重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化及酶学性质研究

利对重组枯草芽孢杆菌(pBES-pss)表达的磷脂酰丝氨酸合成酶进行分离纯化及酶学性质研究.pBES-pss发酵后的粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP-Sepharose HP离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析,基本获得电泳纯的重组磷脂酰丝氨酸合成酶,比活力可达13.62 U/mg,分子量约为53 kD.酶学性质研究表明,该酶催化卵磷脂水解反应的最适pH8.0,最适温度为35℃.稳定性研究表明:该酶在pH 6.5～9.5 区间和低于45℃温度下稳定.表面活性剂及金属离子对该酶水解活性的影响结果表明,SDS、Tween20、Tween80对该酶有抑制作用,Triton X-100对该酶有增强作用;Mg2+、Zn2+、K+对该酶有抑制作用,Ca2+、Mn2+和EDTA对该酶有增强作用.     

磷脂酰丝氨酸合成酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的表达

应用 PCR技术从 Escherichia coli K12 Sgal- (ExPASy P23830) 中扩增到大小为 1350bp编码磷脂酰丝氨酸合成酶的 DNA片段,将其插入枯草芽孢杆菌诱导型表达载体 pBES,获得重组质粒 pBES-pss后转化 Bacillus subtilis DB104。经蔗糖诱导后,该磷脂酰丝氨酸合成酶在 Bacillus subtilis DB104 (pBES-pss)中获得胞外分泌表达,SDS-PAGE分析发现目的蛋白分子量约为 52kDa,酶联比色法检测酶活力为 1.50U/mL,提高了磷脂酰丝氨酸合成酶的表达产量,为工业化发酵生产磷脂酰丝氨酸合成酶奠定了良好的基础。     

大球盖菇漆酶的分离纯化及酶学性质研究

从大球盖菇Sr-01菌株液体发酵液中分离漆酶,研究温度、p H和金属离子对酶活的影响。采用硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析对大球盖菇漆酶进行分离纯化。以ABTS[2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)]为底物,分光光度法测定酶活。结果表明,纯化后的漆酶比活力为152.79 U/mg,回收率为35.8%。SDSPAGE显示该漆酶为单体蛋白,相对分子质量约40 k D。该漆酶的最适反应温度和p H分别为35℃和4.0,Mg~(2+)、Cu~(2+)对酶活有激活作用,Fe~(2+)、Cd~(2+)、Hg~(2+)则有显著抑制作用。在最优反应条件下,纯化后的漆酶比活力可达222.93 U/mg。     

响应面试验设计优化脱氢酶发酵培养基

目的:对简单节杆菌,TCCC11037发酵生产脱氢酶的培养基进行优化.方法:利用单因子试验筛选出最适碳源为葡萄糖,氮源为酵母膏.采用Plackett-Burman(P-B)方法筛选出对产酶有重要影响的因素,并采用响应面试验设计(RSM)对重要因素进行优化.结果:葡萄糖、酵母膏、KH2PO4的浓度是影响脱氢酶产生的重要因素.优化后的培养基组成为(%):葡萄糖1.21,酵母膏0.65,KH2PO4 0.24,玉米浆0.8;培养基初始pH值7.0,接种量5%,通气条件为装液量100mL/500mL.结论:优化后脱氢酶活力达到24.57μmol/(g·min),得到了明显的提高.