三例小麦细胞质雄性不育系线粒体DNA的扩增片段长度多态性分析

细胞质雄性不育是小麦杂种优势利用的重要途径,为了鉴定3例小麦雄性不育系的细胞质类型,对其线粒体DNA(mtDNA)进行扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)分析。文中利用差速离心法和不连续蔗糖密度梯度超速离心法提取纯化小麦线粒体。结果表明:通过该提取方法获得的mtDNA,其质量和纯度能够满足PCR反应和遗传学分析。在64对选扩引物中,筛选到了4对特异性引物,其中引物E1/M7在ms(Kots)-90-110不育系扩增出3条特异条带;引物E4/M2在ms(Ven)-90-110不育系扩增出2条特异条带;引物E7/M6在ms(S)-90-110不育系中扩增出2条特异条带;引物E6/M4在ms(Kots)-90-110不育系中扩增出2条特异条带。这些特异引物可以用来作为鉴定具有粘果山羊草Aegilops kotschyi、偏凸山羊草Ae.ventricosa、斯卑尔脱小麦Triticum spelta 3类不育细胞质型小麦雄性不育系的细胞质分子标记,为研究小麦细胞质雄性不育机理奠定了分子基础。     

粘类小麦细胞质雄性不育系的RAPD分析

利用250条10-聚寡核苷酸随机引物对具粘果山羊草(Aegilops kotschyi)、易变山羊草(Ae.variabilis)、偏凸山羊草(Ae.ventricosa)和二角山羊草(Ae．bicornis)细胞质不育系及其保持系5-1的总DNA进行了RAPD多态性分析,其中31条引物对4种不育系及其保持系总DNA均无扩增,217条引物扩增条带完全相同。有2条随机引物在2种不育系之间有特异的扩增片段,其中引物S22在偏凸山羊草细胞质雄性不育系基因组DNA中扩增出分子量约为1600bp的特异带,引物S202在粘果山羊草细胞质雄性不育系基因组DNA中扩增出约1300bp特异带。线粒体基因组DNA的RAPD分析表明,4种不育系及其保持系mtDNA存在明显的差异。证明了S22—1600为偏凸山羊草细胞质不育系及其mtDNA基因组DNA的RAPD特异片段．S202—1300可能为粘果山羊草细胞质不育系及其ctDNA基因组DNA的RAPD特异片段。     

水稻孢子体细胞质雄性不育系线粒体DNA的RAPD分析

利用200个10nt随机引物对水稻孢子体细胞质雄性不育系珍汕97A、保持系珍汕97B、F1代汕优63、恢复系明恢63和另一种孢子体细胞质雄性不育系马协A、保持系马协B、F1代马协63的线粒体DNA进行PCR扩增。在36℃的退火温度下,有132个引物扩增出了清晰的、重复性较好的条带。同一组合内的不育系同保持系、恢复系之间线粒体DNA随机引物扩增产物的多态性明显高于不育系与F1代。不育系与F1代线粒体DNA的扩增产物也存在多态性。一些特异性的差异片段可能与水稻CMS相关。     

不结球白菜新种质P70-203雄性不育细胞质类型的鉴定

本研究根据OguraCMS、PolimaCMS的不育性状相关的线粒体基因序列设计特异引物,对不结球白菜雄性不育系新种质P70-203及其保持系P60-27-1进行PCR分析.研究结果表明,Polima引物P3/P4,P5/P6在不育系与可育系中均无扩增条带;Ogura引物P1/P2在不育系中扩增出750 bp的特异片段,但可育系中无扩增条带.将扩增的特异条带回收并测序,将得到的测序结果在NCBI中进行Blastn同源性比较,结果与青花菜Ogura(登录号:EU604643)和萝卜Ogura(登录号:AB055438)细胞质雄性不育同源性均达到99%.从分子角度初步推测:该雄性不育系新种质P70-203具有Ogura细胞质.     

苎麻细胞质雄性不育系与保持系线粒体DNA的ISSR检测

采用蔗糖衬垫法提取苎麻雄性不育系与相应保持系的线粒体DNA。选用了38ISSR引物进行ISSR—PcR扩增,在编号为ISSR．29、33、34引物中找到了苎麻不育系与相应保持系线粒体DNA之间的差异。     

玉米雄性不育细胞质特异DNA片段的发现及差异展示

利用3对线粒体引物对玉米同核异质和同质异核不育系的基因组总DNA进行PCR扩增;对检测到多态性的引物,再分别对供试材料小孢子发育至四分体、单核期和双核期的花药总RNA进行差异显示分析。结果表明：以基因组总DNA为模板,引物P1-P2在所有供试不育材料都有一相同的特异扩增带,而在保持系中均无扩增;引物P3-P4在所有供试材料中均无扩增;引物P5-P6仅在保持系黄早四中有扩增,而在其他供试材料中无扩增。这一结果说明以P1-P2为引物所检测到的特异扩增带为所有供试不育细胞质所特有,且不受供试材料不同核背景的影响。对于在不育材料基因组总DNA中具有特异扩增的引物P1-P2,进一步以cDNA为模板进行PCR扩增（RT-PCR）,所有不育材料在小孢子发育的3个时期均有一相同的特异扩增带,而保持系在小孢子发育的相应时期均无扩增,说明以P1-P2为引物所检测到的转录本的大小和数目,在同核异质及同质异核不育材料间均表现一致,且不受小孢子发育时期的影响。这说明以P1-P2为引物所检测到的不育材料DNA水平的共同结构特点在小孢子发育中具有转录上的一致性,因此可以认为供试不育细胞质DNA水平的这一特异序列结构与雄性不育性状的表现有关。     

大白菜细胞质雄性不育系和其保持系的RAPD分析

利用RAPD技术对大白菜细胞质雄性不育系CMS341-7和其保持系3411-7的基因组DNA进行了比较分析,共使用了269个随机引物,其中有163个引物在两系之间都得到了扩增产物,79个引物扩增结果在两系之间表现出了遗传多态性。找到了不育系和保持系的特异扩增条带CMSOPL01670和MOPB04600。并对这些特异片段的来源及其在细胞质雄性不育中的作用进行了讨论。     

穿山甲标本和甲片的DNA提取及PCR扩增

为验证经处理后的穿山甲(Manis spp.)标本和甲片是否可以用于种间分子鉴定标记的开发及个体识别工作,本文在样品的预处理、消化、提取后纯化等方面对传统提取方法进行了改进,分别从穿山甲剥制标本、干皮标本及甲片中提取总DNA;然后用Cyt b基因扩增通用引物、12S rRNA基因全序列扩增引物、RAPD引物及微卫星引物进行了PCR扩增,并对部分扩增结果进行了序列测定.结果表明,除剥制标本的脚底皮张组织外,其他样品基本都可以提取出DNA.以此为模板的PCR扩增中,2种线粒体基因引物扩增出明显目的条带,RAPD引物扩增出种间特异条带,测序结果可用于种间特异性引物及SCAR引物的开发;微卫星引物在甲片样品中扩增稳定,可用于个体识别工作.     

小麦胞质突变型雄性不育系85EA与其保持系线粒体DNA的比较研究

８５ＥＡ是通过电子束辐照获得的胞质突变型小麦不育要用ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ技术对８５ＥＡ及春保持系的线粒体ＤＮＡ进行了比较研究。ＲＦＬＰ分析表明８５ＥＡ线粒体基因组中ｃｏｘⅡ基因的位置结构与保持系发生了变化；ＲＡＰＤ分析中引物ＯＰＤ－１５扩增产物在不育系和保持系间有明显差异，不育系的扩增产物比保持系多１条分子量为０．６ｋｂ的特展览 要带，用Ｔ－ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ克隆该不育系特异条带并命名为ＯＰＤ－     

裸长角(虫兆)线粒体COI基因扩增的研究

目的:为研究跳虫的遗传多样性和探讨跳虫线粒体基因提取与扩增的简易方法,对裸长角(虫兆)线粒体细胞色素氧化酶亚基COI基因进行了提取和扩增.方法:通过采集裸长角(虫兆)、提取裸长角虫兆基因组DNA,并用特异性引物对COI基因进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳来检验扩增产物,最后用软件对结果进行分析.结果:结果显示扩增产物的为一明亮条带,长度约为477bp,符合预期.结论:用基因组DNA作为扩增模板是可行的,所选用的引物对跳虫线粒体细胞色素氧化酶基因的扩增具有参考价值.     

Molecular characterization of a new type of cytoplasmic male sterile sugar beet

A line (named Cl) of cytoplasmic sterility of sugar beet whose cytoplasm derived from Betacicla Turkey was obtained by interspecific hybrid. Its cytoplasm and a spontaneous male sterile cytoplasm from wild beet Beta maritima (named M) were compared with that of Owen's sterile line (S-cms) and a common maintainer of them named N was used as control. RFLP and RAPD methods were mainly used in our experiments. The restriction fragment patterns of mtDNAs were found to be likely but for a few of specific low-lighted electrophoresis bands in Cl. The results of Southern hybridization of six heterogeneous mitochondrial genes as probes to digests of mtDNAs by six restriction enzymes showed to be analogous between S and M lines. But the Cl mtDNA was sorted out by hybridization of atpA probe. Difference of low-molecular-weight mitochondrial DNAs was found among the three sterile lines. Three RNA molecules weighing about 4.2kb stably existed in Cl mitochondria. Our results of RAPD also supported that the Cl cytoplas     

BT型细胞质雄性不育水稻及其三系的线粒体DNA研究

用RAPD技术对BT型水稻胞质雄性不育系秀A及其保持系秀B、恢复系湘晴以及杂种F1代的线粒体DNA进行了比较分析。结果表明不育系与其保持系间存在显著差异;不育系与其F1之间mtDNA也存在差异。在引物OPJ－08的扩增产物中,秀A扩增出一条分子量为800bp的多态性片段,在引物OPK－10的扩增产物中,杂种F1扩增出一条分子量为900bp的片段。把这两片段回收、克隆并制备探针,OPJ－08800的Southern杂交结果显示不育系与其F1杂交图谱存在多态性;OPK－10900的Suthern杂交结果显示不育系与其保持系同存在差异。推测这两片段与育性可能有一定的联系。     

大白菜细胞质雄性不育保持系3411-7——RAPD特异扩增片段的克隆测序

利用RAPD技术从大白菜细胞质雄性不育保持系3411-7的DNA中得到一个特异扩增片段MOPB04600。回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行序列测定。结果表明该片段全长600bp,其碱基组成为A+T=72.33%。通过与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中的455,972个序列进行同源性比较,同源性均小于30%,表明该片段为一新发现的序列。并对该特异片段的来源及其可能的作用进行探讨。     

RAPD Comparison Study on Mitochondrial DNA of the D2 Cytoplasmic Male Sterile (CMS) Line with K-, V-and T-type CMS Lines in Wheat

A new line of cytoplasmic male sterile (CMS) wheat ( Triticum aestivum L. ) named msD2-CA8057 (briefly as D:) was compared with K-, V- and T-type CMS lines by mitochondrial DNA (mtDNA) RAPD analysis. It was revealed that the mtDNA of this D2 line was different from that of the other three types although differences were also found between the K-, V- and T-type lines themselves. This result provided some evidences at the molecular level for the identification of the cytoplasm of this D2 line as a new type of CMS line. In the experiment the authors also found polymorphism between two CMS lines, which had the same source of T-type cytoplasm but had different nuclear background. This was the first time to provide direct evidence about the mtDNA mutation in T-type CMS wheat lines during the routine backcross process. Such changes are most likely resulted from the influence of different nuclear background.     

小麦D^2型与K型,V型,T型细胞质雄性不育系线粒体DNA的RAPD比较分析

采用ＲＡＰＤ方法比较新育成的小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）Ｄ２型不育系ｍｓＤ２ＣＡ８０５７与Ｋ型、Ｖ型和Ｔ型细胞质雄性不育系的线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）。结果表明,ｍｓＤ２ＣＡ８０５７的ｍｔＤＮＡ不同于其它３种类型不育系,而其它类型不育系的ｍｔＤＮＡ彼此也各不相同。这一结果从分子水平上为鉴定该Ｄ２不育系的不育类型提供了证据。实验还发现在胞质来源相同而核背景不同的Ｔ型不育系间存在线粒体基因组多态性,这是关于小麦中Ｔ型不育系ｍｔＤＮＡ在常规回交转育过程中发生变异的直接证据。这种变异在很大程度上可能是受不同核背景影响的结果。     

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。     

细胞质雄性不育花椰菜保持系特异分子标记的鉴定及序列分析

以花椰菜细胞质雄性不育系NK-6和相应保持系NK-6B为材料进行RAPD分析,筛选了406条RAPD引物,共获得了2160条清晰可辨的条带,平均每个引物产生5-10条。其中引物S2121在两系的扩增中表现出多态性,在保持系中特异扩增出一条934bp的片段。克隆、测序,根据测序结果设计特异性引物,将RAPD标记转化成特异PCR标记,命名为S2121900。经Southern点杂交分析及对单株和多份候选材料的检测证实该标记为花椰菜保持系所特有,可用于候选保持系的早期筛查。序列分析表明该片段与油菜、拟南芥线粒体上的序列有较高相似性,因此推测该片段亦可能来源于线粒体基因组。本研究为从另一角度解释花椰菜细胞质雄性不育的分子机制提供了新线索。     

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S4181515。序列分析表明S4181515为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40％,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S4181515转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。