斯氏假单胞菌A1501固氮新基因PST1305的功能分析

摘要：【目的】研究斯氏假单胞菌A1501基因组“固氮岛”中PST1305基因在A1501生物固氮过程中所起的作用。【方法】利用同源重组与三亲接合的方法构建PST1305的非极性突变株。乙炔还原法测定固氮酶活。RT-PCR分析PST1305基因与其周围基因转录单元的关系,Real-Time PCR比较PST1305在最佳固氮与非固氮条件下表达水平的差异。【结果】突变株np1305的固氮酶活显著降低,功能互补菌株np1305Comp能基本恢复细胞的固氮作用。PST1305与其上游的nifB、fdxN、下游的nifQ等基因位于同一个转录单元,组成一个操纵子。基因芯片表明,PST1305基因在固氮比非固氮条件下表达量显著上调（约38.7倍）,Real-Time PCR验证支持这一结果。【结论】PST1305基因参与固氮过程,其突变会影响固氮酶的活性,该基因可能通过参与A1501固氮酶电子传递或者固氮酶的氧保护过程影响固氮效率。     

固氮施氏假单胞菌亚硝酸盐还原酶基因nirS转录特性及功能鉴定

【目的】研究固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501亚硝酸盐还原酶结构基因nir S的转录调控机制及其在反硝化过程中的功能。【方法】构建nir S-lac Z融合载体,利用三亲本结合法将其导入野生型A1501,通过β-半乳糖苷酶活性的测定,分析不同供氧状况、不同浓度的硝酸盐、亚硝酸盐对nir S基因表达的影响;同时将该载体导入rpo N突变株中,研究氮代谢调控因子Rpo N对nir S基因转录影响。通过同源重组方法构建nir S突变株,通过生化表型测定明确nir S在反硝化过程中的功能。【结果】启动子活性测定表明,nir S基因厌氧条件下高水平表达,是好氧条件下表达水平的4倍;nir S的表达受硝酸盐诱导,但不受亚硝酸盐的诱导;Rpo N突变株中,nir S的表达活性为野生型的1/4,nir S启动子未发现Rpo N的保守结合位点,表明nir S的表达受Rpo N间接调控。表型测定显示以硝酸盐为电子受体时Δnir S的反硝化能力降低了约20%;以亚硝酸盐为电子受体时Δnir S仅有微弱的反硝化能力,并且nir S的突变使得菌体在反硝化条件下利用亚硝酸盐的能力显著减弱。nir S突变提高了菌体在亚硝酸为电子受体的反硝化条件下的固氮酶活。【结论】A1501中nir S基因的转录受外界氧及硝酸盐的影响,同时受氮代谢Sigma因子Rpo N的调控。nir S在A1501菌反硝化过程中起关键作用,参与了亚硝酸盐的转化。     

大肠杆菌氮代谢调节蛋白GlnG与固氮施氏假单胞菌氮代谢调节蛋白NtrC的功能互补研究

旨在围绕大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)中氮代谢调节蛋白GlnG与施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeriA1501)中氮代谢调节蛋白NtrC在一般氮代谢调控网络中是否存在功能互补展开研究。利用DH10B菌的glnG基因回补A1501菌的ntrC突变株,以及A1501菌的ntrC基因回补DH10B菌的glnG突变株,对所获得的功能互补株分别展开生理生化表型测定。结果表明,在以硝酸钾或尿素为唯一氮源的培养条件下,DH10B glnG基因可以回补A1501ntrC突变株的氮源利用能力,并且部分恢复ntrC突变株的固氮酶活性(约为野生型A1501固氮酶活性的45%);与DH10B glnG突变株相比,A1501菌的ntrC基因回补了DH10B glnG突变株以精氨酸为唯一氮源的生长能力。以上结果说明DH10B菌的GlnG蛋白与A1501菌的NtrC蛋白不仅在进化关系上紧密联系而且在所测试的氮代谢途径中存在功能互补。     

斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

[目的]研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异.[方法]用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长.[结果]cbh1基因全长为1500 bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602).克隆并分析了1.9 kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CRE Ⅰ与纤维素酶转录调控蛋白ACE Ⅰ的两个的潜在结合位点.[结论]在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2.两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的.     

携带Paenibacillus polymyxa WLY78固氮基因簇(nif)的重组大肠杆菌Escherichia coli 78-7转录组分析（英文）

【目的】来自Paenibacillus polymyxa WLY78的固氮基因簇(nifBHDKEf NXhesAnifV)可以转化入Escherichia coli中表达并使重组大肠杆菌合成有固氮活性的固氮酶。本文拟通过对重组大肠杆菌E.coli78-7的转录组分析以提高其固氮能力。【方法】对固氮条件(无氧无NH+4)和非固氮条件(空气和100 mmol/L NH_4~+)培养的重组大肠杆菌E.coli 78-7进行转录组分析。【结果】nif基因在两种培养条件下显著表达,说明在重组大肠杆菌中可规避原菌中氧气和NH_4~+对nif基因的负调控。对于固氮过程必需的非nif基因,如参与钼、硫、铁元素转运的mod、cys和feoAB,这些基因在两种培养条件下表达水平有差异。而参与铁硫簇合成的suf和isc基因簇在两条件下表达水平差异巨大。此外,参与氮代谢的基因在固氮条件下显著上调。【结论】重组大肠杆菌中与固氮相关的非nif基因在该菌的固氮过程中具有较大影响,本文对在异源宿主中调高固氮酶活性研究具有重要意义。     

固氮施氏假单胞菌A1501四碳二羧酸结合蛋白DctP的功能及表达特性

【目的】研究施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸结合蛋白Dct P的生物学功能和自身表达特性。【方法】构建结合蛋白编码基因dct P的非极性突变株,测定dct P突变株以不同四碳二羧酸(琥珀酸延、胡索酸、苹果酸)为唯一碳源时的生长情况和固氮酶活性;构建dct P基因启动子的融合表达载体dct P-lac Z,将其分别转入野生型A1501和ntr BC、rpo N和dct B突变株中,测定在不同四碳二羧酸为唯一碳源诱导条件下重组菌株中的β-半乳糖苷酶活性。【结果】dct P基因的突变使菌株丧失了四碳二羧酸的利用能力,影响了菌株的固氮酶活性;苹果酸、延胡索酸、琥珀酸对dct P-lac Z具有明显的诱导作用;在rpo N、ntr BC和dct B突变株中,dct P的表达量均显著降低。【结论】Dct P蛋白在四碳二羧酸的利用过程中起重要的作用,dct P基因的表达是Rpo N依赖型,可被四碳二羧酸诱导,受到调控蛋白Ntr BC/Dct B的协同调控。     

光合细菌Rhodobacter sphaeroides glnB-lacZ融合子的构建与表达

亚克隆了Rhodobacter sphaeroides glnB启动子,以pMP220为载体构建成glnB-lacZ融合子。将glnB-lacZ、 nifH-lacZ、 nifA-lacZ分别导入R.sphaeroides谷氨酸合酶突变株gltB-、 gltD-和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响。试验证明,在gltBD突变株中nifH的表达受阻遏,nifA表达水平很低。这证明glt基因的突变引起固氮酶结构基因和固氮正调节基因的转录被阻遏,而glnB基因的表达几乎不受影响。试验还测定了环境中结合态氮和有机酸等信号分子对glnB和nifH表达的影响,发现加入氨或谷氨酰胺后,nifH的表达受到明显的阻遏作用,glnB-lacZ的β-半乳糖苷酶活性虽下降30%左右但不随结合态氮浓度升高而变化,仍维持在一个较高的水平。α-酮戊二酸和丙酮酸对nifH的表达有部分去阻遏作用而对glnB的表达无诱导作用。     

丙酮酸对浑球红假单胞菌突变株(GOGAT~-Nif~-)固氮酶活性的调节

固氮无效的浑球红假单胞菌GOGAT突变株经丙酮酸诱导产生固氮酶活性。固氮酶比活随丙酮酸浓度增加而提高,同时依赖于蛋白质合成的菌体生长。丙酮酸产生固氮酶时氮源Glu的浓度高达60 mmol/L。液相色谱分析表明,丙酮酸诱导固氮酶活性的形成与胞内Gln耗竭有关而与Asn无关。用丙酮酸代替苹果酸诱导,突变株向胞外分泌的游离氨大大减少。丙酮酸诱导时变种谷氨酰胺酶比活较高,它可能参与胞内Gln的分解。     

白念珠菌高铁还原酶职FRP1基因的功能

白念珠菌((Candida albicans)获得铁的能力影响细胞的生长和毒力,高铁还原酶是白念珠菌高亲和铁吸收系统的重要组成部分.[目的]构建高铁还原酶FRP1(Ferric reductase protein)基因缺失突变株,对FRP1基因功能进行初步研究.[方法]使用Northem杂交的方法分析FRP1基因在缺铁和富铁条件下的表达.利用PCR介导的基因敲除技术构建frp1缺失突变株,并且对野生型和缺失突变株在细胞高铁还原酶活性以及缺铁条件下的生长情况进行比较分析.[结果]缺铁条件可以诱导FRP1基因的表达.frp1缺失突变株不能在铁缺陷的固体培养基上生长.[结论]FRP1蛋白可能是白念珠菌在缺铁条件下起主要作用的高铁还原酶.     

白念珠菌高铁还原酶FRP1基因的功能

白念珠菌((Candida albicans)获得铁的能力影响细胞的生长和毒力,高铁还原酶是白念珠菌高亲和铁吸收系统的重要组成部分.[目的]构建高铁还原酶FRP1(Ferric reductase protein)基因缺失突变株,对FRP1基因功能进行初步研究.[方法]使用Northem杂交的方法分析FRP1基因在缺铁和富铁条件下的表达.利用PCR介导的基因敲除技术构建frp1缺失突变株,并且对野生型和缺失突变株在细胞高铁还原酶活性以及缺铁条件下的生长情况进行比较分析.[结果]缺铁条件可以诱导FRP1基因的表达.frp1缺失突变株不能在铁缺陷的固体培养基上生长.[结论]FRP1蛋白可能是白念珠菌在缺铁条件下起主要作用的高铁还原酶.