乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制TTRAP启动子活性的体外研究

旨在探讨体外培养条件下HBx蛋白对TTRAP(TRAF and TNF receptor-associated protein)基因转录水平表达的影响。用RT-PCR及Real-time PCR检测TTRAP在HepG2细胞和HepG2.2.15细胞中的表达;构建TTRAP启动子虫荧光素酶报告质粒;分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性。RT-PCR和Real-time PCR结果显示,TTRAP在HepG2.2.15细胞中的表达量分别是其在HepG2细胞中表达量的44.9%和27.8%(P0.05)。TTRAP启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性,与对照组相比下降了43.8%。转染HBx表达质粒组的相对荧光素酶活性与其对照组相比下降了35%,而转染HBc、HBs及HBp表达质粒组对相对荧光素酶活性没有影响。因此证实HBx蛋白能抑制TTRAP启动子活性。     

HBV影响XRN2基因在HepG2-H7细胞中表达的机制研究

目的利用稳定表达HBV的HepG2-H7细胞,研究HBV对XRN2基因表达的调控,并对其作用机制进行初步探讨。方法用RT—PCR和Real-time PCR的方法检测HepG2细胞及稳定表达HBV的HepG2-H7细胞中XRN2在mRNA水平的表达差异。构建XRN2启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒,分别转染HepG2细胞及HepG2-H7细胞,检测HBV对XRN2启动子的影响。将XRN2启动子质粒与HBV4种蛋白的真核表达质粒共转染HepG2细胞,寻找对启动子影响较大的HBV蛋白。结果RT—PCR和Real-time PCR的结果显示XRN2在HepG2-H7细胞中的表达较HepG2细胞有所下降。荧光素酶活性分析显示HBV能抑制XRN2启动子的活性,且HBx和HBp蛋白在这一过程中起主要作用。结论HBV蛋白可以通过抑制XRN2启动子活性调节其在HepG2-H7细胞中的表达。     

乙型肝炎病毒蛋白对纤维介素基因的激活作用

纤维介素基因（fgl2）在人和小鼠的重型肝炎的发病机制中发挥重要作用.为探讨乙型肝炎病毒（HBV）编码蛋白对人纤维介素基因（hfgl2）的激活作用, 构建了HBV编码蛋白C、 S和X的真核表达质粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx, 分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因质粒（βGal ）共转染到CHO细胞和HepG2 细胞, 采用免疫组织化学和免疫印记方法(Western blotting)鉴定病毒蛋白的表达.通过检测报告基因荧光素酶（LUC）及β半乳糖苷酶的表达活性, 反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用.结果显示, 转染了真核表达质粒的细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白, 在CHO细胞, 转染pcDNA-HB组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的5.4和6倍, 在hepG2细胞, 转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的8.7和11倍.研究表明, CHO和HepG2细胞中表达的HBV C蛋白和X蛋白均具有激活hfgl2的功能, 而S蛋白则不能激活.进一步揭示了HBV病毒蛋白与宿主基因的相互作用机制.     

HBx蛋白与Hepsin共表达可促进HBV复制

运用RT-PCR技术从原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者的癌旁组织中扩增了Hepsin基因编码区序列,该序列已被克隆并构建了pCMV-tag-HS表达质粒。将pCMV-tag-HS表达质粒和表达HBx蛋白的载体共转染HepG2．2．1．5细胞,观察HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用对HBV病毒复制和病毒蛋白表达的影响。研究结果表明共表达HBx蛋白、Hepsin蛋白可以协同提高HBV病毒颗粒在培养液中的拷贝数,并提高HBV病毒蛋白HBs、HBe的表达水平。这说明HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用可以增强HBV病毒的复制。     

亚油酸调控HepG2细胞PAI-1基因表达的机制研究

目的：探讨亚油酸对HepG2细胞PAI-1基因表达的影响和调控机制。方法：不同浓度亚油酸刺激HepG2细胞,RT-PCR法检测PAI-1 mRNA水平。构建四个含PAI-1启动子序列从-804至＋17间系列缺失体片段驱动的荧光素酶报告基因质粒,转染HepG2细胞,初步确定位于PAI-1启动子序列-804至＋17之间的Smad3/4结合元件（SBE）具有调控作用,采用重叠PCR法对该元件进行定点突变并构建相应重组质粒,转染HepG2细胞。WesternBlot法检测亚油酸诱导下HepG2细胞中Smad3和Smad4的蛋白表达水平。结果：①50μmol/L及100μmol/L亚油酸可显著增加PAI-1 mRNA的表达,100μmol/L亚油酸可明显上调PAI-1的转录活性。②亚油酸诱导下,PAI-1启动子-734/-731处SBE缺失后,PAI-1荧光素酶活性显著降低。③亚油酸可以显著增加HepG2细胞中Smad3和Smad4的蛋白表达。结论：亚油酸可从转录水平上调HepG2细胞中PAI-1基因的表达,PAI-1启动子上的Smad3/4结合元件即SBE参与亚油酸对HepG2细胞PAI-1基因的转录调控,这一过程涉及到Smads蛋白及其介导的Smad信号转导通路。     

丙型肝炎病毒5’非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响

在前期工作已证实HCV基因组5’UTRDNA序列具有启动子活性的基础上,分别构建5’UTR不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5’UTR,转染HepG2细胞以及用全长的5’UTRcDNA构建质粒分别转染HepG2、Hela、HEK293、L02细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,并与相应对照作比较。结果显示当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.91±0.65,为SV40启动子的18.7%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.52±0.32;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.25;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.09;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.45,逆转录聚合酶链反应结果与之相符;全长5’UTRcDNA在L02、hepG2、HEK293、Hela细胞中荧光素酶相对活性分别为0.75,0.49,0.23,0.14。结果提示结构域III是HCV5’UTRDNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5’UTRDNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5’UTRDNA序列的启动子活性;HCV5’UTRcDNA的启动子功能无组织特异性,但在正常的肝细胞(L02)中表达最高。     

HBx蛋白与Hepsin共表达可促进HBV复制

运用RT-PCR技术从原发性肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)患者的癌旁组织中扩增了Hepsin基因编码区序列,该序列已被克隆并构建了pCMV-tag-HS表达质粒.将pCMV-tag-HS表达质粒和表达HBx蛋白的载体共转染HepG2.2.1.5细胞,观察HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用对HBV病毒复制和病毒蛋白表达的影响.研究结果表明共表达HBx蛋白、Hepsin蛋白可以协同提高HBV病毒颗粒在培养液中的拷贝数,并提高HBV病毒蛋白HBs、HBe的表达水平.这说明HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用可以增强HBV病毒的复制.     

丙型肝炎病毒5''''非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响

在前期工作已证实HCV基因组5'UTR DNA序列具有启动子活性的基础上,分别构建5'UTR 不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5'UTR,转染HepG2细胞以及用全长的5'UTR cDNA构建质粒分别转染HepG2、Hela、HEK293、L02细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,并与相应对照作比较.结果显示当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.91±0.65,为SV40启动子的18.7%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.52±0.32;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.25;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.09;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.45,逆转录聚合酶链反应结果与之相符;全长5'UTR cDNA在L02、hepG2、HEK293、Hela细胞中荧光素酶相对活性分别为0.75,0.49,0.23,0.14. 结果提示结构域III是HCV5'UTR DNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5'UTR DNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5'UTR DNA序列的启动子活性;HCV5'UTR cDNA的启动子功能无组织特异性,但在正常的肝细胞(L02)中表达最高.     

HBx抑制IGFBP3转录的机制

【目的】在细胞水平上研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)转录的影响并对具体机制进行初步探索。【方法】首先采用RNA-Deep-Sequencing技术分析HepG2和乙型肝炎病毒(HBV)转基因细胞HepG2-4D14中表达差异的基因,然后通过实时定量PCR对相关基因进行验证;利用启动子报告基因分析,研究HBx对相关基因IGFBP3转录的调控;通过染色质免疫共沉淀方法,分析HBx抑制IGFBP3启动子活性的机制。【结果】RNA-Deep-Sequencing的结果表明IGFBP3在HBV转基因细胞HepG2-4D14中水平显著下调,实时定量PCR结果与RNA-Deep-Sequencing一致。进一步研究表明HBx能明显抑制IGFBP3的转录,通过实时定量PCR发现HBx对IGFBP3转录的抑制作用依赖于p53;染色质免疫共沉淀实验结果表明HBx能够通过抑制p53与IGFBP3启动子的结合,从而抑制IGFBP3的转录。IGFBP3是一种细胞周期负调控蛋白,我们推测HBx对IGFBP3水平的下调是其促进细胞增殖的途径之一。【结论】HBV能显著下调IGFBP3的转录,机制研究揭示HBV HBx通过干扰p53与IGFBP3启动子的结合进而抑制IGFBP3的转录。     

丙型肝炎病毒NS2蛋白在Huh-7细胞中抑制NF—κB活性

将丙型肝炎病毒（HCV)非结构蛋白NS2基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3．1(-)CMV启动子下游,构建成重组质粒pCNS2。用脂质体Lipo Vec^TM转染Huh-7细胞,转染细胞内可检出NS2的mRNA和蛋白质,表明构建的pCNS2可在Huh-7细胞内成功表达;把不同剂量的pCNS2质粒DNA与报告质粒pNF-κ B-Luc共转染Huh-7细胞,48h后检测荧光素酶活性,结果显示与pCNS2共转染的细胞中pNF-κB-Luc表达出的荧光素酶的活性比对照细胞降低了约2—4倍,并呈明显的剂量相关性。表明HCV NS2对NF-κ B激活转录活性有明显的抑制作用。这可能与HCV慢性持续性感染的致病性有一定的相关性。     

Intracellular hepatitis B virus increases hepatic cholesterol deposition in alcoholic fatty liver via hepatitis B core protein

Hepatitis B virus (HBV) infection is a prevalent infectious disease with serious outcomes like chronic and acute hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. However, the metabolic alteration by HBV is rarely taken into consideration. With the high prevalence of alcohol consumption and chronic HBV infection, their overlap is assumed to be an increasing latent hazard; although the extent has not been calculated. Moreover, the impact of chronic alcohol consumption combined with HBV on cholesterol metabolism is unknown. Six-week-old male FVB/Ncrl mice were hydrodynamically injected with a pGEM-4Z-1.3HBV vector and then fed an ethanol diet for 6 weeks. Serum biomarkers and liver histology, liver cholesterol levels, and cholesterol metabolism-related molecules were measured. In vitro assays with HBx, hepatitis B surface (HBs), or hepatitis B core (HBc) protein expression in HepG2 cells costimulated with ethanol were conducted to assess the cholesterol metabolism. HBV expression synergistically increased cholesterol deposition in the setting of alcoholic fatty liver. The increase of intrahepatic cholesterol was due to metabolic alteration in cholesterol metabolism, including increased cholesterol synthesis, decreased cholesterol degradation, and impaired cholesterol uptake. Overexpression of HBV component HBc, but not HBs or HBx, selectively promoted the hepatocellular cholesterol level.     

应用H1-U6双启动子RNAi载体筛选人泛素结合酶hUBE2W的RNAi有效靶点

hUBE2W是新近鉴定出的一种Ⅰ型泛素结合酶,可能在肿瘤发生和DNA损伤修复过程中起重要作用.RNA干涉是指通过形成局部双链RNA进而特异性地降解细胞内同源基因mRNA的机制,目前已成为基因功能研究的有力工具.通过构建H1-U6双启动子RNAi载体,可以在体内直接转录出针对hUbe2w基因的两段互补小RNA,更接近于生理状态下小干涉RNA的作用.利用RT-PCR方法从293FT细胞总RNA中扩增出hUbe2w基因,分别将其连接至质粒pGL3-Control,pCMV-myc和pDsRed-express-C1中,以便在mRNA水平和蛋白水平检测RNA干涉效果.RNA干涉载体分别与上述报告载体共转染293FT细胞,测定萤光素酶活性和hUBE2W蛋白表达水平,结果显示靶点125和259能够在mRNA水平和蛋白质水平显著降低hUbe2w的表达.     

p150Sal2 在人卵巢癌细胞株中促进MX1 基因的表达

目的:研究p150Sal2在人卵巢癌细胞株中对MX1基因表达的影响。方法:将MX1基因的启动子克隆至带有Luciferase报告基因的pGL3-basic载体中,将其与p150Sal2表达载体用PEI介导的转染方法共转染至卵巢癌细胞株SKOV3,用双荧光素酶检测系统检测MX1启动子活性变化;将p150Sal2表达载体转染至卵巢癌细胞株ES-2,用western blot检测细胞中MX1基因的表达变化。结果:双荧光素酶检测系统检测MX1启动子活性被p150Sal2上调,western blot检测转染p150Sal2后细胞中MX1表达量增加。结论:p150Sal2在人卵巢癌细胞株中促进MX1基因的表达。     

转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达

为研究Ebox元件在谷氨酸 半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox（-3 853～ -3 848）的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（L2）,比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2（differentiated embryo chondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2）真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）和超级迁移率实验（supershift assay）检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响. 结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(－3 853～－3 848）与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western 印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox（－3 853～－3 848）有关.