一种改良宫颈鳞癌原代培养方法的建立

目的:探讨不同培养条件对宫颈鳞癌原代培养的可行性。方法:取确诊为宫颈鳞癌患者的活检或手术标本,通过对消化时间及重悬液量进行改良原代细胞培养,观察鳞癌细胞生长状况,并比较其与传统消化法的细胞生长率,免疫组化进行细胞鉴定。结果:消化时间为3小时,重悬液量为1ml时细胞生长率最高。改良法24小时细胞生长率为61.54%,传统消化法24小时细胞生长率为7.69%(x2=5.14,P<0.05)。活检标本细胞生长率80%,手术标本3例无一例细胞生长。结论:采用消化时间为3小时,重悬液量为1 ml成功建立了宫颈鳞癌原代培养方法,活检标本较手术标本更易培养成功。     

成人宫颈上皮细胞的原代培养及鉴定

目的:探索采用无血清培养基原代培养成人宫颈上皮细胞的方法。方法:以成人的宫颈上皮组织为研究对象,采用胰蛋白酶-EDTA消化法获得宫颈上皮细胞悬液,于上皮细胞专用无血清培养基中培养,采用免疫细胞化学法测定细胞中角蛋白及波形蛋白的表达,对细胞纯度进行鉴定。结果:原代培养10-15天细胞融合达60%,传代至4-6代,细胞出现生长衰退。早期细胞生长状态良好,细胞纯度在90%以上。结论:采用酶消化法及K-SFM无血清培养基培养可获得纯度高的成人宫颈上皮细胞。     

新生SD大鼠皮质神经元的体外培养和鉴定

目的：建立高纯度的新生SD大鼠皮质神经元原代培养方法。方法：取24h内的新生SD大鼠皮质,用木瓜酶和DNaseⅠ共同消化,5％胎牛血清终止消化,吹打分离组织获得单细胞悬液,进行细胞计数,用无血清DMEM／F12种植培养,4h后换成用无血清Neurobasal配制的维持培养液继续培养,尼氏小体染色和免疫荧光法鉴定神经元的纯度。结果：培养第10d,神经元胞体饱满,结构清晰完整,光晕明显,折光性强,可见粗长的树突和轴突,相邻细胞形成紧密网状联系,神经元纯度达到96％以上。结论：经改良和优化,无须添加阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长即能够获得生长状态良好、高纯度的神经元。     

改良组织块消化法建立大鼠气道平滑肌细胞模型

目的：建立改进大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）的体外培养方法,为相关研究提供实验材料。方法：将组织块连续贴壁进行细胞原代培养,胰酶消化传代培养,差速贴壁进行细胞纯化,形态学及免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定。MTT法检测PDGF-BB诱导的ASMC增殖。结果：成功培养大鼠ASMC,以改良组织块消化法最为理想。第四代平滑肌细胞纯度可达95％以上。相差显微镜下培养细胞呈典型“峰谷状”生长。免疫荧光化学染色显示特异性平滑肌肌动蛋白阳性表达。随着PDGF浓度的升高（2-80ng／ml）,MTT比色A490值呈上升趋势。与对照组相比较,80ng／ml、20ng／ml PDGF—BB组有统计学意义（P〈0．01）。结论：改良组织块消化法可缩短培养周期,在充分利用标本的基础上获得大量气道平滑肌细胞。     

原代地鼠肾细胞及狂犬病毒不同培养方式的研究

目的通过比较原代地鼠肾细胞在转瓶、微载体、细胞工厂的3种培养方式的培养效果,为原代地鼠肾细胞选择一种易扩大规模、培养高质量细胞的培养方式,进而提高狂犬病毒的产量。方法消化取得的细胞悬液分别在转瓶、微载体、细胞工厂中培养,通过显微镜观察细胞形态、计数等结果比对培养的差别。结果细胞工厂可以很好地培养原代地鼠肾细胞和狂犬病毒;而细胞在微载体上贴附性差,生长不好。结论实验结果表明细胞工厂可以取代转瓶,用于大规模培养原代地鼠肾细胞扩大狂犬病毒的产量。     

华蟾素对子宫内膜癌HEC-1-B细胞株凋亡和增殖的影响

目的：探讨华蟾素对体外培养子宫内膜癌HEC-1-B细胞凋亡、增殖以及侵袭能力的影响。方法：体外培养HEC-1-B细胞,经不同浓度华蟾素（0．2mg／ml、2mg／ml和20mg／m1）干预24h后,采用MTT法观察细胞生长情况,流式细胞术分析细胞凋亡,Transwell小室检测细胞体外侵袭能力。结果：华蟾素能有效抑制HEC．1．B细胞生长,诱导细胞凋亡。未经华蟾素处理的细胞凋亡率仅为2．5％,经0．2mg／ml、2mg／ml、20mg／ml的华蟾素作用24h后,细胞凋亡率分别为7．4％、44．3％和78．5％。趋势卡方检验x^2=165．4983,P〈0．0001。HEC-1-B细胞经华蟾素作用后,细胞侵袭能力降低。在高浓度时,华蟾素有可能存在细胞毒作用。结论：华蟾素能通过诱导HEC-1-B细胞凋亡,从而抑制HEC-1-B细胞生长,并且降低细胞的侵袭能力。     

NFAT1和TWEAK在宫颈鳞癌及上皮内瘤变中表达的意义

目的：通过观察NFAT1和TWEAK在正常宫颈鳞状上皮、宫颈鳞状上皮上皮内瘤变、宫颈鳞癌中表达,探讨NFAT1和TWEAK表达情况在宫颈鳞癌发生和临床发展中的意义。方法：研究组织病例为档案病理蜡块,应用免疫组织化学技术检测NFAT1和TWEAK的表达;对宫颈鳞癌进行临床分期,分析NFAT1和Tweak表达与临床分期的相关性。结果：免疫组化结果显示,NFAT1阳性表达率在正常宫颈鳞状上皮、cINI级、CINII级、cINIIl级、鳞癌中分别为24．4％,24．5％,29．2％,72．7％,78．4％,各纽总体阳性表达率存在显著性差异,cINIII级与宫颈鳞癌中NFAT1表达率较宫颈正常上皮,CINI级,CINII级与cINIII级显著增高。TWEAK阳性表达率在正常宫颈鳞状上皮、CINI级、CINII级、cINⅢ级、鳞癌中分别为73．4％,66％,73．1％20．4％,19．6％,各组总体阳性表达率存在显著性差异。宫颈正常,CINI级,CINII级与CINIIIN．较CINⅢ与宫颈鳞癌中TWEAK表达率显著增高。NFATI和TWEAK表达相关性具有统计学意义。结论：NFAT1和TWEAK在正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变、宫颈鳞癌中的表达存在差异且两者间表达存在相关性,NFAT1表达增加与宫颈鳞癌发生和肿瘤进展有关而TWEAK表达与宫颈癌发生呈负相关。     

在子宫颈上皮内瘤变和鳞癌组织中CyclinE、Rb基因表达的研究

目的 探讨细胞周期素E（CyclinE）、视网膜母细胞瘤（Rb）基因与上皮内瘤变（CIN）和宫颈鳞癌的关系,及其在癌变过程中的意义。方法 应用免疫组化技术（S-P法）,检测CyclinE和Rb基因产物在各级别CIN77例和宫颈鳞癌40例中的表达状况,并以正常子宫颈鳞状上皮20例做对照。结果 在正常宫颈鳞状上皮、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈鳞癌中,CyclinE的阳性表达率呈逐渐增强趋势,分别为：0．0％、30．0％、75．0％、65．0％、60．0％。正常宫颈鳞状上皮与各级别CIN和宫颈鳞癌之间差异均有显著性（P〈0．01或〈0．005）,CINⅠ与CINⅡ、CINⅢ、宫颈鳞癌组间差异均有显著性（P〈0．005或〈0．01）;Rb基因蛋白的表达率逐渐下调,分别为：100．0％、55．0％、20．0%、24．3%、23．5％,在正常宫颈鳞状上皮与各级别CIN和宫颈鳞癌组间差异均有显著性（P〈0．005）;CINI与CINHI、宫颈鳞癌组间差异有显著性（P〈O．005）。结论CyclinE在正常子宫颈鳞状上皮表达阴性,随着发生CIN从轻到重至宫颈鳞癌,表达呈逐渐增强趋势;表明CyclinE在子宫颈癌变过程中起到重要作用,CyclinE参与CIN的进展及子宫颈癌癌变机制。Rb基因蛋白在正常子宫颈鳞状上皮100％阳性,随着发生CIN从轻到重至宫颈鳞癌,表达呈逐渐下调趋势,甚至消失;表明Rb基因可能主要通过功能性失活参与宫颈鳞癌的发生,并且其在癌变过程中起重要作用。发现CyclinE表达增强和RB基因表达下调或消失,有助于宫颈鳞癌发生的判断及CIN程度和级别的确定。     

细胞周期调控因子在肺癌活检组织中的表达

目的：探讨P^21waf1和CyclinE在肺鳞癌组织中表达,方法：应用细胞周期调控因子P^21waf1、CyclinE单克隆抗体,对54例肺鳞状细胞的纤支镜活检标本和10例正常肺组织进行免疫组化染色研究。结果：在肺鳞癌组织中P^21waf1呈低水平表达,其阳性表达率（11／54）仅为20．4％,在肺鳞癌组织中CyclinE阳性表达率（17／54）为31．5％,低分化及有淋巴结转移的病例,其CyclinE表达量明显高于高中分化及无淋巴结转移的病例。结论：P^21waf1在肺鳞癌组织中呈低表达,CyclinE表达可以作为判断肺鳞癌恶性程度的一个指标。     

青海湖裸鲤体外肝胰细胞原代与传代培养

采用组织块移植培养技术,分别用DMEM和RPM11640培养基对青海湖裸鲤肝胰组织细胞进行原代培养。培养48h组织块周围有细胞迁出,并形成生长晕。培养一周可形成单层细胞。对原代培养的单层细胞用胰蛋白酶-EDTA消化后,传代培养至第四代。确立青海湖裸鲤肝胰细胞培养条件为：培养基为DMEM,培养温度为27℃,pH值为7．0—7．5,原代培养血清浓度为20％,传代培养的血清浓度为10％,无需通入CO2和添加细胞生长因子。     

体外培养小鼠下颌下腺细胞生长特性的实验研究

目的：研究小鼠下颌下腺细胞的培养方法,探讨下颌下腺细胞培养条件及细胞生长特性,为研究干细胞转分化涎腺腺泡细胞以及涎腺再生研究奠定理论基础和技术支持。方法：取2周龄的小鼠,组织块法和消化法分别进行培养,用活细胞观察法和HE染色法记录细胞形态学特征;免疫荧光染色法鉴定;通过生长曲线和细胞倍增时间来比较两种方法对细胞增殖能力的影响。结果：组织块法和消化法均可以成功的培养下颌下腺细胞,（1）组织块法培养的细胞呈卵圆形或多边形,10天左右成铺路石样;消化法培养细胞亦为上皮样细胞,呈多边形,胞质丰富;（2）HE染色下颌下腺细胞呈多边形,胞核明显;（3）Cytokeratin13和AQP5表达阳性,Wimentin表达阴性;（4）组织块法培养细胞增殖相对较平缓,消化法培养细胞增长较迅速;（5）消化法培养倍增时间（1．3471±0．6071）天比组织块法倍增时间（2．1887±1．1503）明显缩短（P〈0．05）;结论：体外可以成功的培养下颌下腺细胞,但是同时证明下颌下腺细胞长期传代较困难,这为研究干细胞转分化涎腺细胞和涎腺再生体内实验提供了理论和实验基础。     

IGF-1对冈田酸所致细胞损伤和Tau蛋白过度磷酸化的保护作用

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对冈田酸(OA)诱导的细胞损伤和tau蛋白过度磷酸化的保护作用。方法:模型组以OA40nmol/L作用于SH-SY5Y细胞24h;IGF-1预处理组分别以100、200和400ng/mlIGF-1预处理2h,再加入OA作用24h。倒置显微镜观察细胞形态学变化;MTT法检测细胞活力;Hoechst染色和分光光度法检测Caspase-3活化程度观察细胞损伤;蛋白免疫印迹法检测tau蛋白磷酸化程度。结果:与模型组比较,IGF-1预处理组细胞形态改善,细胞活力增强,Caspase-3活化程度降低,且磷酸化tau蛋白(Ser396)水平下降。结论:IGF-1可能通过抑制tau蛋白过度磷酸化对OA诱导的细胞损伤具有保护作用。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养和鉴定

目的：探索建立稳定有效的脐静脉内皮细胞体外培养方法。方法：用0．1％II型胶原酶消化分离人脐静脉肉皮细胞,加入含内皮细胞生长因子的M199完全培养液中培养,用胰蛋白酶-EDTA进行消化传代培养,用光镜和免疫组化方法对培养的细胞进行形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后24h后完全贴壁生长,第445天后融合呈铺路石样镶嵌排列,免疫组化可见胞浆中第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应,证实培养的细胞为内皮细胞。结论：脐静脉灌注II型胶原酶消化法配合M199完全培养液可获得高纯度的内皮细胞,细胞可传代5—6次,但细胞产出量不高,不能传10代以上,5代以后细胞形态变化较大,对于复杂的基础研究应用受限。     

衰老标记蛋白30 mRNA在癌细胞中的表达研究

目的:检测衰老标记蛋白(SMP)30 mRNA在不同癌细胞系中的表达情况,探讨其在不同细胞中的表达差异。方法:分别采用RT-PCR与荧光定量PCR检测SMP30 mRNA在正常肝细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞中的表达,并用SPSS13.0进行统计学分析。结果:SMP30 mRNA在所有被检测的细胞株中均有表达,在癌细胞中的相对表达量分别为肝癌细胞(0.926±0.340)、胃癌细胞(0.922±0.379)、乳腺癌细胞(0.614±0.356)、宫颈癌细胞(0.608±0.346),而在正常肝细胞中为0.175±0.158,显示SMP30 mRNA在癌细胞中的表达量较正常肝细胞中高(P0.05),且在肝癌细胞中的表达量比在其他癌细胞中更高。结论:SMP30 mRNA在癌细胞中的表达高于正常肝细胞,且在肝癌细胞中的表达高于其他癌细胞,具有临床应用价值。     

大鼠细小肺动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定方法的研究

目的：建立一种重复性好、培养周期短及传代次数多的大鼠细小肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）培养方法。方法：在无菌条件下,分离雄性SD大鼠肺细小动脉,剥离外膜和剔除内皮细胞,经胶原酶I消化,培养PASMCs。0.4%台盼蓝染色测定细胞活力;倒置相差显微镜观察;免疫细胞化学法和免疫荧光染色法,进行平滑肌α-肌动蛋白（α-SMactin）鉴定。结果：形态学观察、免疫细胞化学法及免疫荧光染色法鉴定表明培养细胞为PASMCs;细胞存活率在96.5%以上;原代培养后4～7d即可传代,并且生长特点、细胞形态不易发生改变。结论：采用胶原酶I消化法培养PASMCs,方法简单、酶消化时间易控制、培养周期短、重复性好,培养的原代PASMCs具有数量多和生长迅速的特点。     

人的原代上皮角质形成细胞和永生化的上皮角质形成细胞HaCaT的增殖能力的比较

目的：筛选适合充当组织工程皮肤的种子细胞,比较原代培养的人原代上皮角质形成细胞和永生化的上皮角质形成细胞HaCaT的增值能力。方法：将两种细胞（小儿包皮环切术后的组织培养表皮角质形成细胞,永生化的上皮角质形成细胞HaCaT）,分别接种于96孔板,通过MTT检测细胞1,3,5,7,9,11天的生长情况;当两种细胞融合至60%时分别取1×106个细胞,通过流式细胞检测细胞的周期。结果：永生化的上皮角质形成细胞HaCaT每隔一天即可传代一次,原代上皮角质形成细胞每3天传代一次;细胞周期：永生化上皮角质形成细胞HaCaT的G1期和S期的比例高于原代上皮角质形成细胞。生长曲线：MTT检测两种细胞1,3,5,7,9,11的生长情况,永生化的上皮角质形成细胞HaCaT的生长速度明显高于原代上皮角质形成细胞。结论：永生化上皮角质形成细胞HaCaT的增殖能力要高于原代培养的上皮角质形成细胞。     

长爪沙鼠肝细胞体外分离培养体系的建立

目的建立长爪沙鼠原代肝细胞分离培养体系。方法以雄性长爪沙鼠为供体,采用组织消化法和Seglen两步灌流法分离肝细胞,以台盼蓝染色检测细胞得率和活率,过碘酸-希夫氏反应(PAS)鉴定肝细胞,倒置显微镜观察肝细胞形态变化,并使用含有多种细胞因子的培养基维持培养。结果组织消化法和Seglen两步灌流法平均每只长爪沙鼠可分别获得肝细胞(1.33±0.34)×107个、(3.97±1.15)×107个,细胞活率分别为(29.4±6.05)%、(80.3±4.56)%,这两种方法在细胞得率及活率方面存在显著差异。肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色。结果表明肝细胞在贴壁后72 h内,肝细胞形态发生显著变化。结论采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种高效获得肝细胞的方法。各种细胞因子有利于维持肝细胞在体外的生长分化,长爪沙鼠原代肝细胞分离培养体系的建立将为肝脏相关疾病研究和防治药物的开发提供技术支持。     

大黄酸对白细胞介素-6诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：研究大黄酸对白细胞介素-6（IL-6）刺激的血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖效应的影响。方法：（1）采用原代细胞培养方法建立大鼠VSMCs细胞模型,形态学倒置相差显微镜和透射电镜观察的方法进行细胞鉴定;（2）以四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法观察不同浓度和不同时间的IL-6对VSMCs增殖能力的影响,以及不同浓度的大黄酸作用12小时对IL-6效应的干预作用。结果：IL-6能显著促进VSMCs增殖,促增殖效应在48h末达峰值且IL-6浓度在0～50．0ng／ml之间呈剂量依赖关系,差异具有统计学意义（P〈0．05）;而大黄酸可抑制IL-6诱导的VSMCs的增殖效应（P〈0．01）。结论：IL-6可刺激VSMCs增殖,而大黄酸能够抑制IL-6的促增殖作用,有望用于干预动脉粥样硬化的发生发展,其机制可能与线粒体依赖的凋亡机制有关。     

藏红花素对C6胶质瘤细胞生长及Survivin和Livin表达的影响

目的:研究藏红花素对大鼠C6胶质瘤细胞生长及凋亡蛋白抑制因子Survivin和Livin表达的影响。方法:体外培养C6胶质瘤细胞,加入不同浓度的藏红花素培养液,并于不同时间点进行观测,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线,观察C6细胞的生长活性;通过相差显微镜和Hoechst荧光染色法观察C6细胞的形态学变化;采用Western blot法检测Survivin和Livin蛋白的表达水平。结果:C6胶质瘤细胞经藏红花素作用后细胞生长受到明显抑制,用含2、4和8 mg/ml藏红花素的培养液作用48h后各组C6细胞的OD值分别为0.732±0.013、0.421±0.010和0.289±0.017,细胞生长抑制率分别为26.8±0.01%、58.0±0.02%和71.1±0.02%,其中4 mg/ml和8 mg/ml藏红花素实验组细胞生长抑制率与阴性对照组均有显著性差异(P均0.05);相差显微镜和Hoechst荧光染色法观察显示实验组C6细胞出现典型的凋亡形态学改变;Western blot检测显示实验组C6细胞Survivin和Livin蛋白表达明显下调。结论:藏红花素能明显抑制C6胶质瘤细胞的体外生长,其抑制作用与诱导C6细胞发生凋亡和下调凋亡蛋白抑制因子Survivin和Livin的表达有关。     

籽鹅卵泡颗粒细胞烯醇化酶过表达模型的建立及其对孕酮分泌的影响

目的：建立廿烯醇化酶（EN01）腺病毒过表达载体转染原代培养籽鹅卵泡颗粒细胞模型,探讨EN01过表达对颗粒细胞孕酮分泌的影响。方法：采用EN01腺病毒过表达载体以梯度感染复数值（MOI）100、250、350、400pfu／cell转染原代培养籽鹅卵泡颗粒细胞,于转染后2,4h、48h,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达。双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（EusA）研究EN01过表达对颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果：最佳转染条件是,当MOI为350pfu／cell,转染48h后,转染率达100％;通过荧光定量PCR与Westernblot法,检测到EN01mRNA与蛋白均过表达（P〈0．01）;与培养液组和腺病毒空载体组相比较,EN01过表达使颗粒细胞孕酮分泌量极显著增加（P〈0．01）。结论：EN01过表达会使体外原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞孕酮分泌量增加。