枯草杆菌依赖链霉素、抗链霉素突变体及其核糖体蛋白质

从枯草杆菌分离到依赖链霉素和抗链霉素突变体,并且对这两种突变体作了遗传学图。通过三因子转化实验把str标定在cysA 14和cry之间。把ATCC6633菌株的图距和168菌株的图距加以比较,可知ATCC 6633菌株的Str~d和Str~s突变都发生在str位点上,而ATCC 6633的str相当于168菌株的strA。用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法分析了依赖链霉素、抗链霉素突变体和野生型的核糖体蛋白质,未曾见到三者S12蛋白质的电泳图谱有明显的差异。     

枯草杆菌168核糖体蛋白质基因突变

用NTG诱变一株B.subtilis168依赖链霉素突变体SD103,筛选不依赖链霉素的温度敏感突变体,用凝胶电泳分析它们核糖体蛋白质的改变,发现30％以上的突变体在电泳凝胶上出现改变的核糖体蛋白质,因此这是一种获得多种B.subtilis核糖体蛋白质穿变的简便而有效的方法。     

核糖体蛋白质的翻译特异性——遗传密码翻译装置对信使RNA的选择性

分子遗传学泰斗J.D.Watson于1957年首先对核糖体进行系统的研究。其后经许多科学家的共同努力,核糖体的结构已经基本研究清楚。然而对核糖体蛋白质的确切功能,却仍然一无所知。1979年以来,本实验室主要从事分离核糖体蛋白质突变体,研究核糖体蛋白质突变对基因表达的影响。发现在S12突变体中,碱性蛋白酶活性下降,而中性蛋白酶活性正常。到目前为止,我们分离鉴定了的枯草杆菌核糖体蛋白质突变体总数居世界首位。我们研究了核糖体蛋白质突变对噬菌体基因组表达的影响。发现在S12的依赖链霉素突变体中,噬菌体(?)105裂解量下降;蛋白质合成受阻;而RNA和DNA合成正常。测定了噬菌体(?)29在27种共44株核糖体蛋白质突变体中的成斑率。在多数突变体中,成斑率下降,最低达10~(-6);少数升高,最高达三倍;还有一些升降都不明显。大肠杆菌C600的S12发生依赖链霉素突变,λ噬菌体的成斑率和相对产量大大降低,而T4和T7的成斑率正常。大肠杆菌1.1485(λcI857)的S12发生依赖链霉素突变,λcI857的诱导释放量大大降低,而T4的成斑率反有所增加。在大肠杆菌A19野生型菌株中,λ噬菌体的N基因表达正常;核糖体蛋白质S10,S16,S19,S20和L3发生突变,能抑制N基因表达;L21 L25,L24突变,N基因不能表达;L27突变,促进N基因表达;S8,L6,L7/L12,L     

枯草杆菌核糖体蛋白质L20基因突变的遗传分析

从一株依赖链霉素的菌株SD103,分离出一株不依赖链霉素的温度敏感突变体SDN98,其表型是由rplT和ts两个突变决定的。遗传分析指出,rplT位于leuA和pheA之间,远离复制始区的主要核糖体蛋白质基因群,而ts突变却在主要核糖体蛋白质基因群内的ery和sgcA之间。L20蛋白质的改变没有影响活体~3H-尿嘧啶和~(14)C-氨基酸的参入活性。     

核糖体蛋白质的翻译特异性— 遗传密码翻译装置对信使RNA的选择性

分子遗传学泰斗J. D. Watson于1957年首先对核糖体进行系统的研究。其后0. 许多科学家的共同努力,核糖体的结构已经基本研究清楚。然而对核糖体蛋白质的确切 功能,却仍然一无所知。1979年以来,本实验室主要从事分离核糖体蛋白质突变体,研 究核糖体蛋白质突变对基因表达的影响。发现在S12突变体中,碱性蛋白酶活性下降, 而中性蛋白酶活性正常。到目前为止,我们分离鉴定了的枯草杆菌核糖体蛋白质突变体 总数居世界首位。我们研究了核糖体蛋白质突变对噬菌体基因组表达的影响。发现在 S12的依赖链霉素突变体中,噬菌体娜05裂解量下降;蛋白质合成受Pf-;而RN A和 DNA合成正常。测定了噬菌体价29在27种共44株核糖体蛋白质突变体中的成斑 率。在多数突变体中,成斑率下降,最低达10-6;少数升高,最高达三倍;还百一些升降都 不明显。大汤杆菌C600的S12发生依赖链霉素突变,x噬菌体的成5k率和相对产量 大大降低,而T4和T7的成斑率正常。大肠杆菌1.148叹Xc 1857）的S12发生依赖 链霉素突变,肠1857的诱导释放量大大降低,而T4的成斑率反有所增加。在大肠杆菌 A19野生型菌株中,I噬菌体的N基因表达正常;核糖体蛋白质S10, S16, S19, S20 和L3友生突变,能抑制N基因表达;L21 + L25, L24突变,N基因不能表达;L27突 变,促进N基因表达;S8,L6,L7ZL12,L14禾L23突变,对N基因表达没有明显影响。 把N基囚克隆在质拉上,用功能互补的方法,测定N基因表达的程度。结果清楚表明, S12发生依赖链霉素突变,N基因不能表达;发生杭链霉素突变,却表达正常。综合以上 实验结果,可见不同的核糖体蛋白质突变时同一基因表达的影响不同;同一核糖体蛋白 质突变对不同基因表达的影响也不同。还有一些核糖体蛋白质突变,对其他基因表达没 有明显的影响。     

枯草杆菌的庆大霉素抗性突变体的研究

以EMS诱变分离得到30株抗庆大霉素突变体,并研究了它们的特性。某些突变体的蛋白质和ENA合成速率降低。4个突变体有核糖体蛋白质的改变,其中两株改变S17蛋白质,两株包含有一个额外的核糖体蛋白质,这些改变都不决定庆大霉素抗性表型。遗传分析指出,gen′基因和cysA紧密连锁,基因顺序是cysA-ery~r-spcA-gen~r,并且额外蛋白质位点和cysA连锁。     

枯草杆菌70S核糖体蛋白质的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳

原核生物的核糖体,其大亚基由34种蛋白 质和两种RNA构成,小亚基由21种蛋白质和 一种RNA构成。在原核生物中,以大肠杆菌的 核糖体研究得最为详细。根据前人报道,抗链 霉素或依赖链霉素的大肠杆菌突变体的核糖 体,其小亚基第12号蛋白质（简称S12）上第 42位或第87位氨基酸发生了变化［[z3。本实验 室前曾报道：枯草杆菌ATCC 6633菌株的依 赖链霉素突变体全部表现为寡抱子突变体,而 抗链霉素突变体的抱子形成则正常^[1]。由大肠 杆菌的研究结果推断：本实验室分离的这些突 变体中,核糖体蛋白质可能发生了某些变化,为 此试图用双向聚丙烯酸胺凝胶电泳的方法分析 其核糖体蛋白质。     

枯草杆菌核糖体蛋白质突变对碱性蛋白酶基因表达的影响

用枯草杆菌体外转录-翻译偶联系统检测13种19株枯草杆菌核糖体蛋白质突变对碱性蛋白酶基因表达的影响,发现10种13株核糖体蛋白质突变能影响碱性蛋白酶基因的表达。其中依赖链霉素突变核糖体几乎不能翻译碱性蛋白酶mRNA。依赖链霉素突变在翻译层次抑制碱性蛋白酶基因的表达,但对中性蛋白酶基因的表达没有影响。在碱性蛋白酶mRNA翻译起始区有一个复合二级结构,用体外突变方法破坏其中一个,翻译效率提高8.2倍。依赖链霉素突变和抗链霉素突变核糖体的高级结构不同,与碱性蛋白酶mRNA 5'端片段的亲合力也有差异。由于碱性蛋白酶mRNA翻译起始区的复合二级结构和低起始强度以及依赖链霉素突变核糖体高级结构的改变,使依赖链霉素突变核糖体不能翻译碱性蛋白酶mRNA。     

用链霉素分离枯草杆菌孢子形成突变体

本文首次报道了枯草杆菌依赖链霉素突变体不能形成孢子、抗链霉素突变体孢子形成正常的现象。已知链霉素作用于核糖体,而核糖体是转译遗传密码的场所,所以这类孢子形成突变体可能与其转译水平的调节不全有关,对从转译水平研究基因表达的遗传调节可能会有重要意义。本文作者于1973年7月将本文投寄《遗传学通讯》编辑部。当时由于受“四人帮”反革命修正主义路线的干扰,本文曾被扣压,不准发表。现在,粉碎了“四人帮”,排除了“四人帮”的干扰,特将本文发表在这里。     

枯草杆菌(Bacillus subtilis)链霉素座位的自发突变

枯草杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633 ET(原养型,对链霉素敏感)当涂布在含有链霉素40微克／毫升的肉汤洋菜培养基上,存活率降低到10-9左右。在存活的细菌中,90％以上、甚至全部都是依赖链霉素突变体,抗链霉素突变体只占10％以下。依赖链霉素突变体与抗链霉素突变体菌落形态不同。依赖链霉素突变体在Burkholder的基本培养基上,须补加1000微克谷氨酸／毫升,才能生长。傍徨测验的结果表明依赖链霉素突变体是由于原敏感菌在接触链霉素以前发生突变而产生的。突变频率因链霉素剂量不同而异,并且随着培养时问的不同而作规律性的变化。用重新滁布的方法进行的实验表明,依赖链霉素突变体在绝对不接触链霉素的情况下,似乎也有进行细胞分裂的可能。依赖链霉素突变体可发生回复突变。回复突变的频率约为10—。回复体的表型与原敏戚菌相同。将回复体涂布在合有链霉素的培养基上,可分离到二级突变体。=级突变的频率较一级突变的频率约高一百倍。=级突变体为部分依赖链霉素突变体。以回复体作为给体或受体与野生型进行转化的实验结果汪明,在回复体中仍包含着依赖链霉素突变,故回复突变系由于另一座位发生抑制突变而产生。     

枯草杆菌复制始区主要核糖体蛋白质基因群中两个新突变的遗传研究

我们分离到19株螺旋霉素抗性(spi~R)突变体和49株核糖霉素抗性(Rib~R)突变体。其中有5株带有改变的核糖体蛋白质,这些蛋白质是:S4,S5,L18,L23和L13,它们的改变同抗菌素抗性表型没有因果关系。遗传定位spi和rib在主要核糖体蛋白质基因群中,基因排列的顺序是:cysA—rib—rpsL—spi—ts-5—rpsC—rpsE—ts。L23蛋白质基因也在rpsL—rpsC区,L18蛋白质基因不在这一区域内。带有L18蛋白质基因突变的SP4菌株的大分子合成速率都比对照菌株低,而仅带有L23蛋白质基因突变的TDL23菌株,RNA合成速率降低,蛋白质合成速率与对照菌株相差不大,这是TDL23的mRNA合成蛋白质能力提高的结果。     

枯草杆菌抗托普霉素不生孢子突变体

EMS诱变Bacillus subtilis 168,分离出110株抗托普霉素突变体,根据它们在不同温度时的生长表型可以分为三种类型。Tob~R突变对卡那霉素、新霉素和庆大霉素具有交叉抗性。90％的突变体含有一个tob~r spo~-单突变,某些Tob~R spo~ 转化体附加有另一个抑制spo~-的突变。转导和转化分析指出tob~r基因位于strA和spcA之间,靠近ery~r基因。一个温度敏感突变基因(ts)紧密连锁spcA。它们的排列顺序为cysA-strA-ery-tob-spcA-ts。以双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了32株突变体的核糖体蛋白质,在凝胶上没有发现有任何核糖体蛋白质的表观改变。     

淀粉酶生产菌(Bacillus subtilis BF-7658)孢子形成突变体的分离和特性

从一个工业上生产α-淀粉酶的枯草杆菌(Baciltus subtilis)BF-7658菌株中分离出自发的依赖链霉素、抗红霉素孢子形成突变体。这些突变体能正常营养生长,但不能正常形成孢子;同时蛋白酶、抗菌素活性降低,转化分析说明这些性状的改变是单一突变的结果。     

Bacillus subtilis核糖体蛋白质S13和BL18突变体的遗传分析

以诱变分离得到Bacillus subtilis W168核糖体蛋白质S3、S7、S8、S11、S13、BL2、BL6、BL7突变体。通过遗传分析定位了S13和BL18基因。S13基因(rps M)位于主要核糖体蛋白质基因群str A-spc A区中,而BL18基因(rpl S)和pyr D紧密连锁。BL 18突变对细胞RNA和蛋白质合成以及噬菌体φ29的成斑率没有明显影响。     

大肠杆菌中核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制λN基因的表达

将质粒pKC101上λcI基因切除,建成新质粒pHD109。用F'cI857控制质粒pHD109上λN基因的表达。结果表明：（1）核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制λN基因的表达;（2）F’cI857对质粒pHD109上λN基因表达的调节,受温度的控制。     

大肠杆菌中核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制λN基因的表达

将质粒pKC101上λcI基因切除，建成新质粒pHD109。用F'cI857控制质粒pHD109上λN基因的表达。结果表明：（1）核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制λN基因的表达；（2）F’cI857对质粒pHD109上λN基因表达的调节，受温度的控制。     

定量蛋白质组学分析链霉素耐药和敏感结核分枝杆菌临床分离株

[目的]发现结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)链霉素耐药相关的潜在菌体蛋白.[方法]以结核分枝杆菌临床分离链霉素敏感株01105和结核分枝杆菌H37Rv为对照,采用iTRAQ技术和生物信息学鉴定并相对定量结核分枝杆菌临床分离链霉素耐药株01108菌体蛋白,并通过WEGO功能注释聚类分析01108菌株差异表达蛋白的细胞组分、分子功能和生物进程.[结果]01108菌株分别与01105菌株和H37Rv菌株比较差异表达蛋白为194个和146个,01108菌株与01105菌株和H37Rv比较均差异表达蛋白121个(共同差异表达蛋白).差异表达蛋白理论相对分子量和等电点分布广泛,其生物进程主要参与中间代谢、呼吸作用和脂质代谢,分子功能主要为催化活性功能和结合功能.共同差异表达蛋白:7个核糖体蛋白(Rv2785c,Rv0056,Rv0641,Rv0652,Rv0701,Rv1630和Rv2442c)在01108菌株中表达下调;7个蛋白在01108菌株中显著差异表达(上调大于1.20倍或下调小于0.55倍),分别为巯基过氧化物酶(Rv1932)、酰基载体蛋白脱氢酶(Rv0824c)、30S核糖体蛋白S15 (Rv2785c)、丙酮酸脱氢酶E2部分(Rv2215)、双组份转录调控蛋白(Rv3133c)以及假定未知蛋白(Rv2466c和Rv2626c).[结论]iTRAQ发现了链霉素耐药结核分枝杆菌相对于链霉素敏感结核分枝杆菌和H37Rv共同差异表达蛋白,为进一步探讨结核分枝杆菌链霉素耐药机制奠定了基础.     

核糖体蛋白质在翻译层次上调节λN基因表达的机理

报道大肠杆菌核糖体蛋白质S1 2或L2 4突变体均可以在翻译层次上抑制λN基因表达 .为研究其机理 ,用DNA外切酶Ⅲ(DNAExoⅢ)对λN lacZ融合基因上的λN基因部分进行了 5′→ 3′的缺失 ,以期改变λN基因的TIR(Translationalinitiationregion)或编码区 .经DNA序列分析共得到 2 3种缺失的λN lacZ融合基因 .比较它们在野生型菌株与核糖体蛋白质突变体内的β 半乳糖苷酶活性的结果表明 :( 1 )核糖体蛋白质S1 2突变体可以影响 30S小亚基同λN基因的TIR识别与结合 ,从而不利于 30S起始复合物形成 ,降低了翻译起始效率 ;( 2 )λN基因的编码区也是造成它在S1 2突变体内表达下降的原因 ;( 3)核糖体蛋白质L2 4突变体抑制λN基因表达的原因与翻译起始和λN基因 5′端的编码区无关 ,而可能与其 3′端结构基因有关     

志贺氏菌链霉素依赖菌株回复突变的研究——Ⅱ.回复突变株的致病力

志贺氏菌链霉素依赖菌株(Streptomycin-dependcnt Shigella Strains以下简称S~d)能普遍地发生对链霉素不依赖的回复突变现象,并伴随有其它生物学性状的改变。目前S~d不仅作为痢疾减毒口服活菌苗株在现场人群中使用,而且布氏菌、伤寒、霍乱等其它传染病的致病菌也以此作为减毒途径而进行研究。因此,回复突变株(S~(rev))是否会发生毒力改变而返祖为有毒菌株,这在活菌苗使用中是一个共同关心的问题。本文着重研究回     

枯草杆菌ATCC 6633菌株链霉素位点的特点

本实验室以前研究尿嚓咤和／或次黄of吟 作为DNA遗传密码的编码字母，要求一种显 性突变来进行实验，结果发现枯草杆菌ATCC 6633的依赖链霉素突变可以满足实验的要 求^[1]。以后曾多次企图从枯草杆菌可转化菌株 168和Ki-2中分离依赖链霉素突变体（(Str D), 迄未成功。在研究ATCC 6633链霉素位点自 发突变的过程中，观察到一些特点，简述如下：