盐胁迫下过量表达腺苷甲硫氨酸合成酶基因的转基因烟草的生长

以转腺苷甲硫氨酸合成酶基因（SsSAMS2）烟草纯合子ST8-9为实验材料,研究盐胁迫下过量表达SsSAMS2对转基因烟草生长影响的结果表明,200mmol·L-1NaCl处理后的转基因烟草的光合速率和生物量都比野生型烟草高,积累的自由多聚胺比较多,同时精氨酸脱羧酶的转录本也更丰富。显示转基因烟草的耐盐性比野生型烟草高,多聚胺在烟株缓解盐胁中可能是起了重要作用。     

转金属硫蛋白基因(MT_1)烟草耐NaCl胁迫能力

为明确柽柳(Tamarix sp.)金属硫蛋白(MT1)基因过量表达对提高植物耐NaCl能力的作用,对转MT1因烟草进行分子检测和生理特性分析,结果表明具有卡那霉素抗性的转基因植株经RT-PCR Southern杂交均表现为阳性,说明外源MT1基因已整合到烟草基因组,并且得到了表达。金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因烟草植株的耐NaCl能力,表现为在含有150mmol/L和300mmol/L NaCl的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株丙二醛(MDA)含量明显低于非转基因株系,而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性比非转基因株系明显增加。     

秋茄KcRD22基因的克隆与功能分析

本文以用200 mmol/L NaCl处理24 h后的秋茄幼苗为材料提取秋茄叶片总RNA,利用RT-PCR方法克隆获得KcRD22基因的全长cDNA,通过构建pCAMBIA-2300-KcRD22过表达载体,利用农杆菌侵染的方式获得过表达KcRD22的烟草转基因株系,并对转基因株系的耐盐性做出初步分析.实验结果显示:KcRD22基因的ORF长1 131 bp,编码1个等电点为9.07、分子量为39.8 kD、由375个氨基酸组成的蛋白.PCR及RT-PCR鉴定结果表明,KcRD22基因已经分别整合到8株烟草的染色体中,并在两个株系中获得表达.对转基因烟草进行光合作用测定,结果显示100 mmol/L NaCl处理显著降低了野生型烟草的净光合速率,而转基因植株叶片的光合作用受到的影响较小.盐浓度达到200 mmol/L时,转基因植株及野生型烟草净光合速率都明显降低,但盐胁迫解除后,转基因烟草光合作用的恢复情况明显好于野生型烟草,说明KcRD22的过表达提高了烟草的抗盐性.本文初步确定了KcRD22基因对植物耐盐性的贡献,这为进一步深入研究该基因在耐盐机制中的功能奠定了良好基础.     

磷胁迫对烤烟高亲和磷转运蛋白基因表达及磷素吸收利用的影响

为探明缺磷胁迫对烤烟磷吸收的影响机理,以烤烟品种‘豫烟10号’为材料,采用盆栽试验设置不施磷(-P)和正常供磷(+P)2个处理,分析了烟草生育后期根系和叶片中高亲和磷转运蛋白基因NtPht1;1、NtPht1;2(简称PT1、PT2)的表达差异性及其表达量与烟草磷含量、磷积累量的关系。结果表明:(1)随生育期的推进,烤烟根系和叶片的PT1基因相对表达量、PT2基因相对表达量、干物质重和磷素积累量逐渐增加,烟叶的磷含量逐渐降低,根系磷含量无明显的变化规律。(2)磷胁迫促使PT1、PT2基因的表达量上调,其中叶片PT1基因的相对表达量高于根系,叶片PT2基因的相对表达量显著低于根系。(3)磷胁迫限制了烤烟对干物质和磷素的积累,在移栽后90d,-P处理烤烟根系和叶片的干物质重、磷素积累量不到+P处理的一半,处理间差异极显著。研究认为,在缺磷环境下,烟草高亲和磷转运蛋白基因PT1和PT2表达量的增加,是由磷胁迫下烟草体内磷积累量降低所引起的系统性调控。     

OsPT6基因过表达对低磷条件下菜用大豆结瘤及固氮的影响

采用砂培方法,以转OsPT6基因的菜用大豆(T3株系)与其非转基因(NT)受体品种为实验材料,研究了两者在低磷条件下的生长发育指标,植株有效磷、全磷、全氮、豆血红蛋白和籽粒蛋白质含量以及谷氨酰胺合成酶活性的差异,并对植株结瘤及固氮相关基因表达进行检测,为阐明转OsPT6基因菜用大豆在低磷条件下结瘤及固氮相关机理提供理论依据。结果显示:(1)转基因植株的株高、茎粗、花数和荚数、根瘤数均显著高于NT植株。(2)转基因植株根、茎、叶及根瘤中有效磷,全株总磷、总氮含量,根瘤中的豆血红蛋白含量、功能叶片中谷氨酰胺合成酶的活性和籽粒蛋白质含量均显著高于NT植株。(3)相关性分析表明,豆血红蛋白含量、谷氨酰胺合成酶活性、总磷、总氮含量4个指标间均呈显著正相关关系。(4)GmENOD40a、GmENOD40b、GmGS1β1、GmGS1β2基因在转基因植株中的表达量显著高于NT植株。研究表明,OsPT6基因过表达增强了菜用大豆在低磷条件下的结瘤及固氮能力,该研究结果为进一步研究其调控机理奠定了基础。     

转枯草芽孢杆菌植酸酶基因烟草对不同介质中植酸磷的吸收利用

利用转入枯草芽孢杆菌植酸酶基因的不同烟草株系,分别在无菌培养基、砂培和土培试验中研究了转植酸酶基因烟草对植酸磷的吸收和利用.结果表明,在无菌培养基试验中,所有转植酸酶基因烟草对植酸磷的吸收利用能力均显著高于野生型,其生物量比野生型提高了3.6～10.7倍,总磷吸收量提高了2.2～4.6倍;在沙培和土培中,转植酸酶基因烟草对植酸磷的吸收利用与野生型相比,生物量和总磷吸收量差异不显著.这说明转植酸酶基因在无菌条件下可以提高植物吸收利用植酸磷的能力,但是在自然条件下,由于微生物分解或矿物固定等原因,其作用不稳定,需要进一步研究克服土壤中的限制因素,才能使转基因植物充分发挥作用.     

铁蛋白基因表达对烟草耐低铁能力的影响

铁是植物生长发育的必需元素。由于土壤中的三价铁离子不能被植物直接利用, 使一些植物经常表现出缺铁症状。为探讨利用铁蛋白基因提高植物耐低铁胁迫的作用, 利用农杆菌介导法将大豆铁蛋白基因SoyFer1和内源反义铁蛋白基因NtFer2的cDNA分别导入烟草基因组, 采集转基因烟草种子。对T1转基因烟草的卡那霉素抗性分析表明, 整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因, 也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR检测和Northern杂交分析表明, 外源基因已整合到烟草基因组中, 并且得到了正确表达。将转基因株系移栽到铁离子浓度不同的培养基中生长2个月后进行比较表明, 转大豆铁蛋白基因烟草株系的生长量明显高于非转基因烟草株系, 而转内源反义铁蛋白基因烟草株系的生长量则明显低于非转基因烟草株系。转大豆铁蛋白基因和转内源反义铁蛋白基因烟草株系的叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)活性等生理性状也发生了明显变化, 表现为转大豆铁蛋白基因株系的叶绿素含量明显增加, POD活性明显增强, MDA含量明显降低; 而转内源反义铁蛋白基因株系的叶绿素含量、POD活性和MDA含量等则表现为与转大豆铁蛋白基因株系的相反。铁蛋白过量表达提高了烟草耐低铁能力, 而铁蛋白抑制表达则降低了烟草耐低铁能力。     

AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响

为了研究AtNHX5基因在植物耐盐中的作用,构建了植物过量表达载体pROKⅡ-AtNHX5,并转化拟南芥。结果显示:(1)RT-PCR检测表明,转基因拟南芥中AtNHX5基因的表达大幅提高。(2)对转基因纯合株系进行耐盐性分析显示,AtNHX5过量表达提高了植株在种子萌发和苗期的耐盐性。(3)转基因植株在盐处理下的干重、鲜重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。在200mmol/L NaCl处理下,以转基因株系a1-4为例,其地上部分单株鲜重、单株干重、K+含量分别是野生型的1.27、1.54、1.16倍,较野生型显著升高。研究表明,过量表达AtNHX5基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收,转基因拟南芥的耐盐性明显提高。     

超表达拟南芥2-烯醛还原酶基因对烟草抗旱性的作用机理分析

为研究是否可以利用2-烯醛还原酶(AER)来清除活性氧下游的醛自由基达到提高植物的抗旱性,以超表达拟南芥AER基因烟草和野生型烟草(SR)为研究材料,利用干旱胁迫处理进行抗旱性分析,测定了干旱胁迫及复水后各个烟草株系的生物量、光合速率、叶绿素荧光参数、叶绿素含量、MDA和H2O2含量等指标。结果显示:(1)干旱胁迫下,转基因烟草株系的生物量、叶绿素含量、净光合速率、PSⅡ最大光化学效率及H2O2的清除能力均显著高于对照;(2)复水之后,烟草植株的各项生理指标都得到一定程度的恢复,而转基因株系相比于野生型恢复迅速,恢复能力更强。研究认为,超表达AER基因可以通过清除活性氧及其下游醛自由基来提高烟草的抗旱能力。     

超表达小麦硝态氮转运蛋白基因TaNRT2.1对拟南芥生长及氮吸收的影响

为了阐明小麦硝态氮转运蛋白(nitrate transporters,NRT)TaNRT2.1及辅助蛋白TaNAR2.1的硝态氮转运功能,本研究构建了TaNRT2.1单基因(单超)与TaNRT2.1+TaNAR2.1双基因超表达载体(双超),通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥,利用潮霉素筛选与PCR鉴定分别获得了3个单超与2个双超的转基因拟南芥纯合株系。通过研究转基因拟南芥的硝态氮吸收动力学及氮含量发现:在硝态氮浓度1 mmol·L~(-1)时,仅双超能够显著提高拟南芥的硝态氮吸收速率;硝态氮浓度1 mmol·L~(-1)时,不论单超还是双超均不能提高拟南芥的硝态氮吸收速率。低氮(0.1 mmol·L~(-1) NO_3~-)条件下,2种转基因拟南芥的生长状况和氮吸收与野生型相比均无显著差异;而在高氮(10 mmol·L~(-1) NO_3~-)条件下,单超提高了拟南芥的角果重和植株生物量,双超则显著提高了拟南芥的生物量、根系生长和总吸氮量。这些结果表明,TaNRT2.1转运蛋白需与辅助蛋白TaNAR2.1联合才能调控拟南芥对硝态氮的转运。     

水稻磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及功能分析

以水稻叶片为材料, 设计一对特异引物, 获得了编码磷酸盐转运蛋白基因OsPT6:1. 聚类和氨基酸保守位点分析指出该基因可能为水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白编码基因. 原位杂交与RT-PCR表达结果确定此基因在根与叶片中均表达, 尤以低磷诱导下叶片的叶肉细胞表达量最高. 同源重组表明该基因的表达可以提高毕氏酵母对磷素的吸收效率, 同时其基因的导入可以使高亲和力磷酸盐转运蛋白缺失的酵母突变体的磷素吸收功能得以恢复. 以上结果表明, OsPT6:1为水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白的编码基因.     

小黑杨PsnHB22基因在烟草中的遗传转化研究

HD-Zip转录因子在光信号转导、非生物胁迫、叶片发育等方面发挥重要的作用，HB22转录因子是HD-ZipⅠ亚家族的成员之一。为研究PsnHB22基因的功能，从小黑杨（Populus simonii×P.nigra）cDNA中克隆PsnHB22基因并构建植物表达载体进行烟草（Nicotiana tabacum）的遗传转化，以获得该基因过量表达的转基因株系。对转基因株系进行PCR、qRT-PCR分子检测后观察表型，结果显示在营养生长时期，转基因烟草叶片窄小并且株高显著低于野生型对照。测定转基因烟草及野生型叶片的叶绿素含量，发现转基因烟草叶绿素含量显著高于野生型。由此推测PsnHB22基因在植株高生长、光合作用及叶片的形态建成等过程中起着重要的作用。     

过量表达拟南芥CAT提高烟草对气体甲醛的吸收和抗性

为提高植物对甲醛的吸收和耐受,利用拟南芥CAT的编码区构建植物过表达载体pk2-Prbc S-*T-CAT,在野生型(WT)烟草叶绿体中过量表达CAT产生2个表达量不同的转基因株系(C1、C3)。用10ppm、20ppm和40ppm气体甲醛处理WT和转基因烟草,分析过量表达CAT的转基因烟草对甲醛的吸收效率和耐受性。结果表明,转基因烟草对气体甲醛的吸收量明显高于WT,且随着处理浓度的升高,转基因株系叶片的可溶性总糖、总蛋白质和总叶绿素含量都显著高于WT;转基因株系叶片氧化损伤指标H202、丙二醛(MDA)和羰基化蛋白(PC)的含量都显著低于野生型。转基因烟草(C1)的PM H+-ATPase和氢泵活性在40ppm处理后为WT的3倍和2.5倍,C1的气孔导度为WT的2.67倍。这些结果表明,在烟草中过量表达拟南芥CAT能降低甲醛进入烟草细胞引起的氧化损伤,提高烟草对甲醛的脱毒能力,增强烟草对甲醛的吸收和抗性。揭示气体甲醛胁迫时质膜H+-ATPase和氢泵活性影响叶片气孔的导度,这可能是转基因烟草甲醛吸收效率提高的原因之一。     

胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因的克隆及转化植株耐盐性分析

胡杨(Populus euphratica Oliv.)具有极强抗盐碱能力。本实验室前期胡杨微阵列芯片数据结果显示:盐胁迫下,胡杨谷胱甘肽过氧化物酶基因(PeGPX)的转录上调,暗示该基因可能对胡杨耐盐性具有一定的作用。为分析 GPX 对植物耐盐性的贡献,本研究以胡杨为材料,利用 RT-PCR 方法克隆了胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因,并在烟草中过量表达该基因,以分析谷胱甘肽过氧化物酶活性与植物耐盐性的关系。研究结果显示,实验中克隆的 cDNA (PeGPX)编码谷胱甘肽过氧化物酶,其 ORF 为 693 bp,其蛋白由 231 个氨基酸编码。过量表达 PeGPX 基因的烟草与野生型烟草的耐盐性实验结果显示,野生型烟草植株在加 NaCl(200 mmol/L)的 MS 培养基中生长 15 d 后,无明显的长高,且不长根;而转基因烟草在同样的加盐培养基上,生长基本没有受到抑制,植株生长状态良好,并且能够长根。光合数据显示,在盐胁迫下过量表达 PeGPX 基因烟草的净光合速率受到影响明显小于野生型烟草的净光合速率。酶活数据显示,转基因株系 GPX 酶活与野生型的相比在盐胁迫下活性有非常显著的提高。我们的研究结果说明:过表达 PeGPX 基因使得烟草的耐盐性得到显著提高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。     

PTLF-PTAG-IR对转基因烟草开花的抑制效应

PTLF(LEAFY同源基因)和PTAG(AGAMOUS同源基因)是杨树中控制花发育的重要基因,为了解RNA干涉同时抑制PTLF和PTAG对花发育的影响,本研究采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将35S::PTLF-PTAG-IR导入烟草(Nicotiana tabacum)。经PCR检测获得了15株阳性转化株系,进一步的Southern分析证实PTLF-PTAG-IR基因已整合到烟草基因组中。荧光定量分析结果显示,转基因烟草内源NFL(LEAFY同源基因)和NAG1(AGAMOUS同源基因)的表达量均低于野生型。对开花时间调查的结果表明:与野生型烟草相比,53.3%的转基因株系开花受到完全的抑制,26.7%的转基因株系开花时间平均推迟34.3d,仅20%的转基因株系与野生型在同一时期开花。另外,对转基因烟草花器官的观察发现花瓣形态,雄蕊着生方式、数目等方面发生变异,这些研究结果表明过量表达35S::PTLF-PTAG-IR对烟草花发育起到抑制作用,本研究将为利用转基因手段获得不育材料提供参考。     

烟草磷转运蛋白基因NtPHT2;1的克隆和表达分析

植物对磷酸盐的吸收与利用主要依靠磷转运蛋白,其中PHT2家族编码的低亲和磷转运蛋白主要负责植物在正常供磷条件下磷酸盐的吸收、转运与再利用。为了探究低亲和磷转运蛋白基因NtPHT2;1在烟草转运磷酸盐中的作用和表达模式,本研究以普通烟草K326的cDNA为模板,克隆得到NtPHT2;1,对该基因进行生物信息学分析和蛋白质的亚细胞定位,并通过荧光定量PCR技术对该基因在低磷等非生物胁迫下的基因表达模式进行分析。结果表明：（1）NtPHT2;1基因的全长为1 764 bp,编码587个氨基酸。（2）亚细胞定位结果表明,NtPHT2;1蛋白定位于叶绿体上。（3）同源性比对发现,NtPHT2;1蛋白与辣椒CaPHT2;1蛋白的同源性最高达到91.00%。（4）启动子分析表明,NtPHT2;1启动子含有参与调控植物衰老、逆境胁迫相关的顺式作用元件。（5）组织表达模式分析表明,NtPHT2;1在叶片中的表达量最高,新叶中的表达量比老叶中的高;在低磷诱导条件下,该基因的表达量与正常条件相比差异不显著。（6）不同非生物胁迫下的表达模式表明,在盐胁迫和干旱胁迫下,该基因的表达量显著降低。研究认为,NtPHT2;1基因主要是负责烟株正常生长发育条件下磷酸盐的转运与利用。     

过量表达AtNHXS1新基因提高烟草耐盐性的研究

拟南芥液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白是由 AtNHX1 基因编码的一种重要的植物耐盐性因子。 AtNHXS1 是利用DNA改组(DNA shuffling)技术对 AtNHX1 基因进行定向分子进化获得的新基因。利用农杆菌介导的叶盘法将该基因转入烟草中,经过潮霉素和PCR鉴定,得到了10个独立的转基因株系。对其中两个PCR阳性株系进行Southern blot 鉴定,确定 AtNHXS1 以单拷贝的形式成功地插入到烟草的基因组中。荧光定量PCR分析表明, AtNHXS1 基因可以利用烟草的转录体系正确转录。在盐处理下,随着盐浓度的提高,植株不同组织部位 AtNHXS1 基因的表达均有不同程度的提高,其中叶片上调趋势最明显。耐盐性试验结果表明,盐处理下,转基因烟草的长势明显优于野生型。400 mmol/L NaCl 处理下,野生型烟草完全死亡,转基因烟草生长受到抑制,但是仍然能够正常生长。研究结果表明, AtNHXS1 新基因能够显著提高烟草的耐盐性。     

铁蛋白基因表达对烟草耐低铁能力的影响

铁是植物生长发育的必需元素。由于土壤中的三价铁离子不能被植物直接利用。使一些植物经常表现出缺铁症状。为探讨利用铁蛋白基因提高植物耐低铁胁迫的作用,利用农杆菌介导法将大豆铁蛋白基因SoyFer1和内源反义铁蛋白基因NtFer2的cDNA分别导人烟草基因组,采集转基因烟草种子。对T1转基因烟草的卡那霉素抗性分析表明,整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因,也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到烟草基因组中,并且得到了正确表达。将转基因株系移栽到铁离子浓度不同的培养基中生长2个月后进行比较表明,转大豆铁蛋白基因烟草株系的生长量明显高于非转基因烟草株系,而转内源反义铁蛋白基因烟草株系的生长量则明显低于非转基因烟草株系。转大豆铁蛋白基因和转内源反义铁蛋白基因烟草株系的叶绿素含量、丙二醛（MDA）含量和过氧化物酶（POD）活性等生理性状也发生了明显变化,表现为转大豆铁蛋白基因株系的叶绿素含量明显增加,POD活性明显增强,MDA含量明显降低：而转内源反义铁蛋白基因株系的叶绿素含量、POD活性和MDA含量等则表现为与转大豆铁蛋白基因株系的相反。铁蛋白过量表达提高了烟草耐低铁能力,而铁蛋白抑制表达则降低了烟草耐低铁能力。     

转彩色马铃薯StAN1基因的烟草幼苗耐旱性分析

该研究以转彩色马铃薯StAN1基因烟草为材料、野生型烟草(WT)为对照,测定分析转StAN1基因烟草在种子萌发期、幼苗期和苗期对干旱(甘露醇)处理的耐受情况,并对苗期旱热共同胁迫的耐受情况进行测定分析,以探讨彩色马铃薯StAN1基因的功能,为耐旱彩色马铃薯育种提供新路径。结果显示:(1)转StAN1基因烟草鉴定显示,阳性率为82.6%,且转基因烟草的叶片明显变紫,花青素含量极显著高于野生型烟草。(2)在培养基甘露醇浓度为150 mmol/L时,点播在培养基上的转基因烟草种子第5天时的萌发率达到了7%,是野生型烟草萌发率的2.3倍。(3)在甘露醇浓度为0和100 mmol/L的培养基上竖直培养时,转基因烟草的根长分别是野生型烟草的1.46和1.30倍,根长比野生型烟草显著增长。(4)在干旱胁迫下,转基因烟草幼苗叶片中的脯氨酸含量以及超氧化物歧化酶活性均显著高于野生型烟草,丙二醛含量均显著低于野生型烟草。(5)转基因烟草LEA基因和ERF基因在干旱和旱热处理中的相对表达量均高于野生型烟草。研究表明,StAN1基因在提高植物花青素含量的同时也提高了植物的耐旱性。     

异源过表达胡杨PeDWF4基因提高烟草对非生物胁迫的耐性

本研究以烟草为材料异源过表达了胡杨PeDWF4基因,选取T1代的转基因阳性植株和野生型烟草幼苗水培培养50 d后对其分别施加100 mmol/L Na Cl、100 mmol/L甘露醇和100μmol/L Cu SO4进行处理,通过测定其植株生物量、叶绿素含量、抗氧化酶系统酶SOD和POD活性,渗透调节物质(脯氨酸,可溶性糖和可溶性蛋白)含量等,研究在不同非生物胁迫下PeDWF4转基因烟草对胁迫的生理生化响应及过量表达PeDWF4基因对其抗逆方面的影响和作用。结果表明,(1)异源过表达PeDWF4基因可显著提高转基因烟草的植株鲜重和生物量;(2)在3种胁迫下,转基因烟草通过减少叶片内叶绿素的降解,增加抗氧化系统酶SOD和POD活性以及提高渗透调节物脯氨酸等的含量等方式来减少非生物胁迫对自身的伤害。以上结果表明,异源表达PeDWF4基因可能是通过提高了转基因烟草內源的BR含量,从而提高了烟草对于以上3种非生物胁迫的耐性。