标记蛋白HPT的表达、纯化及免疫活性鉴定

构建含有HPT的原核表达质粒,经诱导表达纯化后获得HPT抗体。从含有hpt的质粒pCambia1301上扩增目的基因,经SalⅠ和NotⅠ双酶切后与原核表达载体pET-28b（+）进行粘性末端连接,成功构建了pET-28b-hpt质粒,并转化到宿主细菌大肠杆菌Rosset(DE3)中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET-28b-hpt原核表达载体在E.coli Rosset菌株中以包涵体的形式高效表达了HPT蛋白,并以纯化的目的蛋白为抗原免疫兔制备了多克隆抗体。利用本方法可以获得特异性强、灵敏度高的多克隆抗体。     

四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定

将来源于水母的绿色荧光蛋白基因 (gfp)和来源于E .coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因 (tetR)共同构建到E .coli表达载体pET_30a +上 ,获得TetRC_端与GFPN_端融合蛋白。对经诱导表达并纯化后的融合蛋白 (TR∷GFP)进行荧光发射光谱分析表明 ,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性 ,即在 395nm激发下 ,可在 5 10nm附近有特征发射峰。在加入四环素后 ,融合蛋白在 395nm激发下 ,在400nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化 ,荧光强度普遍增加 ,且以 510nm处最大发射峰增幅最大 ,由原来 1132增至 2214 ,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大 ,结果表明该融合蛋白 ,能感受外界四环素 ,并产生一定的荧光变化。     

外源一氧化氮对铅胁迫下小麦种子萌发及幼苗生理特性的影响

利用室内水培实验,研究了外源一氧化氮（NO）供体硝普钠（SNP）对Pb²⁺处理下小麦（Triticum aestivum L.）种子萌发、幼苗生长及相关生理指标变化的影响。结果表明,Pb²⁺处理使小麦种子发芽势、发芽率、幼苗根长和茎长均显著降低,诱导叶绿素a、叶绿素b含量减少及叶绿素荧光参数F_v/F_m和F_v/F_o的比值减小,25 μmol·L^-1 SNP明显缓解Pb²⁺胁迫对种子萌发及幼苗生长的抑制作用,提高Pb²⁺胁迫下叶绿素a、叶绿素b含量及F_v/F_m和F_v/F_o的比值,而100 μmol·L^-1SNP无明显缓解作用。此外,25和100 μmol·L^-1SNP诱导Pb²⁺胁迫下小麦幼苗叶片过氧化氢酶（CAT）活性增强和可溶性蛋白含量增多,但100 μmol·L^-1SNP处理降低了过氧化物酶（POD）活性。结果说明,外源NO促进Pb²⁺胁迫下小麦种子萌发及幼苗生长,提高叶绿素和可溶性蛋白含量,诱导CAT活性升高,从而增强小麦对Pb²⁺胁迫的适应性。     

保加利亚乳杆菌ATCC11842 L-乳酸脱氢酶同工酶基因的克隆与表达分析

通过对保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）L-乳酸脱氢酶（L-lactate dehydrogenase,L-LDH）同工酶基因的异源表达、酶活测定和摇瓶发酵研究L-LDH在乳酸合成中的作用。将保加利亚乳杆菌ATCC11842中L-乳酸脱氢酶基因ldb0120和ldb0094分别克隆至载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28aldb0120和pET28aldb0094,并转化到大肠埃希菌（Escherichia coli） BL21(DE3)中进行表达。进一步对重组蛋白进行Ni-NTA柱亲和层析和酶学活性测定,结果显示,LDB0120和LDB0094的比活力分别为0 和25 U/mg,表明LDB0094是具有低活性的L-乳酸脱氢酶,而LDB0120不具有活性。对两株重组菌分别进行好氧和微好氧发酵,重组菌E.coli BL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧条件可以合成L-乳酸,浓度分别为41.9和227.9 mg/L,而菌株E.coli BL21/pET28aldb0120在两种培养条件下均基本不合成L-乳酸,推测保加利亚乳杆菌中L-乳酸脱氢酶LDB0094为催化L-乳酸合成的关键酶。首次对保加利亚乳杆菌的L-乳酸脱氢酶同工酶基因进行研究,通过基因异源表达、蛋白纯化、酶活测定和摇瓶发酵,揭示Ldb0094酶为保加利亚乳杆菌ATCC11842中催化L-乳酸合成的关键酶。     

过量表达水稻细胞质型OsAPXs基因提高转基因烟草的耐盐性

为了验证水稻(Oryza sativa L.)细胞质型APXs与细胞耐盐性的关系,实验分别将OsAPXa和OsAPXb（基因登录号：D45423、AB053297）转化到烟草(Nictiana tabacum,N.plum)植株中。Southern结果表明,二基因分别整合到烟草的基因组;Northern分析表明,外源基因在转基因烟草中得到高效表达;在碳酸盐逆境下,T2代转基因植株与野生型对照相比,其APX活性呈现显著的提高,T₂代品系的H₂O₂含量和叶片受害程度显著低于野生型;T₂代品系分别在含有10 mmol·L^-1 NaHCO₃、5 mmol·L^-1 Na₂CO₃的MS培养基上生长,根的生长受到抑制,叶片产生黄化;野生型烟草则难以存活。水稻细胞质型OsAPXs基因的过量表达提高了转基因烟草的耐盐性,揭示出OsAPXa和OsAPXb在碳酸盐逆境应答过程中发挥着重要的作用。     

盐胁迫对沙冬青幼苗生长与生理特性的影响

水培条件下,对沙冬青幼苗以不同浓度的NaCl溶液进行处理,并测定其相关生理指标。结果显示：随着盐浓度的增加,叶绿素含量与叶绿素荧光参数（F_v/F_o和F_v/F_m）逐渐降低,丙二醛含量升高。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性随着盐浓度的升高表现出先上升后下降的趋势,0.7%盐胁迫下的幼苗POD酶活性最高,1.0%和1.3%盐胁迫下的酶活性逐渐降低,而过氧化氢酶（CAT）的活性呈持续上升趋势。各处理渗透调节物质脯氨酸的含量较对照明显增加,可溶性糖含量在根中升幅较大,叶片增幅不明显。幼苗死亡率也随着胁迫程度的加剧而升高,当浓度达到1.0%和1.3%时幼苗死亡率较高,分别达到了53.33%和76.67%。研究表明,低浓度盐胁迫下（0.7%以下）,沙冬青幼苗表现出较强的抗性;当盐浓度升高到1.0%和1.3%时,其生长受到严重影响。     

水稻rab5B基因在大肠杆菌中的表达、纯化和GTP结合分析

Rab5B类蛋白因为其编码产物的N端具有特殊结构而被认为是一类特殊的蛋白质.水稻rab5B基因Osrab5B是这类蛋白质基因在单子叶植物中的首例发现.将Osrab5B基因的编码序列按正确读码框重组到具有谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase, GST）融合标签的pGEX-4T1表达载体中,转化大肠杆菌,获得了稳定表达目标融合蛋白的菌株,经GSTrap^TM柱纯化,获得了纯化的目标融合蛋白.GTP结合试验表明,在原核细胞中表达出的GST-OsRab5B融合蛋白具有体外结合GTP的能力.     

大鼠Shh-N融合蛋白的表达、纯化及功能研究

为了获得重组Sonic hedgehog N端蛋白（Shh-N）并研究其功能,应用PCR技术扩增Shh-N cDNA,然后克隆至原核表达质粒中,转化E.coli后获得表达菌株, 经1 mmol/L IPTG诱导高效表达出带有His-tag的融合蛋白,其中大部分为可溶性蛋白,少量为包涵体.用His-tag特异性结合树脂纯化可溶性融合蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一区带,凝胶自动扫描分析表明,Shh-N的纯度达85%以上.纯化后的Shh-N在成纤维生长因子8(FGF₈)的协同作用下,能诱导神经前体细胞（NPC）向酪氨酸羟化酶阳性神经元（TH⁺）发育.在此基础上可以诱导不同类型的人类干细胞定向分化为多巴胺(DA)神经元,从而为临床治疗帕金森病（PD）提供充足的供体细胞.     

口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pGEX KG中 ,使P1基因与GST融合 ,获得融合表达质粒pKG P1,转化E .coliBL₂₁ (DE3) ,经IPTG诱导 ,SDS PADE结果表明GST P1融合蛋白获得高效表达 ,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫学活性 ,表达产物主要存在于细菌裂解液上清中。进一步采用GST纯化试剂盒纯化P1蛋白并作为诊断抗原 ,建立了P1 ELISA诊断方法 ,与FMD间接血凝 (IHA)检测方法平行检测 86 4份血清样品 ,总的符合率达87%。     

发菜NdhK的抗体制备与蛋白表达

发菜是一种陆生蓝藻,分布于一些干旱和半干旱区域。其NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO₂吸收、围绕光系统Ⅰ的循环电子传递和细胞呼吸。为研究该物种中ndhK基因的功能,本研究利用特异性引物,通过PCR方法从发菜中扩增ndhK基因并克隆到原核表达载体pET-32a上,得到表达载体pET-32a-ndhK,将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,得到分子量大小为43 kDa的融合蛋白NdhK。随后,采用亲和层析,对融合蛋白进行纯化回收,并以此回收蛋白作为抗原进行免疫,制备NdhK的多克隆抗体。最后,利用Western blot蛋白免疫印迹对所得抗体的特异性进行验证。从而为进一步探索发菜ndhK基因的功能以及发菜中NDH-1复合体各亚基的作用进行前期准备。     

一氧化氮(NO)熏蒸蒜瓣对蒜苗叶片光合作用的影响

以白皮改良蒜为试验材料,用不同浓度的一氧化氮气体（0.1、0.5、1.0 μmol·L^-1）在无氧环境中对大蒜进行熏蒸。并使用TPS 1便携式光合仪结合Farquhar和Sharkey的理论测定或计算NO处理蒜苗的相关光合指标,同时测定核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)含量。发现与1.0 μmol·L^-1 NO气体处理相比,0.5 μmol·L^-1 NO处理的蒜苗叶片净光合速率（P_n）、气孔导度(G_s)提高、而胞间隙CO₂浓度（C_i）、气孔限制值(L_s)降低,说明0.5 μmol·L^-1 NO处理下蒜苗光合速率高于1.0 μmol·L^-1 NO的处理的主要是非气孔因素。而且0.5 μmol·L^-1 NO处理提高了蒜苗叶片表观量子效率(AQY)、表观羧化效率(CE)和光合能力(A_o)及Rubisco含量,说明外源NO处理提高了蒜苗叶片光合作用过程中光反应能力和碳同化过程中羧化酶羧化效率。与对照相比,1.0 μmol·L^-1 NO处理降低了蒜苗叶片净光合速率,同时气孔导度、胞间隙CO₂浓度、表观量子效率、Rubisco含量、羧化效率和光合能力均降低,而气孔限制值升高,说明1.0 μmol·L^-1 NO对蒜苗光合作用的抑制既有气孔因素,也有非气孔因素。而0.1 μmol·L^-1 NO处理各项指标与对照无显著性的差异。     

薇甘菊乙醇酸氧化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

利用SSH和RACE相结合的方法获得了薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长,并对该序列进行了生物信息学分析。随后将该基因的cDNA编码区克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒,转化到大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行表达。序列分析表明,薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长1 363 bp,编码369个氨基酸,命名为MmGO（GenBank登录号EU716626）,推测的MmGO分子量为40.32 kDa,等电点为8.99。系统进化分析表明,MmGO与芸苔的GO序列亲缘关系比较近。将该基因重组到pET-32a(+)中进行原核表达,经0.1 mmol·L^-1 IPTG,25℃诱导4 h,获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His MmGO,Western-blot证实表达的6×His-MmGO能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为60 kDa,与预测的融合蛋白6×His-MmGO分子量相符。为进一步研究融合蛋白6×His-MmGO的活性和功能奠定了基础。     

发菜中超氧化物歧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用基因工程技术从发菜总DNA中克隆了一段的基因序列,该序列与基因库中已公布的编码地木耳（Nostoc commnue）超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为97%。将该基因插入含T7启动子质粒pET-32中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用1 mmol·L^-1 IPTG诱导表达数小时后,产生较多的重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在。SDS-PAGE分析表明,在相对分子量约为22 kd的位置有一条明显蛋白质带。将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2 550 U。对纯化后的蛋白进行高温胁迫研究,将该纯化蛋白在60℃高温下胁迫90 min后,其活性为原（未经胁迫）蛋白活性的85%。     

马蔺对不同浓度NaHCO3胁迫的生理响应

为探讨不同浓度NaHCO₃胁迫下,马蔺叶片的膜透性、可溶性蛋白及膜脂过氧化物含量的变化规律,以1年生马蔺实生苗为研究对象,通过对细胞膜透性、膜质过氧化产物MDA、SOD、POD和可溶性蛋白等指标进行测定,研究在盆栽控盐条件下,马蔺对NaHCO₃胁迫的适应与响应。结果表明：随着NaHCO₃浓度和胁迫时间的增加,对马蔺叶片可溶性蛋白含量的影响总体是先下降后上升的趋势,在30 d时,0.4%和0.6%盐浓度胁迫下的马蔺的可溶性蛋白含量上升较大,分别比对照高：21.7%,38.6%;在NaHCO₃盐胁迫的10~20 d,马蔺叶片的的膜透性略有降低;在20~30 d时,膜透性迅速上升;NaHCO₃胁迫20 d时,除对照外其他盐浓度胁迫下的马蔺叶片的POD活性都达到了最大值,分别比对照高95%,103%,496%;相同盐浓度胁迫下,随着时间的延长,SOD活性变化趋势是先下降后上升;MDA作为膜脂过氧化作用的主要产物之一,随着盐浓度的增加和盐胁迫时间的延长,在30d时0.6%浓度的马蔺叶片中MDA含量大量积累。综上所述,马蔺有抗盐（NaHCO₃）胁迫的能力,是重要的盐碱地生植物,本研究为马蔺的抗盐碱性研究又提供了一有力证据,同时为今后将马蔺应用于治理盐碱土地增加了理论基础。     

Cr6+对菹草叶绿素荧光参数、抗氧化系统和超微结构的胁迫影响

研究了不同浓度的Cr⁶⁺(0、1、10、30、50 mg·L^-1)对菹草叶片叶绿素、叶绿素荧光参数、抗氧化系统、可溶性蛋白含量、膜脂过氧化产物、可溶性糖含量、超氧阴离子(O₂^—·)产生以及细胞超微结构的胁迫影响。结果表明,随着Cr⁶⁺浓度的增加,总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a/b均呈下降趋势,F_o先升后降,F_v/F_m、F_m及F_v/F_o均逐渐降低;可溶性蛋白和谷胱甘肽(GSH)含量先升后降,抗坏血酸(AsA)含量逐渐下降;超氧化物歧化酶(SOD)活性逐渐下降,而过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性均呈先升后降趋势; O₂^—·产生速率、丙二醛(MDA)和可溶性糖含量均表现先降后升趋势;电镜观察发现：随着Cr⁶⁺浓度的增加,对细胞超微结构的损伤也加剧,表现为叶绿体膨胀,被膜破裂,类囊体片层解体;线粒体嵴数目减少,呈空泡状。可见,Cr⁶⁺破坏了菹草正常生理活动的结构基础,造成菹草生理功能紊乱。     

感染BBTV香蕉叶片cDNA文库的构建及评价

为了研究香蕉束顶病毒与香蕉寄主致病的互作分子机制,本文报道利用Make Your Own“Mate＆Plate^TM”Library System试剂盒成功构建感染BBTV香蕉叶片的cDNA文库。通过改良CTAB法提取感染BBTV香蕉叶片的总RNA,采用SMART法反转录合成双链cDNA,经SfiI酶切并去除短片段之后,与经同样酶切的pGADT7-SfiI载体连接,利用电转法将重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中,获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒。结果得到库容量大于2.0×10⁶的初级文库,检测表明文库cDNA插入片段长度主要分布在700~2 000 bp,文库重组率为87.5％。结果表明,该文库质量较好,可用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验,本研究为开展病毒与寄主互作的研究奠定基础。     

珍稀濒危植物香果树种质离体保存技术的研究

以香果树(Emmenopterys henryiOliv.)带芽茎段为外植体,以MS为基本培养基,采用正交实验和单因子实验方法研究了培养温度、无机盐水平、蔗糖、甘露醇和植物生长抑制剂PP333对香果树试管苗离体保存的影响。结果表明,香果树带芽茎段在9℃低温下保存于附加2.0 mg.L-1KT、2.0 mg.L-16-BA、0.1 mg.L-1NAA、50 g.L-1蔗糖和10 g.L-1甘露醇的1/2MS培养基上,180 d后其成活率可达80%。PP333对香果树的离体保存也有显著影响,其中最适合的PP333浓度为6 mg.L-1,180 d后其成活率可达95%以上。离体保存后的试管苗经形态指标和生理生化指标测定以及RAPD分析检测没有发生遗传变异。本实验结果为珍稀濒危植物香果树的种质保存提供了一条简单有效的途径。     

NaCl处理下两种补血草种子萌发和幼苗抗性的比较

用不同浓度的NaCl处理盐生植物黄花补血草和大叶补血草,研究其种子萌发和幼苗叶片中叶绿素和可溶性蛋白等各项生理指标的变化,分析比较这两种植物的耐盐性。结果表明,NaCl处理抑制两种补血草种子的萌发,此效应具有浓度依赖性,低浓度的NaCl促进黄花补血草根和大叶补血草茎叶的生长,高浓度的NaCl抑制两种补血草幼苗的生长;与对照比,50、150和300 mmol·L^-1 NaCl处理后,两种补血草幼苗叶片的叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和叶绿素总量均减少,而H₂O₂和MDA含量却增加;低浓度的NaCl处理使两种补血草幼苗叶片可溶性蛋白含量增加,而高浓度的NaCl处理使其可溶性蛋白的含量降低。此外,相同浓度的NaCl处理对大叶补血草种子萌发、叶绿素含量等指标的抑制作用明显强于黄花补血草,且其MDA产生明显强于黄花补血草,这些表明黄花补血草可能比大叶补血草具有较强的耐盐性。