猪伪狂犬病毒gB基因在大肠杆菌中的分段表达

目的分段表达伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）gB基因,用于PRV疫苗免疫抗体评估试剂盒研究。方法分析gB抗原表位,设计4对特异性引物,从PRV新疆分离株中扩增gB基因的4个片段,分别命名为gB-1、gB-3、gB-4和gB-5基因,克隆到pGEM-T-easy载体并测序。再将4个gB基因片段融合到pGEX-6P-1原核表达载体中,表达并纯化。Western Blotting进行重组蛋白的抗原性检测。以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,检测猪血清临床样品。结果构建的4种表达质粒均可在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,表达分子量分别为75.05、53.86、49.96和49.72×10^3Da,其中gB-3、gB-4和gB-5表达量较高,表达产物主要存在于包涵体中。Western Bloting鉴定显示,4种融合蛋白均可被猪伪狂犬阳性血清特异识别。以gB-3、gB-4和gB-5建立的ELISA方法与IDEXX公司的gB-ELISA试剂盒符合率分别为40.9%、81.8%和81.8%。结论本研究成功表达了PRV的gB-1、gB-3、gB-4和gB-5重组蛋白,gB-3、gB-4和gB-5表达量较高;其中以gB-4和gB-5建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的符合率较高。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Westernblot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDVVP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA(国标试剂盒)的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Western blot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDV VP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA（国标试剂盒）的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白-ELISA的建立

将已构建成功的重组质粒pETN转化入Ecoli BL21(DE3)中,在最佳诱导条件下获得重组N蛋白。随后用His-Bind对表达产物进行纯化,对纯化效果及纯化产物的特异性分别用SDS-PAGE电泳及Western—blot试验检测。在此基础上,以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包被,作用时间及底物的选择),确定了判定标准。建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法。用此方法检测了200份血清样品,并与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果相比较,符合率达91％。     

基于猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白的ELISA抗体检测方法的建立与评价

【目的】猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的一种猪肠道冠状病毒,2014年首次暴发于美国,随后亚洲多个国家也相继报道,对养猪业构成了巨大威胁。以大肠杆菌表达纯化的PDCoV重组核衣壳(N)蛋白为包被抗原,建立检测PDCoV抗体的间接ELISA方法,为PDCoV的血清抗体检测和流行病学调查提供工具。【方法】以PDCoV CHN-HN-2014株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增PDCoV核衣壳蛋白(N)基因的全长cDNA,将其插入原核表达载体pET-30a中,构建原核表达质粒p ET30a-N,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,以纯化的重组N蛋白为包被抗原,建立PDCoV N-ELISA抗体检测方法,评估其特异性、敏感性、稳定性,并用于临床血清的检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测证实表达的重组N蛋白主要以可溶性形式存在,Western blotting证实表达的重组蛋白具有反应活性。用纯化的重组蛋白建立的N-ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性。与中和试验同时检测148份免疫猪血清和102份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.99%,阴性符合率为92.90%,总符合率为91.20%。用建立的ELISA方法检测267份临床血清,PDCoV抗体阳性血清的比率为66.67%。【结论】建立的猪德尔塔冠状病毒N-ELISA抗体检测方法与中和试验的符合率高,可用于PDCoV血清抗体检测和流行病学调查。     

检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白-ELISA的建立

将已构建成菌的重组质料Petn转化入E.coli BL21(DE3)中,在最佳诱导条件下获得重组N蛋白.随后用His-Bind对表达产物进行纯化,对纯化效果及纯化产物的特异性分别用SDS-PAGE电泳及Western-blot试验检测.在此基础上,以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包补,作用时间及底物的选择),确定了判定标准,建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法.用此方法检测了200份血清样品,并与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果相比较,符合率达91%.     

猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA方法的建立

以猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA建立为目的,以猪细小病毒基因组DNA为模板,扩增获得PPVNS1主要抗原表位基因,将其插入到真核表达载体pPICZα-A中,获得重组质粒pPICZα-A-NS1。电转化后将重组毕赤酵母菌株诱导表达,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot实验表明表达产物具有良好的反应原性。将纯化后的重组蛋白包被酶标板,经棋盘法优化,初步建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为1.9μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判断标准定为OD待检血清>0.4且OD待检血清/OD标准阴性值>2.0。用该方法对猪血清样品进行检测,结果显示本方法与HI试验的符合率达91.2%,与国外同类试剂盒的符合率为92.1%,该间接ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于猪细小病毒病感染抗体的检测。     

截短的HCV NS3蛋白的表达、纯化及应用

目的:为了发展新一代HCV检测试剂盒,使包被的NS3蛋白能提高其检测的精确度与准确度.方法:通过生物信息学方法选定目标蛋白为HCV1263a.a～1583a.a,应用PCR方法克隆出编码此部分NS3蛋白的DNA序列,连接到表达载体pQE30构建重组子pQNS3,转化工程菌株JM109后诱导表达,表达产物通过Western-blot实验证实,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化,采用ELISA方法检测纯化的蛋白在免疫检测中的应用.结果:工程菌株在IPIG诱导下表达出N端含6个组氨酸的NS3融合蛋白,分子量约为36kDa,利用纯化的目标蛋白对40份HCV抗体阳性参考品,蛋白检测的符合率为77.5%(31/40);对40份阴性参考品,检测符合率为97.5%(39/40).结论:表达的NS3融合蛋白,具有很好的应用价值,可以应用于新一代HCV检测试剂盒以及对NS3蛋白功能的研究.     

猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种快速、特异、敏感的检测血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的方法。【方法】利用生物学软件对PEDV S蛋白进行抗原位点分析,选择S蛋白的主要抗原表位区进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,经过条件优化、特异性和重复性试验,建立一种针对血清中PEDV抗体的间接ELISA检测方法。【结果】表达了重组S蛋白,重组的S蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应,并建立一种基于重组S蛋白的间接ELISA检测方法。组内及组间变异系数均小于10%,重复性较好。建立的间接ELISA检测方法分别与商品化PEDV抗体检测试剂盒和Western-blot鉴定结果相比,两者符合率分别为86.67%和88.89%。【结论】建立的间接ELISA方法可以用于PEDV抗体的检测。     

检测猪丹毒杆菌抗体重组SpaA ELISA的建立

【目的】利用表达纯化的猪丹毒杆菌表面保护性蛋白SpaA,建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【方法】克隆扩增猪丹毒杆菌SpaA基因,并将SpaA基因与原核表达载体p GEX-6P-1连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌E.coli Rosetta(DE3),并利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。将SpaA重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的猪丹毒杆菌SpaA蛋白作抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1.0 mg/L,血清的最佳稀释度为1:100,建立了检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,批内及批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性及特异性。用建立的间接ELISA方法检测猪丹毒疫苗免疫后的健康猪血清样品,检测结果与美国TSZ公司猪丹毒杆菌抗体检测试剂盒和Western blot鉴定结果进行对比,两者总符合率分别为92.20%、92.59%。【结论】试验利用原核表达的SpaA重组蛋白作抗原建立的检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于猪丹毒杆菌的抗体检测及流行病学调查。     

H1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及其应用

为建立H1亚型猪流感病毒抗体检测方法,扩增了H1N1亚型猪流感病毒流行株的血凝素基因HA1部分,构建原核表达载体pET30a-HA1,并转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白。对重组蛋白包涵体进行变性、复性和Ni-NTA亲和层析纯化。以纯化后的蛋白作包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该检测方法检测了2008?2009年采集的猪血清785份,阳性率为15.54％,不同省份的阳性率存在差异 (8％~47％)。以IDEXX相关试剂盒检测结果作为参照,该方法的诊断特异性达到91％,诊断敏感性达到95％。     

基于脂蛋白P80的滑液支原体抗体ELISA检测方法的建立及应用

【目的】研究滑液支原体(Mycoplasma synoviae, MS)脂蛋白P80的免疫反应性及其在MS血清抗体ELISA检测中的应用。【方法】对MSP80的氨基酸序列进行生物信息学分析、原核表达和纯化,并用免疫印迹法分析其与6种不同MS分离株阳性血清的免疫反应性以及与其他禽病原血清的交叉反应性;运用纯化的MS P80表达蛋白作为包被抗原建立了MS血清抗体的间接ELISA检测方法,对其敏感性和重复性进行检测;比较检测了与美国爱德士检测试剂盒对50份临床血清样品的阳性符合率。【结果】生物信息学分析预测MS P80蛋白为脂蛋白且含有信号肽,其在MS种内同源性高达98%-100%,与其他种属P80蛋白同源性在25%-34%之间,成功表达和纯化了MS P80重组蛋白(rMS P80);Western blotting分析表明纯化的rMS P80具有良好的免疫反应性和特异性;运用rMS P80建立的MS血清ELISA抗体检测方法可对不同株MS阳性血清进行抗体效价检测,而对其他禽病原阳性血清均无交叉反应性;该检测方法的批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,重复性良好;与美国IDEXX检测试剂盒比较,本文建立的ELISA抗体检测方法敏感性更高,阳性符合率为75%,阴性符合率为89.47%,总样本符合率为86%。【结论】MS P80具有较好的免疫反应性、种内保守性和种间特异,并且可用作MS抗体检测的靶标抗原。     

牛分枝杆菌Mb0950c的免疫特性及其血清学检测方法的建立

【目的】利用原核表达系统对牛分枝杆菌Mb0950c蛋白进行表达和纯化,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病的临床检测。【方法】构建pET32a-Mb0950c原核表达质粒,并转化至BL21(DE3)中诱导蛋白的表达,对蛋白进行纯化。使用流式细胞术(flow cytometry,FCM)、ELISA等对该蛋白在小鼠中的免疫原性进行分析。建立基于Mb0950c的间接ELISA方法,评价该方法的临床检测潜力。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示,成功获得了可溶性Mb0950c蛋白,且具有良好免疫反应性;FCM结果显示,Mb0950c蛋白上调了T细胞表面CD69分子的表达。细胞因子和抗体结果表明,该蛋白能够诱导特异性的IFN-γ和IL-4的分泌,同时能诱导机体分泌特异性的抗体,且以IgG1型为主。建立了ELISA检测方法应用于牛结核临床检测,结果显示,该方法与牛结核外周血IFN-γ外释放试验和皮试试验结果的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为65.7%、97.9%和72.4%。【结论】在原核表达系统中可溶性表达Mb0950c蛋白,它在小鼠模型中诱导Th1和Th2型免疫应答,基于此蛋白建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA方法。     

牛奶过敏原β-乳球蛋白的重组制备及磁微粒化学发光检测法的建立

运用原核系统表达牛奶β-乳球蛋白(Bos d5)蛋白,建立一种纳米磁微粒化学发光方法用于检测牛奶组分过敏原β-乳球蛋白特异性Ig E抗体的含量。通过优化合成牛奶β-乳球蛋白基因,与质粒重组导入Rosetta原核表达菌株中表达目标蛋白,纯化的重组蛋白采用生物素标记后,在化学发光平台上进行过敏原项目检测。获得纯度﹥85%的22.5 kD重组牛β-乳球蛋白,将生物素化的重组蛋白用于牛奶β-乳球蛋白纳米磁微粒检测试剂盒,检测临床110例血清样本,和Phadia进行方法学比对阳性符合率为88.9%,阴性符合率97.3%,总符合率94.5%,P<0.001,χ^2=84.238,Kappa=0.874,其与Phadia参照试剂盒同样具有良好的检测能力。原核表达系统中获得的重组牛奶过敏组分β-乳球蛋白具有较好的免疫活性,开发的免疫诊断试剂盒具备良好的性能,可用于临床辅助诊断。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

提高对丙型肝炎患者实验室检测的灵敏度和特异性,对相关人群进行筛查和早期诊断,是控制丙型肝炎病毒(HCV)流行与传播的有效措施。为了建立更为可靠的HCV诊断方法,通过采用PCR方法从J6/JFH12a型病毒中克隆出HCV ns3基因片段,将其连接到p ET-28a载体上,重组载体p ET-28a-ns3转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,以10%SDS-PAGE进行鉴定,获得表达的NS3重组蛋白分子量为72 k Da。将纯化的NS3蛋白免疫BALB/c小鼠,第4次免疫后采集血液并分离血清进行抗体活性鉴定,小鼠抗体效价为1∶256 000。进一步的Western blotting和间接免疫荧光结果显示,以重组NS3蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体可以很好地识别HCV感染Huh7.5.1细胞中的NS3蛋白,为下一步开展单克隆抗体制备和检测试剂盒研制工作奠定了基础。     

Development of luciferase-linked antibody capture assay based on luciferase immunoprecipitation systems for antibody detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

Background

Early detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection of swine is necessary to control this devastating disease. By monitoring host serum antibodies to viral antigens, early virus detection within herds is feasible. In this study, recombinant antigens were generated using recombinant DNA techniques to fuse PRRSV structural protein (N) or nonstructural protein 1α (nsp1α) with the Rellina luciferase gene. Next, fused genes were cloned into plasmids and transfected into HEK-293 T cells for transient expression. Upon co-incubation of lysates with pig sera, antigen-antibody complexes formed that bound to Protein-G coated onto microplates. By further measurement of luminance value, a modified form of Luciferase Immunoprecipitation Systems, namely luciferase-linked antibody capture assay (LACA) was developed for detection of PRRSV-specific antibodies.

Results

Known anti-PRRSV antibody-positive or -negative serum samples (125 and 122 samples, respectively) were used to validate the LACA and compared it with IDEXX PRRS ×3 ELISA. Based on the result, N-Rluc and nsp1α-Rluc LACA results were 95.3 and 94.4% in agreement with IDEXX ELISA, suggested a similar specificity of LACA to IDEXX ELISA. Moreover, when both LACA and IDEXX ELISA were used to evaluate sequential serum samples obtained from PRRSV experimentally infected pigs, the PRRSV-specific antibody response was detectable as early as 3 days post-inoculation (dpi) using N-Rluc LACA, but undetectable until 7 dpi using IDEXX ELISA, suggesting an improved sensitivity of LACA. Meanwhile, antibodies specific for nsp1α were detected at higher levels overall, but were undetectable until 10 dpi. Furthermore,. Notably, one IDEXX ELISA positive result was not confirmed by LACA or IFA and was thus considered a false-positive result.

Conclusion

The LACA exhibited similar specificity but improved sensitivity to that of the commercial IDEXX PRRS ×3 ELISA kit for detection of PRRSV-specific antibodies in pig serum. Importantly, LACA could be adapted for detecting antibodies against other PRRSV targets, such as nsp1α, to achieve earlier detection of PRRSV infection.

     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和流感病毒HA基因的联合表达及应用

参照已公布的流感病毒血凝素基因(HA基因)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列,设计并合成一对引物P1、P2,以RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF7片段(约410bp),其中含HA基因主要核苷酸序列(33bp)。用BamH Ⅰ、Xho Ⅰ分别对扩增出的片段及pET32a质粒进行酶切,连接后构建了重组质粒pETHN并转化到BL21(DE3)宿主菌中诱导表达。用纯化后的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的乳胶凝集试验。检测结果显示:该方法有良好的特异性及敏感性,与IDEXX公司FLISA检测试剂盒符合率达93.8％。