钩端螺旋体LA_1100蛋白膜定位研究

目的 研究LA_1100蛋白在钩端螺旋体中的膜定位并分析其在中国流行血清群中的保守性.方法 利用生物信息学软件对LA_1100的二级及三级结构进行分析,以Triton X-114抽提分离钩体细胞的各个组分,Westernblot及FACS方法验证LA_1100在钩端螺旋体中的膜定位.Western Blot和PCR在蛋白水平及核酸水平检测了其在13个中国流行血清群代表株中的保守性.结果 LA_1100的二级结构显示具有α-螺旋及β-折叠结构,进一步分析表明,此蛋白具有跨膜区.LA_1100单体结构具有典型的TolC结构域,三级结构模拟显示三聚体可形成孔状结构.膜定位显示,该蛋白定位于外膜.该基因的保守性分析结果表明,在中国13个流行代表株中有12株均检出该基因或该蛋白的特征性条带.结论 LA_1100为具有TolC结构域可以形成孔状结构的钩端螺旋体外膜蛋白,在中国流行株钩端螺旋体中保守.由于TolC蛋白与病原菌分泌致病因子密切相关,推测此蛋白可能与钩体感染宿主时粘附及致病相关,进一步对此蛋白进行研究有利于揭示钩体的致病机制.     

钩端螺旋体的研究进展

广义上钩端螺旋体是指螺旋体目钩端螺旋体科钩端螺旋体属的微生物,随着研究的深入,现该属微生物被划分为钩端螺旋体属（Leptospira）和细丝体属（Leptonema）17个种。由于钩端螺旋体具有独特的形态结构、进化上特殊的地位和医学上的重要意义,一直是研究者和医务工作者关注的对象。钩端螺旋体可引起钩端螺旋体病,该病是一个潜在的、严重的世界性公共卫生问题。其典型症状是黄疸、肾衰竭、出血及心肌炎与心律不齐,     

钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析

在以抑制消减杂交比较强毒株赖型钩端螺旋体017株和无毒株双曲钩体Patoc　I株　的基因组差异时,获得了一系列仅存在于强毒株而无毒株缺如的差异片段.选取差异片段AF325810设计特异性引物,以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,进行巢式PCR扩增,PCR纯化产物T载体克隆,选取阳性克隆测序,进一步进行生物信息学分析,以获得强毒株赖型钩端螺旋体017株特有的毒力相关基因,DOT BLOT显示其在钩端螺旋体各株间有不同分布PCR扩增得到了产物为2kb大小的DNA片段,序列分析结果显示得到了问号钩端螺旋体赖型017株的鞭毛钩相关蛋白K基因的上游序列,为进一步探索钩端螺旋体的致病机制奠定了基础.     

钩端螺旋体的几种检测方法

钩端螺旋体的几种检测方法万成松张文炳曹虹（第一军医大学微生物学教研室,广州５１０５１５）钩端螺旋体（简称钩体,Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）是一类细长、弯曲、两端呈钩状的螺旋体,钩体种类很多,分类学上归细菌范畴,可分致病性和非致病性两大类。钩体病是由致病性钩...     

问号钩端螺旋体基因组DNA芯片的研制

目的 研制并初步评估问号钩端螺旋体(简称钩体)赖型赖株的基因组DNA芯片。方法 利用Primegens引物设计软件筛选出问号钩体赖型赖株全基因组中的特异性基因进行引物设计。对成功设计出相应引物的3 290个基因用聚合酶链反应方法进行扩增,以纯化后的产物点样制备芯片。并用双色荧光杂交策略对芯片质量进行了初步平估。结果 共获得3 290个基因产物用于点样。参考株自身杂交实验结果表明:该芯片有较高的点一致性、信噪比和较低的假阳性率。结论 成功制备了包含问号钩体赖型赖株3 290个目的基因的基因组DNA芯片,并可用于基于该芯片的问号钩体比较基因组学的研究。     

重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附(ELISA)检测方法的建立

目的建立以重组外膜蛋白为基础的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。方法以基因重组技术获取重组钩端螺旋体外膜蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,特异的钩体抗血清进行ELISA方阵滴定、交叉性试验、阻断试验,并对北京地区的70份犬血清使用建立的ELISA方法以及德国Virion公司的全菌体钩端螺旋体ELISA试剂盒进行相互验证。结果方阵滴定试验确立以100ng/孔为抗原包被浓度,1∶160为血清稀释度。交叉性试验具有广泛性、阻断试验标明该方法特异性强、灵敏度高。两种方法数据经χ2检验,两者检出率之间差异不显著。结论重组LipL32蛋白具有结合活性。初步建立了以重组LipL32蛋白为抗原的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。     

七日热群钩端螺旋体的两个新血清型

本文报告七日热群钩端螺旋体的两个新血清型。A10株钩端螺旋体系I 962年自勐腊县钩端螺旋体病患者分离,命名为云南型钩端螺旋体(Leptospira interrogans serovar yunnan)H27株钩端螺旋体系1964年自河口县钩端螺旋体病患者分离,命名为河口型钩端螺旋体(Le-ptospira interrogans serovar hekou)。     

钩端螺旋体在复方明胶培养基中长期传代培养的抗原性分析

本文报道了钩端螺旋体(简称钩体)在复方明胶培养基中经过三年的传代培养,用显微镜凝集试验、对流免疫电泳及SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳(PAGE)分析,同Korthof培养基的钩体抗原比较。结果证明:(1)钩体抗原的组成是非常复杂的,SDS-PAGE可显示20多条抗原带;(2)两种培养基所培养的钩体,未发现抗原性变异。说明钩体在复方明肢培养基中长期传代培养过程中,其抗原组成是相对稳定的。这对进一步探讨钩体长期在综合培养基中培养以后的抗原稳定性,具有一定的理论及实际意义。     

表达钩端螺旋体嵌合蛋白的重组BCG菌株可保护仓鼠免受钩端螺旋体病的侵袭

<正>钩端螺旋体病是一种人畜共患病,钩端螺旋体每年可导致100万人患病。融合多种免疫原性抗原是一种很有希望的提供有效的抗钩端螺旋体病疫苗的方法。牛分枝杆菌(BCG)具有良好的佐剂特性和安全性,是一种潜在的疫苗载体。以LigANI、LigBrep、LipL32和LemA基因序列为基础的两个嵌合基因被分别克隆到5个具有不同启动子(pAN、hsp60、18kDa、ag85b和ag85b+信号序列)的BioBrick载体中,用于在BCG中表达抗原。     

20例脑动脉炎钩端螺旋体L型的调查报告

本文报道２０例钩端螺旋体（简称钩体）Ｌ型脑动脉炎,其中右侧偏瘫８例、左侧偏瘫５例、双侧瘫２例,共济失调２例。血培养原形钩体阳性２例、钩体Ｌ型阳性１４例;ＣＳＦ培养原形钩体阳性１例、Ｌ型阳性７例。脑ＣＴ证实脑出血２例、脑梗塞８例。研究表明本病的发生可能与钩体Ｌ型直接损伤脑血管密功相关。甲硝哒唑易透过血脑屏障,能损伤钩体ＤＮＡ结构,疗效显著,可减少钩体病后发症。     

钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功能分析

以钩端螺旋体基因组DNA为模板,通过酶联聚合反应（PCR）得到钩端螺旋体中prmA的同源基因liprmA的全基因编码序列,并克隆到原核表达载体pET22b中。通过优化大肠杆菌培养和诱导条件,含目的蛋白的融合蛋白可溶表达量达到40 mg/L,约占菌体总蛋白的40%。经Ni-NTA His Bind亲和柱纯化,得到纯度大于95%的目的蛋白。氨基酸序列同源性分析显示liPrmA与原核生物和真核生物的核糖体蛋白L11甲基化转移酶的功能域一级结构高度一致;活性分析显示,纯化的liPrmA有钩端螺旋体核糖体蛋白L11甲基化转移酶的活性。     

采用小白鼠分纯钩端螺旋体菌株

近年来,随着钩端螺旋体病的调查研究工作的广泛开展,在实验诊断方面,除进行大量血清学试验外,对钩端螺旋体菌株(以下简称钩体菌株)进行培养,作好菌群鉴定,对生物制品和制订防治措施提供参考。但往往由于在采集标本及实验操作过程中无菌操作不严格,而使分离出的钩体菌株发生污染。用常规方法     

中国钩端螺旋体参考菌株的建立与应用

本文简要介绍了中国钩端螺旋体（钩体）参考菌株的建立与应用。该参考菌株从无到有,目前已有１８个血清群７５个血清型,其中曼耗新菌群和赖等２６个新菌型已被国际确认为国际新菌群与国际新菌型。该参考菌株已在中国钩体病研究、预防、临床实验诊断、流行病学调查、医学教育和动物检疫等方面得到广泛的应用,取得了丰硕的成果     

主要致病性螺旋体疫苗研究进展

由主要致病性螺旋体引起的人类疾病,如钩端螺旋体病(Leptospirosis)(以下简称钩体病)、莱姆病(Lyme disease)和梅毒(Syphilis)等发病率居高不下,对公共卫生造成了威胁和隐患。这些病原性螺旋体的致病机制许多尚未完全阐明,甚至有些不十分清楚。目前螺旋体疫苗免疫保护效果仍不十分理想。为了预防和减轻螺旋体病的发生,亟需对主要致病性螺旋体疫苗的相关研究进行加强和给予足够的重视。致病性螺旋体相关疫苗大多经历了全菌体疫苗、减毒活疫苗和基因工程疫苗等阶段。现就钩体病、莱姆病和梅毒的疫苗类型及免疫保护效果的研究现状作一概述。     

014 脂多糖抗原诊断钩端螺旋体病相关性葡萄膜炎

钩端螺旋体(简称钩体)病是一种广泛流行的动物源性疾病,尽管目前已有多种商业试剂盒用于诊断系统性钩体病,但试剂盒中起作用的具体抗原的性质仍不清楚。钩体病相关性葡萄膜炎是系统性钩体病的一种晚期并发症,该研究目的在于验证并评估钩体脂多糖(LPS)抗原作为钩体病相关性葡萄膜炎的临床辅助诊断的意义。     

问号钩端螺旋体中一个新的OmpA家族蛋白抗原性及保守性研究

目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans)黄疸出血群赖型赖株中一个新的外膜蛋白(Omp)A家族基因LA0301,研究LA0301编码蛋白的抗原性和在15个钩端螺旋体(简称钩体)血清群代表株中的保守性,探讨其在疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测LA0301的特征。构建原核表达重组体pQE31-LA0301,经IPTG诱导后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹检测其免疫反应性和在不同血清型钩体中的保守性。酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹检测兔抗钩体全菌血清中的LA0301编码蛋白的抗体。结果生物信息学预测结果显示,LA0301具有OmpA家族的结构域。克隆表达了重组质粒pQE31-LA0301,重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体,效价为1:32000。在兔抗钩体全菌血清中检测到特异的LA0301蛋白抗体,并在15个血清群的代表株钩体中均可检测到LA0301蛋白。结论LA0301蛋白是问号钩体中一个新的OmpA家族蛋白,具有良好的抗原性和保守性,并且能在钩体感染的过程中刺激机体产生相应的抗体。为进一步研究钩体新型疫苗候选基因奠定了基础。     

钩端螺旋体聚Beta羟基丁酸(PHB)生物合成途径分析

【目的】致病型问号钩端螺旋体(问号钩体, Leptospira interrogans)和腐生型双曲钩体(L. biflexa)能够大量合成菌体内贮藏物, 这可能是钩体在营养贫瘠环境中长时间存活的主要原因之一。本研究对钩体聚Beta羟基丁酸(PHB)贮藏物进行定性定量测定, 通过基因组分析补充定义PHB合成主要功能基因, 并采用分子生物学方法初步证明PHB合成途径的完整性, 为进一步研究PHB合成与钩体抗逆能力的关系奠定基础。【方法】采用脂类特异性尼罗红染色法和浓硫酸氧化-紫外分光光度计测定法, 对问号钩体和双曲钩体的PHB贮藏物进行定性定量测定; 采用生物信息学方法(BLAST和InterProscan/InterPro2Go), 通过同源性分析和功能结构域搜索寻找钩体基因组中的PHB合成相关基因; 最后采用克隆测序和定量RT-PCR技术检测相关基因表达情况, 初步验证生物信息学预测结果。【结果】尼罗红染色和氧化后比色定量实验证明钩体合成细菌常见贮藏物PHB, 问号钩体合成量为菌体干重的42%?45%, 双曲钩体合成量为64%?68%。尽管已公布的多个钩体基因组中均没有定义完整的PHB合成途径, 但本研究通过综合生物信息学分析, 在问号钩体和双曲钩体中鉴定了PHB合成途径的主要功能基因(phbC)。克隆测序和定量RT-PCR证实钩体转录表达大部分PHB合成相关基因(phbA/B/C), 说明钩体内该生物途径基本完整, 且部分高水平表达基因可能是钩体主要的PHB合成相关基因。【结论】问号钩体和双曲钩体均可合成PHB贮藏物, 且具有基本完整的PHB合成生物途径。     

钩端螺旋体(三宝垄群巴托型)耐热、耐碱性红血球致敏物质用于血凝试验的研究

我们从钩端螺旋体(三宝垄群巴托型)中提出一种耐热性、耐碱性红血球致敏物质(Fss),并进行了血凝试验的研究。初步发现这种物质可使绵羊红血球致敏。致敏后的红血球能与相应的免疫血清发生血凝反应。三宝垄群巴托型钩端螺旋体血清与其它型红血球致敏物质抗原的血凝试验,具有较高的敏感性和一定的型特异性,除与钩端螺旋体的独立群独立型和澳洲群巴力科型有一定的凝集价外,与其它8个群钩端螺旋体代表型均不产生凝集。由此提供了用这种抗原物质作钩端螺旋体抗原型鉴定的可能性。钩端螺旋体红血球致敏物质血凝试验受温度、红血球浓度及红血球致敏时间等因素的影响而使血凝增强或减弱。     

问号钩端螺旋体疫苗候选基因LB061的抗原性和保守性研究

目的 克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株中疫苗候选基因LB061,研究LB061的免疫原性和在不同血清型钩端螺旋体菌中的保守性。方法 生物信息学软件分析预测LB061的特征。构建原核表达质粒pQE31-LB061,经IPTG诱导后用SDS-PAGE及Western印迹法鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹法检测其抗原性和在不同血清型钩端螺旋体中的保守性。Western印迹法检测钩端螺旋体全菌兔抗血清中的LB061抗体。结果 生物信息学预测结果显示,LB061含有DUF839家族结构域。成功克隆了重组质粒pQE31-LB061,表达的重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生抗体(效价为1∶32000),并能与相应抗体反应,具有良好的抗原性。在16株不同血清型的钩端螺旋体中均可检测到LB061蛋白的表达,并在钩端螺旋体赖株全菌兔抗血清中检测到其抗体。结论 LB061蛋白可以作为外膜蛋白刺激宿主免疫系统产生抗体,具有良好的抗原性和保守性。本研究为其作为疫苗候选基因的研究奠定了基础。     

钩端螺旋体抗原研究进展

<正> 现已知致病性钩端螺旋体(以下简称钩体)有大约19个血清群共180个血清型。如此众多的血清型很难从形态、生化及培养特性上区分开来,但它们具有不同的抗原性,这对钩体的分类,钩体病的血清学诊断及钩体疫苗的研制均有重要意义(1)。本文仅就近年来国外有关钩体抗原研究的部分文献作一复习。