大鼠Shh-N融合蛋白的表达、纯化及功能研究

为了获得重组Sonic hedgehog N端蛋白（Shh-N）并研究其功能,应用PCR技术扩增Shh-N cDNA,然后克隆至原核表达质粒中,转化E.coli后获得表达菌株, 经1 mmol/L IPTG诱导高效表达出带有His-tag的融合蛋白,其中大部分为可溶性蛋白,少量为包涵体.用His-tag特异性结合树脂纯化可溶性融合蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一区带,凝胶自动扫描分析表明,Shh-N的纯度达85%以上.纯化后的Shh-N在成纤维生长因子8(FGF₈)的协同作用下,能诱导神经前体细胞（NPC）向酪氨酸羟化酶阳性神经元（TH⁺）发育.在此基础上可以诱导不同类型的人类干细胞定向分化为多巴胺(DA)神经元,从而为临床治疗帕金森病（PD）提供充足的供体细胞.     

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .     

爪蟾胚胎脊髓胆碱能神经元上两类非去极化激...

Single calcium channel current was studied on the identified spinal cholinergic neurons from embryonic Xenopus laevis with patch clamp method. The results indicate that some calcium channels show opening activity at resting membrane potential. According to the characteristics of conductance and kinetics of such channels, they could be divided into two types: a stretch sensitive Type-NS with a slope conductance of 7.5 pS (mean open time 0.58 ms at resting membrane potential) and a Type-NL with a slope conductance of 16.7 pS (and two opening times of 2 ms and 19.3 ms). Both types of channel are predominantly active at resting potential and negative membrane phases. It is suggested that they may be involved in the calcium-dependent neuronal events at resting state.     

爪蟾胚胎脊髓胆碱能神经元上两类非去极化激活的钙通道

用膜片箝方法,在标定的爪蟾胚胎脊髓胆碱能神经细胞膜上记录钙离子单通道电流。结果显示,在静息膜电位时钙通道即有开放活动。根据通道的电导及动力学等特性,我们将其分为两种类型:NS 型钙通道,斜率电导7.5pS,静息膜电位时平均开放时间0.58ms,其活动受牵张膜片的影响;NL 型钙通道,斜率电导16.7pS,静息膜电位时二级平均开放时间分别是2ms 和19.3ms。鉴于它们在膜静息以及负电位相的显著活动,我们推测这两类钙通道可能参与神经元静息膜电位时钙依赖的细胞活动过程。     

钙离子对乙酰胆碱受体通道脱敏的影响

Ｎ型乙酰胆碱受体通道的脱敏表现为通道开放概率的衰减,而通道开放时间和开放电流的变化水大,提示脱敏是全或无的,当「Ｃａ＾２＋」０＝１２．０ｍｍｏｌ／Ｌ时,脱敏５０％约用时１１．５分钟;「Ｃａ＾２＋」０＝０ｍｍｏｌ／Ｌ时,脱敏５０％药用时１．８分钟。证明在钙离子浓度较低的情况下,Ｎ型乙酰胆碱受体通道的脱敏较快,而下离子浓度较高时,通道脱敏慢,提示钙离子对通道从脱敏态到静息态的恢复有促进作用,并且对钙离     

神经递质释放机制的实验研究-即发态突触小泡假说

突触小泡（ＳｙｎａｐｔｉｃＶｅｓｉｃｌｅ）在神经递质释放过程中起关键性作用。采用膜片钳技术对突触前后细胞同步钳位研究了爪蟾胚胎神经元突触递质释放的过程,提出了如下小泡释放的假说：锚定在突触前膜的小泡中包含两类小泡：锚定态小泡和即发态小泡（即发态小泡定义为钙离子依赖性即时释放的小泡）。后者在动作电位到达时立即释放,而处于锚定态的小泡只有转换为钙离子依赖性释放的即发态时才能进入递质释放程序     

培养的新生大鼠交感神经元膜电学性质及电压门控通道的膜片箝研究

在培养的新生大鼠颈上神经节交感神经元标本上,用全细胞电流箝及电压箝技术观察记录了交感神经元膜电学参数及电压门控性通道电流。用全细胞电流箝测得下列平均值：静息电位,－５１±６ｍＶ;输入阻抗,１４３２±３８９ＭΩ;时间常数,１３０±３２ｍｓ;动作电位幅度,９６±１０ｍＶ,超射值,４２±６ｍＶ。培养早期即可记录到自发或诱发的动作电位,大多数动作电位后跟随快或慢的后超极化电位。在电压箝状态下可分别记录到电压门控钠、钾、钙通道电流。钾电流以延迟整流型为主,钙电流只有高电压激活,缓慢失活的Ｌ或Ｎ型,未能记录到低电压激活,快速失活的Ｔ型钙电流。     

豚鼠耳蜗离体外毛细胞的膜电位和离子电流

利用膜片钳技术对分离的豚鼠耳蜗外毛细胞进行了研究,结果表明：（１）新分离的正常ＯＨＣ呈术状,胞膜光滑,胞核位于底部,静纤毛由顶端表皮板伸出,４小时内形态无明显变化。（２）全细胞电压钳记录结合通道阻断剂实验表明,ＯＨＣ膜电流主要由电压依赖性钾离子流组成。（３）利用全细胞记录方式得到的ＯＨＣ静息电位值为－２６±９ｍＶ．     

豚鼠耳蜗离体外毛细胞的膜电位和离子电流

利用膜片钳技术对分离的豚鼠耳蜗外毛细胞(OHC)进行了研究,结果表明:(1)新分离的正常OHC呈柱状,胞膜先滑,胞核位于底部,静纤毛由顶端表皮板伸出,4小时内形态无明显变化.(2)全细胞电压钳记录结合通道阻断剂实验表明,OHC膜电流主要由电压依赖性钾离子流组成.(3)利用全细胞记录方式得到的OHC静息电位值为-26±9mV((?)±SD,n=10).     

神经元猝死时神经介质的爆发性释放

本文应用了斑片钳技术研究了瓜蟾胚胎神经元释放神经介质的特性,尤其是支配肌细胞的神经元猝死时爆发性地释放出大量乙酰胆碱(ACCho)的特性.并进而研究了与此有关的肌细胞膜上乙酰胆碱受体通道的性质.本文还讨论了神经元猝死时神经介质的爆发性释放与癫痫等神经疾病相关的可能性.