条锈菌诱导的小麦抗病与感病近等基因系SSH文库构建及分析

为分析条锈菌诱导下的小麦抗病与感病近等基因系之间差异表达的基因,以接种小麦条锈菌CY26小种的抗病近等基因系Yr4/6×Taichung 29幼苗叶片cDNA作为实验方,接种CY26的感病亲本Taichung 29幼苗叶片cDNA为驱动方,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个包含1 300余克隆的消减文库。对文库中600个克隆进行了反向Northern点杂交筛选,对获得的阳性克隆进一步进行了Northern杂交验证,获得显著差异的克隆12个。经测序和BlastX分析,其中6个差异表达序列的推测产物分别为亮氨酸重复序列蛋白、过氧化氢酶、硫氧还蛋白、RNA结合蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和热激蛋白。除亮氨酸重复序列为信号传导类蛋白外、其他几个均为抗病防御类蛋白。     

小麦中小GTP结合蛋白基因TaRop2克隆及其表达分析

小GTP结合蛋白属于Rho家族,是植物特有的一类蛋白,在调控植物生长发育、抗逆和抗病过程中发挥着重要的作用。本研究通过筛选非亲和条锈菌小种CYR32侵染诱导的抗条锈病基因Yr5近等基因系(Taichung29*6/Yr5)c DNA文库,分离获得1个Rop家族基因的全长c DNA序列,命名为TaRop2(Triticum aestivum Rop2)。TaRop2包含1个591 bp的开放阅读框,预测编码含197个氨基酸残基的蛋白质,分子量为21.52 k D,理论等电点为9.49。通过在烟草表皮细胞瞬时表达,发现TaRop2分布于细胞核内和细胞膜上。RT-PCR分析结果表明,在高盐处理、非亲和条锈菌小种CYR32和亲和混合白粉菌菌株侵染时,TaRop2基因的表达水平升高,但被干旱、高温、低温和ABA处理抑制。说明TaRop2可能参与小麦防卫和抗逆反应过程。     

小麦抗条锈病近等基因系感染条锈病后丁布含量变化

选用2套遗传背景不同的抗条锈病近等基因系作为供试寄主材料,研究了不同抗条锈病近等基因系丁布的含量及其在感病过程中丁布含量的动态变化.结果表明,在未受病菌侵染情况下,2套分别含有Yr2、Yr9和YrSpP基因的近等基因系（抗病系）与其轮回亲本Taichung 29、铭贤169(感病系)间丁布含量没有显著差异（P＞0.05）.接种条锈病菌后,感病系在病菌侵染初期丁布含量下降,而抗病系在病菌侵染初期丁布含量迅速大幅度上升.感染条锈病最终导致感病植株丁布含量比未接种的植株明显减少, 感病系的减少幅度明显高于抗病系.在整个病程中,抗病系丁布的含量始终高于感病系,表明接种条件下小麦植株体内丁布含量变化与小麦抗条锈近等基因系的抗性有关.     

小麦叶片胞间洗脱液的蛋白质组学检测分析

植物叶片胞间液蛋白主要是一些低丰度蛋白,其中某些种类在植物抗病反应中起着重要的作用.通过改进已有的技术方法,结合超滤和丙酮沉淀处理,从500 9抗条锈病近等基因系小麦Taichung29*6/Yr5的叶片中获得了1.5mg可溶性的胞间洗脱液蛋白.SDS-PAGE电泳分析显示,胞间洗脱液蛋白样品和总蛋白样品存在着明显的差异.进一步的双向电泳分析证实,两个样品在胶图上可分别检测到1 241±59(n ＝3)和1 849±138(n ＝3)个蛋白点,其中胞间洗脱液样品有1 042±47(n ＝3)个不同于总蛋白样品的蛋白点,与总蛋白样品共有的蛋白点仅198±13(n ＝3)个.随意取100个差异蛋白点进行MALDI-TOF质谱分析,鉴定到一些已被确证存在于小麦胞间液中的蛋白质,如β-1,3-萄聚糖酶、葡聚糖-β-D-1,3-葡萄糖苷内切酶、几丁质酶、过氧化物酶等.从蛋白质组学角度初步分析了小麦叶片胞间洗脱液的组成,为进一步探索小麦叶片胞间液中低丰度蛋白的抗病功能提供依据.     

小麦条锈菌鉴别寄主抗条锈病基因Yr9的微卫星标记

以含有Yr9的抗条锈病近等基因系Taichung29＊6／Yr9及其轮回亲本Taichung29为材料,用目的基因所在1B染色体上32对微卫星引物对其基因组DNA进行PCR扩增,发现引物Xgwm582在近等基因系与轮回亲本间可扩增出特异性DNA片段。经F2代分离群体177个抗、感单株检测证实,该片段位点与抗条锈病基因Yr9紧密连锁,遗传距离为3．7cM,确定Xgwm582可作为抗条锈病基因Yr9的标记。     

小麦条锈菌国际鉴别寄主Vilmorin23的抗条锈病基因YrV23微卫星标记

Vilmorin23是小麦条锈菌国际鉴别寄主和国际上重要抗源材料。采用SSR技术,利用由Vilmorin23为基因供体转育而成的小麦抗条锈近等基因系Taichung29*6/YrV23,选用YrV23所在2B染色体上的55对SSR引物,对Taichung29*6/ YrV23及其轮回亲本Taichung29和抗性基因供体Vilmorin23的基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果显示,引物Xwmc356在近等基因系与轮回亲本间扩增出特异性DNA片段,经F₂代群体150个抗、感单株检测证实,该片段位点与抗条锈病基因YrV23有连锁关系,遗传距离为9.4 cM。Xwmc356可作为抗条锈基因YrV23的SSR标记。      

小麦抗病基因Lr46/Yr29/Pm39、Sr2/Yr30和Lr68的遗传特性及其与主要农艺性状的关联分析

利用与抗病基因Lr46/Yr29/Pm39、Sr2/Yr30和Lr68等紧密连锁的分子标记,对小麦品种(系)‘RL6077’和‘西农979’构建的BC1F1和F2群体进行抗病基因遗传分析,结合主要农艺性状分析,探究小麦抗病基因Lr46/Yr29/Pm39、Sr2/Yr30和Lr68的遗传特性及其与主要农艺性状的关联性;并对检测的聚合有3个抗慢锈病基因(Lr68+Sr2/Yr30+Lr46/Yr29/Pm39)位点的聚合体进行SSR标记遗传背景回复率检测。结果表明:(1)F2群体中Lr68基因的传递率(65.41%)比理论值(75%)偏低,Lr46/Yr29/Pm39基因和Sr2/Yr30基因的传递率(分别为75.83%、74.53%)与理论值(75%)相符合;BC1F1群体中Lr68基因的传递率(44.27%)比理论值(50%)偏低,Lr46/Yr29/Pm39基因和Sr2/Yr30基因的传递率(分别为56.64%、55.11%)均比理论值(50%)偏高。(2)Lr46/Yr29/Pm39和Sr2/Yr30基因位点均与株高、穗长、穗下茎长、穗下节长呈极显著正相关关系;Lr68和Sr2/Yr30基因位点均与穗粒数呈显著或极显著正相关关系;Lr46/Yr29/Pm39基因位点与千粒重呈显著负相关、与单株成穗数呈显著正相关关系。(3)对BC1F1群体中聚合有Lr68+Sr2/Yr30+Lr46/Yr29/Pm39基因位点的92个聚合体的遗传背景回复率检测发现,轮回亲本‘西农979’遗传背景回复率最高达91.67%,其中遗传回复率达90%以上的聚合体有3株,占回交群体(655株)总体的0.46%。该研究结果为优异抗病基因资源‘RL6077’的进一步利用提供了理论参考,对创制小麦多种抗病新种质具有重要意义。     

小麦3个NAC转录因子基因克隆与功能分析

NAC类转录因子参与植物基因在不同条件、不同发育期的表达调控,在植物的发育、生长及对外界的各种生物和非生物因子的胁迫应答中起关键的调控作用。本研究对非亲和条锈菌小种CYR32侵染诱导的抗条锈病基因Yr5近等基因系Taichung29*6/Yr5的cDNA文库进行筛选及同源克隆,获得了小麦3个NAC类转录因子的cDNA序列。序列分析结果表明,这3个转录因子都具有DNA结合结构域,即NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的A、B、C、D和E5个亚区高度保守;同时发现这3个NAC类转录因子都有核定位信号及相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,发现其中之一的TaNAC1属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,TaNAC3属于ATAF1亚组,TaNAC5属于NAM亚组;根据系统进化树和相关基因的功能分析,我们推测小麦转录因子TaNAC1、TaNAC3和TaNAC5可能参与植物生长发育调控或对生物、非生物胁迫作出的应答反应。     

400份小麦品种（系）条锈病成株期抗性鉴定与评价

发掘新抗源,不断拓宽抗病遗传资源,是确保农业生产可持续发展的重要战略储备。为明确400个小麦品种(系)的抗条锈表现及抗条锈基因分布状况,本研究利用混合小种(CYR31、CYR32和CYR33)在田间进行成株期条锈病抗性鉴定,同时以Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18和Yr26已知抗条锈病基因的分子标记进行检测筛查,综合分析供试材料可能携带的抗病基因。结果表明,在400份材料中,成株期对混合菌种表现高抗至免疫(IT=0～1)的品种(系)有177份,占44.25%;中抗(IT=2)品种(系)62份,占15.5%;中感或高感(IT=3/4)品种(系)161份,占40.25%。结合抗病表现和已知Yr基因分子检测结果表明:供试小麦中121份材料携带Yr5,占30.25%;96份携带Yr9,占24%;10份携带Yr10,占2.5%;19份携带Yr15,占4.75%;150份携带Yr17,占37.5%;15份携带Yr18,占3.75%;127份携带Yr26,占31.75%。其中定西24、N7187等25份材料未发现携带Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18和Yr26,推测可能含有其他未知抗性基因或新基因。该研究结果建立了小麦条锈病抗源鉴定和评价体系,筛选出177份具有不同抗病性特征的抗源材料,其中25份可能含有新抗源,为进一步培育抗条锈病新品种奠定了基础。     

小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析

根据已克隆植物抗病(R)基因NBS保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),在小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中进行抗病同源基因cDNA全长的扩增。获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S11A11cDNA序列,该序列全长2923bp,编码878个氨基酸序列。生物信息学分析结果表明,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域。聚类分析表明,S11A11编码的蛋白与小麦抗叶锈病基因Lr1编码的蛋白亲缘关系较近,而与Lr10亲缘关系较远。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病基因同源序列,为最终克隆小麦抗叶锈病目的基因奠定了基础。     

小麦新抗源贵农775抗条锈性特征与遗传分析

发掘并利用不同类型抗条锈病基因,构建区域间抗病基因多样性差异布局,是阻遏条锈菌大区域传播、实现小麦条锈病持续控制的重要策略。为了明确小麦新抗源贵农775抗条锈性特征和抗性遗传规律,为其合理布局应用提供依据,文章利用10个条锈菌菌系进行苗期分小种鉴定;构建贵农775与感病品种Avocet(S)杂交后代F2:3及回交BC1遗传群体,利用小麦条锈菌流行小种CYR32和最近发现的对Yr26基因有毒性的新致病类型CH42,对贵农775进行抗条锈性遗传分析。结果表明,贵农775对包括CH42致病类型在内的所有10个供试菌系均表现为免疫或近免疫的抗病性反应,而中国当前主要条锈病抗源品种92R137、川麦42(YrCH42)、贵农22(YrGN22)及Yr24等均不抗CH42;抗病遗传分析结果表明,贵农775对小麦条锈菌小种CYR32和CH42的抗性分别由一对显性核基因控制,并且为不同的小种专化抗性基因。     

黄淮麦区小麦品种(系)中Yr26基因的SSR检测

选用与Yr26紧密连锁的SSR标记Xgwm11和Xgwm18结合田间抗性鉴定,对239份黄淮麦区小麦品种(系)进行检测,以明确Yr26基因在黄淮麦区小麦品种资源中的分布.结果表明:共有35份品种(系)含有与Yr26紧密连锁的SSR标记Xgwm18或Xgwm11的特征带,占检测样本的14.6%.在这35份材料中,31份田间抗性鉴定表现免疫至中抗,4份表现中感.分子标记检测与田间抗病性检测吻合度较好,该标记可以用于Yr26基因的分子标记辅助选择.综合分子标记和田间鉴定,31份小麦(系)含有Yr26基因,占102份抗病材料的30.39%.     

小麦抗条锈基因Yr69的连锁标记开发

抗条锈病基因Yr69对我国小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)小种具有广谱抗性,在小麦抗条锈病育种中具有重要价值.为提高分子标记辅助选择育种的效率,加快Yr69在小麦抗病育种中的应用,本研究利用条锈菌小种CYR34对包含340个小麦家系的'Taichung29/CH7086'...     

小麦品种贵农22号抗条锈基因遗传分析

贵农22号是利用簇毛麦(Haynaldia villosa)、硬粒小麦(Triticum durum)及普通小麦(Triticum aestuvum)杂交而育成的普通小麦品种,其抗中国目前流行和出现的条锈菌小种,已成为目前重要的抗小麦条锈病抗源。为了明确该品种抗锈遗传规律并进行应用前景评价,用一个流行的强毒性小种条中31号和一个突变弱毒性小种CY29-mut3,分别接种贵农22与国际已知抗锈基因品种Moro及感病品种辉县红双列杂交F2、F2代各株系幼苗,对贵农22号进行了抗锈性遗传分析,以便于在抗病育种中进一步应用。研究结果表明,贵农22号有三对独立遗传的抗条锈基因,暂定名为YrGui 1、YrGui 2和YrGui 3,它们表达稳定,不受亲本正反交影响,而并不具有Yr 10。Yr10基因载体品种Moto中有二或四对基因抗中国不同的条锈菌小种,不同小种及正反交对基因的表达有影响,为父本时其对CY29-mut3小种有两对完全显性基因、一对中度抗病基因及一对隐性抗病基因,而为母本时有一对完全显性基因和一对中度抗病基因起抗病作用;对条中31号,其为父本时有一对显性基因和一对隐性基因,为母本时可能存在两对累加作用基因或两对隐性抗病基因控制抗痫作用。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的分离与鉴定

利用抗病基因的保守结构设计引物,从抗叶锈病近等基因系材料TcLr24中扩增出一条703bp的条带RGAl,通过与GenBank比对,选取与RGAI高度同源的若干条带,在它们共有的保守序列位置设计引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE):ffL术扩增抗病同源基因cDNA全长.扩增到3条全长cDNA,经BLASTp比较,这些序列都舍有NBS保守结构域和多个LRR结构域.与很多已知植物抗病基因的功能相应区域一致.对FRGA-1,、FRGA-2和FRGA-3实时定量PCR分析,表明这3个基因在小麦叶片中都是组成型表达.本研究在小麦材料TcLr24中得到3条抗病基因同源cDNA全长,为研究小麦抗病基因奠定了基础.     

水稻抗稻瘟病近等基因系的cDNA微阵列分析

应用cDNA微阵列对来源于中156／谷梅2号重组自交系的水稻抗稻瘟病近等基因系G205和G71的稻瘟病菌胁迫基因表达谱进行了分析,发现有3个cDNA克隆的表达仅在抗病基因系G205接种病原菌12h后受到诱导,其中两个为功能已知基因,另一个为功能未知的新基因。另有35个差异表达克隆在两个近等基因系中均检测到,其中17个克隆的表达在G205和G71均受到病原菌的诱导,另外18个克隆的表达则在G205和G71均受到病原菌原抑制。序列分析表明,这些稻瘟病菌应答基因分别与防卫反应,信号传递,逆境胁迫和光合作用及糖代谢等功能相关,为植物抗病机制提供了相关信息。另外,Northern还证实了编码富含甘氨酸蛋白基因（Glycinerich protein Grp)的表达受稻瘟病病原菌的诱导,是一个稻瘟病诱导相关基因。     

两个紧密连锁的小麦苯丙氨酸解氨酶基因的分离与鉴定

利用一个小麦苯丙氨酸解氨酶基因PCR片段为探针,从小麦核DNA基因库中筛选出一个阳性噬菌体克隆,该克隆含有两个高度同源、紧密连锁、转录方向相同的小麦苯丙氨酸解氨酶基因PAL1与PAL2,它们之间的核酸序列同源性。为93％,相距约7kb,利用PAL1特异片段进行Southern分析,表明该基因在小麦基因组中具有多个拷贝。Northern杂交表明,经秆锈菌接种诱导,苯丙氨酸解氨酶基因在一对小麦抗-感近等基因系中差异表达：抗病等基因系中国春-Sr11携带与接种菌无毒性基因P11相对应的抗病基因Sr11,在接种4d后开始诱导表达,8d后表达量更高;而缺少抗病基因的感病系中国春-sr11接种6d后才开始表达,8d后的表达量与抗病系中6d时相当。用秆锈菌诱导物和几丁质寡聚物处理小麦悬浮细胞,均可在2h内激活苯丙氨酸解氨酶基因表达,但真菌诱导物在早期的诱导活性显著高于几丁质寡聚物。从转录水平证实了小麦苯丙氨酸解氨酶基因在秆锈菌诱导的抗性反应中具有重要作用。     

用变性PAGE-银染法鉴定小麦抗条锈基因Yr5的RAPD标记

以小麦抗条锈病基因Yr5的供体亲本Triticumspeltaalbum作为对照 ,对近等基因系Yr5 6×AvocetS和感病亲本AvocetS进行RAPD分析。扩增产物用 4%变性PAGE分离 ,银染显色。在变性PAGE上可以检测到 50～ 10 0条带 ,是琼脂糖凝胶电泳的 5倍以上。筛选了 2 40个随机引物 ,发现 2 3条稳定的多态性DNA片段 ,初步检测表明其中6条与Yr5基因具有连锁性。用 12 1株AvocetS和Yr5 6×AvocetS杂交制备的F2 代分离群体进一步进行的遗传连锁性检测表明 ,多态性DNA片段S13 2 0 2 0 7和S13 4 83 6 3 分别与Yr5基因完全连锁和紧密连锁。结果表明 ,用变性PAGE分离PCR产物并结合银染显色 ,提高了小麦RAPD分析的多态性水平 ,改善了实验的重复性     

一粒小麦×野燕麦衍生系细胞学特征及条锈病抗性鉴定

在一粒小麦与葡萄牙野燕麦远缘杂交后代中,选育了5个形态学稳定的抗条锈病衍生系(‘一粒葡’)YLP-1、YLP-7、YLP-9、YLP-13和YLP-16,为筛选含有外源染色体且抗性优良的植株,对该衍生系的细胞学特征和抗病性进行了鉴定。细胞学初步鉴定表明:根尖染色体数目均为2n=42,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体构型为2n=21Ⅱ;5个选系与‘中国春’杂交F1花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ的异常细胞构型率为16%～50%;初步鉴定这5个‘一粒葡’材料均为易位系,验证了‘一粒葡’是远缘杂交的后代。用9个条锈菌小种分别对9个株系进行苗期抗病性鉴定,有5个株系YLP-1-4、YLP-7、YLP-9-1、YLP-9-3、YLP-16-1对所有参试小种都表现为高抗,且与已知的Yr5、Yr10、Yr15、Yr24/Yr26基因不同,表明‘一粒葡’中可能含有新的抗病基因,可作为抗源用于小麦抗病育种。     

小麦高代品系中抗条锈病基因Yr69的分子标记检测

利用抗病基因改良品种的抗病性是防治条锈病危害的有效途径,育种过程中使用分子标记辅助选择(MAS,markerassisted selection)能够有效提高目标基因的选择效率。为了检测长4738/CH7086和烟农999/CH7086后代选系中是否含有抗条锈病基因Yr69并验证Yr69连锁标记的有效性,利用分子标记2AS33和人工接种鉴定的方法对2个群体的63个F6品系进行了标记检测和抗性评价。结果表明,长4738/CH7086后代的35个品系中有32个含有Yr69,且全部表现为抗病,1个品系未检测到Yr69但也表现为抗病;烟农999/CH7086后代的28个品系中有8个含有Yr69,其中7个抗性稳定,1个出现抗、感分离现象;63个品系中有3个基因型与表型不一致,2AS33检测的准确率为95.2%,可有效用于抗条锈病基因Yr69的分子标记辅助选择。筛选出的40个稳定抗病品系经过产量与适应性鉴定后可用于参加品种比较试验,也可作为优良亲本用于抗病育种。