定向固定的抗体的抗原结合位点趋向一致,显著提高了抗体与抗原结合的能力。此外,通过蛋白A固定的免疫球蛋白G分子能够结合更多的多克隆抗体分子说明通过A蛋白固定的蛋白质分子能够较好地保持其空间构象。     

尿素解离法降低新型冠状病毒IgM和IgG检测结果假阳性的效果评价

探讨引起新型冠状病毒(SARS-CoV-2)免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)抗体检测结果假阳性的干扰因素,改良检测方法,完善实验室检测方案。本研究收集2020年1月2日至2020年3月5日就诊于川北医学院附属医院及南充市中心医院的门诊及住院患者血清样本共74份,其中19例为SARS-CoV-2核酸检测确诊阳性,10例为其他呼吸道病毒IgM抗体阳性,10例肝炎病毒抗体IgM阳性,20例类风湿因子IgM阳性,15例抗核抗体阳性。采用胶体金免疫层析法(试剂A、试剂B)分别对研究对象血清进行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测,并对结果为SARS-CoV-2 IgM或SARS-CoV-2 IgG阳性的病例进行分析,发现造成检测结果假阳性的可能因素。再采用合适浓度的尿素对检测为阳性结果的血清及3例SARS-CoV-2 IgM阳性的COVID-19早期患者血清进行解离,解离后分别重新测定SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体。采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计学分析。结果显示,19例COVID-19确诊患者血清中,试剂A检出SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体阳性数为15例及18例,试剂B检出SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体阳性数均为12例;20例类风湿因子IgM阳性患者血清中,试剂A检出SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体阳性数为16例及14例;15例高滴度ANA阳性患者血清中,试剂B检出4例SARS-CoV-2 IgG抗体阳性。尿素解离浓度为2 mol/L时,试剂A检出的RF-IgM阳性血清中的16例SARS-CoV-2 IgM抗体有14例转阴,14例SARS-CoV-2 IgG抗体有13例转阴,而试剂A在COVID-19确诊患者血清中检出的SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体均未出现阴转;尿素解离浓度为4 mol/L时,试剂B检出的ANA阳性血清中的4例SARS-CoV-2 IgG抗体全部转阴,而在COVID-19确诊患者血清中检出的的SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体均未出现阴转。另外,经过尿素解离后,试剂A和试剂B在3例COVID-19早期患者血清中检出的SARS-CoV-2 IgM抗体也都未出现阴转。本研究提示,IgM型类风湿因子易造成试剂A检测血清SARS-CoV-2 IgM、IgG结果的假阳性;高滴度的ANA抗体也会引起试剂B检测血清SARS-CoV-2 IgG结果的假阳性。对检测结果假阳性的样本,采取尿素解离方案,能有效降低检测过程中假阳性发生的概率;尿素解离法对COVID-19患者发病早期标本检测灵敏度的影响尚待进一步深入研究。     

人间隙连接蛋白 31 相互作用蛋白Annexin Ⅱ的筛选与证实

间隙连接蛋白 31 (connexin31 , Cx31) 是间隙连接蛋白 (connexin) 家族的一员,目前对于 Cx31 的功能及其调节方式知之甚少 . 采用固相多肽合成的方法合成 Cx31 羧基端一个多肽片段 (250~266) ,经 HPLC 纯化后偶联到匙孔血蓝蛋白,免疫新西兰雄兔后采血检测、并纯化、经蛋白质印迹、细胞免疫荧光染色、免疫沉淀证实得到的抗体为特异性抗 Cx31 的抗体 . 运用制备的抗 Cx31 多克隆抗体免疫沉淀, SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离,蛋白质条带回收,蛋白质胶块酶解, Q-TOF 质谱分析,数据库扫描筛选可能相互作用蛋白,运用抗体 pull-down 实验,筛选到可能相互作用蛋白 annexin Ⅱ,经过免疫共沉淀、细胞免疫共定位等实验证实 annexin Ⅱ与 Cx31 相互作用 .     

蛋白G IgG Fc段结合域的克隆表达及功能研究

旨在研究蛋白G IgG Fc段结合域(PGFB)的克隆、表达及其抗体结合功能,用于抗体的纯化.根据PGFB的氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成了4个寡核苷酸片段.通过重叠延伸PCR方法合成了PGFB DNA片段,测序鉴定后克隆至原核表达系统pET-28a-c(+)上,转化大肠杆菌,获得表达菌株;IPTG诱导表达PGFB,经Ni+-NTA琼脂糖凝胶层析纯化后偶联到琼脂糖凝胶6B上,用其纯化多克隆抗体.结果显示,PGFB在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,纯化后纯度达到90%以上,相对分子量为12.25 kD,与预期值相符.此外,偶联产物纯化多克隆抗体达到了良好的效果,每毫升基质可结合20 mg抗体.本研究克隆构建并高效表达了具有较好抗体亲和能力的PGFB,为多克隆抗体的快速纯化提供了方便.     

姜老师信箱

蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,在上课时听您讲过用Protein A纯化单克隆抗体的效果并不完美,请问这是不是由于纯化后抗体容易形成二聚体或多聚体,而导致活性下降?我还想请教一下:1.如果只     

蛋白质体外表达与进化技术

蛋白质体外表达与进化技术包括核糖体展示技术和mRNA展示技术。与蛋白质体内表达系统相比,体外表达技术可产生较大容量的蛋白质文库（约10^12～10^13左右）,同时在回收编码蛋白质的信息时对文库进行了进化,增加了蛋白质文库的多样性,促进了抗体或配体类蛋白质的亲和成熟能力。该文介绍了蛋白质体外表达技术在新蛋白质（如抗体或配体等）表达筛选中的应用。     

卵黄抗体的分离提取和纯化方法

卵黄抗体性能稳定,具有较强抵抗热酸、碱的能力,室温下可保持6个月的活性,4℃下放置几年活性不减,易于大规模生产等许多优点,卵黄免疫球蛋白的纯化方法 和哺乳动物的纯化方法 不同,包括有机物沉淀法,有机溶剂抽提法,天然胶法和水稀释法等粗提方法;凝胶过滤层析,离子交换层析和亲和层析等精细纯化方法。本文就卵黄抗体的分离和纯化方法的优缺点作一比较。