海州香薷Actin基因片段克隆及表达分析

通过克隆海州香薷Actin基因片段并分析其组织表达,为研究海州香薷重金属抗性相关基因的表达调控奠定基础。根据Gen Bank中其他植物Actin基因保守序列设计兼并引物,以海州香薷根总RNA为模板,利用RT-PCR技术分离得到Actin基因片段。序列分析结果表明,海州香薷Actin基因片段长576 bp,编码192个氨基酸,与其他植物同源基因的氨基酸序列相似性为84%-97%,所克隆的序列为Actin基因的同源片段,将其命名为Eh ACT,在Gen Bank中提交序列,获得登录号AGT37260。半定量RT-PCR分析结果表明,Eh ACT在海州香薷的根、茎和叶中表达相对稳定,初步表明其可作为研究海州香薷基因表达的内参基因。     

梭梭肌动蛋白基因HaACT1全长的克隆与表达分析

根据本实验已克隆得到的梭梭肌动蛋白基因Ha ACT1部分序列,通过5'RACE技术获得HaA CT1的cDNA全长序列。序列分析表明,该基因c DNA全长序列1 534 bp,其中5'UTR序列为75 bp,3'UTR序列为325 bp,开放阅读框序列为1 134 bp,编码376个氨基酸。该序列与Gen Bank中收录的其它植物Actin基因核苷酸序列的相似性均在84%以上,并且它们的氨基酸序列的相似性达95%以上,Gen Bank登录号为KM886609。根据得到的c DNA序列设计全长引物,进一步克隆了Ha ACT1的基因组DNA序列,由4个外显子和3个内含子组成。利用半定量和绝对荧光定量PCR对Ha ACT1的表达进行分析,发现该基因在梭梭的不同组织及各种非生物胁迫下均能稳定表达,适合作为梭梭中其它功能基因表达研究中的内参基因。     

花椰菜BobACT基因的克隆及其作为内参基因的研究

实时荧光定量PCR技术是探索植物基因功能和调节机理的有效手段。选择合适的内参基因是获得实时荧光定量PCR准确性数据的必备条件。ACT基因高度保守且表达稳定,常作为内参基因被广泛应用。为了获得花椰菜ACT基因,以转录组测序和RT-PCR方法为手段克隆得到花椰菜肌动蛋白基因Actin。该基因等电点为5.395,理论分子量为41.77 kD;其cDNA开放阅读框长1134 bp,编码氨基酸377个,GenBank登录号为MG598643。Wolf Psort分析发现,BobActin蛋白亚细胞定位于细胞质基质中。Motif Scan分析显示,BobActin蛋白质的氨基酸序列4～377位为Actin保守结构域。进化分析表明,同源序列基因编码的蛋白质与同为十字花科的甘蓝、芜菁和油菜同源蛋白的相似性达到90%以上,具有高度的保守性。在此基础上,设计了1对荧光定量PCR引物,分析显示,该引物具有较高的特异性和扩增效率,在花椰菜根、茎、花、花球、叶片等不同组织和低温、高温、盐处理、干旱处理、ABA处理等胁迫处理下均能稳定表达,适合在花椰菜基因表达研究中作为内参基因,为开展花椰菜重要功能基因的挖掘、表达模式以及调控机理的研究提供参考。花椰菜在内参基因方面的研究还处于初步阶段,今后可继续克隆其他内参基因,丰富花椰菜的内参基因库,从而进一步提高花椰菜基因表达分析研究的稳定性、重复性和准确性。     

苎麻植物螯合肽合成酶(BnPCS1)基因的克隆和表达

根据苎麻转录组测序中的PCS基因片段,利用RT-PCR结合RACE技术从中苎1号中克隆获得了该基因的全长cDNA序列,命名为BnPCS1。该基因的cDNA序列全长为1956 bp,其中开放读码框长1512 bp,编码503个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为56.02 kD和7.01。与长喙田菁(ACT87974)、百脉根(Q2TSC7)、狼牙刺(AFM38979)、荷花(BAN08523)和杜梨(AEY68568)的PCS氨基酸序列相似性分别为74%、73%、75%、73%和77%。荧光定量PCR分析表明,BnPCS1在根、茎、茎尖、幼叶、成熟叶中均有表达,其中在成熟叶中的表达量最高,茎中表达量最低,并且该基因受镉和ABA诱导上调表达。BnPCS1基因的克隆将为苎麻抗重金属分子育种和进一步的功能分析奠定基础。     

马铃薯糖转运蛋白基因的克隆及表达分析

植物SWEET基因家族是一类糖转运蛋白,在植物的生理活动和生长发育过程中发挥着重要功能。为了解马铃薯SWEET基因的相关信息,探究其在马铃薯不同组织以及在生物胁迫与非生物胁迫下的表达特性。该研究采用同源克隆技术从马铃薯‘青薯9号’中克隆了StSWEET5基因(GenBank登录号为MN295671),其CDS序列长度为717 bp,编码238个氨基酸。系统进化树分析结果表明,StSWEET5与番茄的氨基酸序列相似性最高(97.06%)。qRT-PCR分析表明:StSWEET5基因在马铃薯各组织(根、茎、叶、花、块茎、匍匐茎)中均有表达,且在花中的表达显著高于其他组织;糖胁迫下,StSWEET5基因在根、茎、叶中均有表达,尤其在根中的表达差异最为显著(P0.05)。在晚疫病菌(Phytophthora infestans)诱导后36 h时,表达量达到最高,随后急剧下调。推测StSWEET5基因参与了马铃薯糖胁迫以及响应了晚疫病诱导的过程。     

珙桐CAC基因的克隆及其作为内参基因的评价

从珙桐(Davidia involucrata Baill.)中克隆到一个编码网格蛋白衔接蛋白复合物(Clathrin adaptor complexes,CAC)的基因,命名为DiCAC(Gen Bank登录号为KX268525)。该基因开放阅读框全长1 317 bp,编码438个氨基酸。同源序列比对与聚类分析表明,该基因与其它15种植物的CAC氨基酸序列的相似度达到94%以上,其中与葡萄CAC的氨基酸序列同源性最高。为评价该基因作为珙桐内参基因的可行性,结合5个珙桐管家基因(ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA),采用半定量PCR和实时荧光定量PCR对DiCAC基因在珙桐不同组织以及不同发育阶段苞片中的表达稳定性进行分析,并与常见管家基因的稳定性进行比较,结果表明,该基因在珙桐不同组织以及不同发育阶段苞片中均为稳定表达,且表达稳定性优于常见管家基因,可以作为相关基因表达研究中的内参基因。首次克隆到珙桐CAC基因,并且明确了其作为内参基因的可行性,为深入研究珙桐相关基因的表达分析提供了候选内参基因资源。     

油菜矮秆突变WRKY转录因子cDNA克隆及表达分析

以甘蓝型油菜为材料,利用已建立的抑制性消减文库(SSH),采用RACE技术克隆到1个植物WRKY转录因子相关基因,命名为BnD11,其cDNA全长1034 bp,含有810 bp的完整开放阅读框,编码269个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与拟南芥WRKY40氨基酸序列相似性为79%,与拟南芥中编码WRKY-DNA结合蛋白40基因的氨基酸序列相似性达78%,与其它多种植物的WRKY转录因子的氨基酸序列也有较高的相似性。半定量RT-PCR对BnD11进行组织特异性表达分析显示:在正常生长条件下,BnD11在野生型和矮秆油菜的各个组织中均有表达,但在矮秆突变的根、茎、茎尖的相对表达量明显高于野生型。研究表明,BnD11功能区段具有很高的保守性,可能参与了油菜的茎秆发育。     

植物根特异性基因表达研究

植物根中基因表达的调控近几年渐始受到注意,一些分离自植物病原的外源基因启劝子能在植物根中特异性地启动编码基因表达。部分植物基因组基因查明存在根特异表达调控元件和反式作用因子,已分离和克隆了部分未知功能的根特异性表达基因。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

植物根特异性基因表达研究

植物根中基因表达的调控近几年渐始受到注意,一些分离自植物病原的外源基因启动子能在植物根中特异性地启动编码基因表达,部分植物基因组基因查明存在根特异表达调控元件和反式作用因子,已分离和克隆了部分未知功能的根特异性表达基因。     

香蕉MaCAM基因克隆及表达分析

从香蕉根的cDNA文库中获得了一段香蕉钙调蛋白基因的片段,采用RACE技术获得其全长,命名为MaCAM。该基因全长845bp,编码149个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白属稳定蛋白,其等电点为4.12,有2个保守的EFh功能结构域。与已知植物的钙调蛋白基因相比,一致性达90%以上。其中与粳稻、油棕、胡萝卜、甘蔗的CAM编码的氨基酸序列的一致性分别为99.33%、96.71%、98.00%、98.66%。系统进化树比对分析显示,香蕉与甘蔗的亲缘关系最为密切。器官特异性分析表明,MaCAM在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,在根中表达量最高,花中次之,而在叶片中的表达量最低。     

丹参中硫堇基因SmTHI的克隆和表达分析

丹参EST序列的Blast分析表明,一条序列与硫堇（thionin,THI）基因有较高的同源性,该序列长575bp,包含1个长366bp的开放阅读框（ORF）,编码121个氨基酸,命名为SmTHI,GenBank登陆号为DQ212984。在此基础上设计引物,分别从cDNA和gDNA水平上克隆到该基因的全编码区序列的结果表明,该基因无内含子。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物的THI蛋白前体高度同源,并符合植物硫堇类蛋白的序列模式和特征：C—C—x（5）．R．x（2）-[FY]-x（2）-C,N端具17个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的58个氨基酸为酸性多肽部分。成熟的THI蛋白带正电荷,偏碱性,推测可能有抗病原微生物活性。实时定量PCR检测SmTHI在丹参不同组织部位的表达以及在黄瓜细菌性角斑病菌（PSL）、NaCl和水杨酸（sA）溶液诱导下的表达结果表明：SmTHI在植物的根、茎和叶中均有不同程度的表达,其表达丰度为叶〉茎〉根：在PSL、NaCl和sA溶液诱导下该基因的表达呈上调趋势。     

单链莫内甜蛋白基因的合成及其植物表达载体的构建

目的:合成单链莫内甜蛋白基因,构建其植物表达载体。方法与结果:根据已报道的单链莫内甜蛋白的氨基酸序列及甜味机理,重新设计合成了全长294bp的莫内甜蛋白基因,其中单链莫内甜蛋白氨基酸序列中的Asp69(原AspA16)突变为Asn。利用DNA重组技术,将莫内甜蛋白基因克隆到植物表达载体pBl221中,构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体pBI221-monellin。结论:构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体,为转化园艺植物以改善其口感奠定了基础。     

红树植物桐花树 E F1 A 基因的克隆与表达分析

通过 RACE 方法克隆到桐花树(Aegiceras corniculatum)的一个延伸因子基因, 命名为 AcEF1A(GenBank 登录号:KC416649)。该基因的 cDNA 全长 1 778 bp, CDS 为 1 350 bp, 编码 449 个氨基酸。多序列比对结果表明该氨基酸序列与琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)EF1A 的氨基酸序列高度相似(97.7%)。基因表达分析结果显示 AcEF1A 在茎尖中的表达量最高,叶片中的表达量次之, 根中的表达量最低。低温、高盐、干旱和重金属 Cd 胁迫下, 桐花树叶片中 AcEF1A 基因的表达水平有不同程度的上调。这些结果表明 AcEF1A 基因可能参与了植物的生长发育过程及逆境响应过程。     

百脉根液泡膜H+-PPase基因的cDNA克隆与分析

采用EST电子克隆和RACE技术从豆科模式植物百脉根中克隆到一个液泡膜H -PPase基因的cDNA,命名为LcVP1。该cDNA长为2962bp,含2304bp的完整开放阅读框,编码767个氨基酸,其推测的氨基酸序列与绿豆、拟南芥等I类液泡膜H -PPase的氨基酸序列同源性在80%以上,且有很高的功能区段保守性。该cDNA序列已提交GenBank,登录号为EF440187。半定量RT-PCR表明,LcVP1在根、茎、叶中的表达不同,叶中表达最多,茎中最少。     

花生响应干旱胁迫的FERONIA类受体蛋白激酶基因克隆与表达分析

FERONIA(FER)类受体蛋白激酶是CrRLK1L(Catharanthus roseus RLK1-like)激酶亚家族成员,在植物受精、细胞伸长、顶端生长以及非生物胁迫响应等方面起重要作用。本研究克隆了两个花生(Arachis hypogaea)FER类受体蛋白激酶基因AhFER1和AhFER2,它们的完整编码序列(CDS)和相应基因组DNA序列完全一致,说明AhFER1和AhFER2基因编码区均无内含子,分别包括2 655和2 640 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白分别含885和880个氨基酸,分子量分别为99.58和98.96 kDa,等电点分别为6.5和6.22。生物信息学分析发现,AhFER1及AhFER2的氨基酸序列与其他植物FER蛋白均具有较高同源性,都包含malectin-like和蛋白激酶催化域两个保守结构域。AhFER1和AhFER2基因在花生幼苗的叶、茎和根中的表达水平有差异:AhFER1基因在叶中表达量最高,其次是根,茎中表达量最低;而AhFER2基因则在茎中表达量最高,其次是叶,表达量最低是根。干旱胁迫对花生茎和根中AhFER1基因的表达以及花生叶、茎和根中AhFER2基因的表达均无影响,但干旱胁迫显著增强花生叶中AhFER1基因的表达,说明AhFER1基因可能在花生叶响应干旱胁迫时起重要作用。     

水母雪莲通气组织形成的相关基因SmLSD1克隆及表达

该研究以水母雪莲为实验材料,通过RT-PCR结合RACE技术克隆了通气组织形成相关基因SmLSD1(GenBank登录号为OL690334),并对该基因在不同胁迫下的表达量及编码蛋白结构进行测定分析。结果表明：(1)水母雪莲SmLSD1基因全长965 bp,包含537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸。(2)同源序列比对发现,水母雪莲SmLSD1蛋白与菊科植物牛蒡LSD1的氨基酸序列相似性最高,达到98.31%。(3)亚细胞定位显示SmLSD1基因主要在细胞核和细胞膜上表达;原核表达显示,SmLSD1基因编码氨基酸的分子量约为18 kD。(4)荧光定量分析显示,SmLSD1基因在根、茎、叶中均有表达,且在叶片中表达量最高;在低温、低氧及紫外胁迫下,SmLSD1基因的表达量下调。研究推测,SmLSD1基因在水母雪莲通气组织的形成以及对逆境胁迫的响应中发挥着重要作用。     

石蒜Mg^2＋转运体基因LrMGT的克隆与分析

从石蒜〔Lycoris radiata（L’Hér.）Herb.〕叶片全长cDNA文库中克隆获得Mg^2＋转运体（MGT）基因LrMGT。序列分析结果显示：LrMGT基因的cDNA序列全长1 726 bp,其中开放阅读框（ORF）长度921 bp,编码306个氨基酸。石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列的理论相对分子质量为33 635,理论等电点为pI 5.14,为疏水性膜蛋白,不具有信号肽。序列比对结果表明：石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列与小米〔Setaria italica（Linn.）Beauv.〕、水稻（Oryza sativa Linn.）和拟南芥〔Arabidopsis thaliana（Linn.）Heynh.〕等植物的MGT基因编码的氨基酸序列的相似性较高,相似度达到72%~76%;石蒜LrMGT基因与其他植物MGT基因编码的氨基酸序列的保守区域较大,均具有较高的保守性。在NJ系统树上石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列与禾本科（Gramineae）植物二穗短柄草〔Brachypodium distachyum（Linn.）Beauv.〕、水稻、高粱〔Sorghum bicolor（Linn.）Moench〕和小米MGT基因编码的氨基酸序列聚为同一个分支,表明它们可能具有较近的进化关系。实时荧光定量PCR结果表明：石蒜LrMGT基因在根和鳞茎中的相对表达量较高,在叶片和花中的相对表达量较低,具有明显的组织特异性。     

百脉根TALE转录因子家族的鉴定与生物信息学分析北大核心CSCD

三胺酸环延伸(TALE)蛋白是一类在植物生长发育过程中调控分生组织分化的转录因子。本研究通过生物信息学手段从豆科模式植物百脉根(Lotus japonicus(Regel)K.Larsen)全基因组中筛选出分布于6条染色体上的40条TALE家族基因,并对其保守结构域、基因结构、系统进化、在染色体上的分布、理化性质以及部分典型基因的组织表达差异等进行分析。根据结构域不同可将百脉根TALE家族分为BELL和KNOX两个亚族;百脉根TALE家族在进化上较为保守,分化上与大豆存在较大差异;该家族基因有外显子4～6个,氨基酸序列长度在271～792之间,家族成员蛋白均为弱酸性蛋白。Realtime PCR分析表明该家族基因表达与motif元件数之间存在相关性;BELL亚族主要在顶芽表达,KNOX亚族则主要在根组织中表达。研究结果为进一步克隆百脉根TALE基因和分析其功能奠定基础。     

柠条锦鸡儿肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆和分析

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质素特异合成途径中的关键酶。根据已报道的植物CCR基因序列设计简并引物,利用RACE技术,首次从柠条锦鸡儿(Caragana korshinkii Kom.)中克隆得到CCR基因全长cDNA序列,命名为CkCCR,GenBank登录号为HQ829859。该序列长1 270bp,具备长度为1 014bp的完整开放阅读框(ORF)。推导该基因编码的蛋白质有434个氨基酸,预测等电点6.69,分子量36.76kDa。序列分析发现,柠条锦鸡儿CCR基因推导的氨基酸序列与其它植物来源的CCR序列高度相似,并且具有植物CCR共有的氨基酸序列"KNWYCYGKA"以及NADPH的结合序列。系统进化分析显示,柠条锦鸡儿CCR与拟南芥CCR2处于同一分支,与同属豆科的银合欢CCR亲缘关系最近。利用荧光定量PCR技术对柠条锦鸡儿一个月龄幼苗基因转录水平进行检测,结果显示CkCCR基因在根、茎、叶中广泛表达,并且干旱处理初期表达量有所下降,处理后期又恢复到未处理时的表达水平。