汉寿中华鳖线粒体细胞色素b基因克隆及其遗传多样性分析

本文以汉寿中华鳖为研究材料,比较分析中华鳖线粒体细胞色素b基因(Cytb)与瑞鳖、砂鳖等的差异,为探讨其进化与遗传分子标记奠定实验基础。采用PCR技术,克隆汉寿中华鳖Cytb基因的序列,并检测其在不同组织以及不同生长发育时期的表达模式,最后通过分子进化树分析中华鳖与砂鳖的亲缘关系。通过克隆发现中华鳖细胞色素b基因的mRNA开放阅读框含有1 140 bp,其碱基组成为A+T的含量(61. 1%)高于G+C(38. 9%),编码379个氨基酸残基的序列。与山瑞鳖和砂鳖氨基酸序列比较发现,中华鳖与瑞鳖和砂鳖均存在一定差异; Cytb基因在中华鳖不同组织和各个不同发育时期中均有表达,且在精巢组织中表达量最高,在不同时期阶段呈"低-高-低"曲线表达模式;分子进化树分析发现汉寿中华鳖与砂鳖具有较强的亲缘关系,但是在Cytb中仍存在差异,所以能够很好的把它们区分开来。此外汉寿中华鳖与哺乳动物、鱼类和爬行类均存在巨大差异。结果表明,Cytb基因在探讨汉寿中华鳖的进化与遗传分子标记中具有重要意义,可作为分析中华鳖种属进化系统发育特性和群体遗传多样性的标记基因。     

九肋鳖形态及遗传特性分析

研究在湖南洞庭湖及沅江水域内开展中华鳖(Pelodiscus sinensis)种质资源调查,发现中华鳖中存在“九肋鳖”,为了解其资源分布、形态特征以及遗传特性,从形态指标、线粒体DNA及骨骼发育基因多态性入手,比较研究九肋鳖(9对肋骨,简称R9)与八肋鳖(8对肋骨,简称R8)的形态及分子遗传特性。结果显示:(1)从湖南省沅江、益阳、常德和岳阳地区的12222只人工养殖中华鳖群体中共筛选出331只九肋鳖,其在养殖中华鳖群体中占比为2.2%—3.1%。(2)九肋鳖背甲内胸椎数为11枚,肋骨9对,比八肋鳖多1枚胸椎和1对肋骨。(3)九肋鳖背甲宽/背甲长、后侧裙边宽/背甲长显著小于八肋鳖,体高/背甲长显著大于八肋鳖。(4)九肋鳖CO I、Cytb、12S rRNA基因与中华鳖序列的同源性达到99%以上,进化树分析显示九肋鳖与中华鳖群体聚为一支,与中华鳖地理群体间均存在共享单倍型,未找到群体特异性标记。(5)九肋鳖与八肋鳖的RUNX2和VRTN基因外显子上共检测到4处突变位点,即g.977380 C>T、g.6014427C>T、g.6015734A>C及g.6015864A...     

近交系小鼠线粒体DNA多态性的研究

目的　分析BALB/c等八个近交系小鼠线粒体DNA(mtDNA)的多态性 ,探讨近交系小鼠的遗传监测方法。方法　PCR -RFLP技术 ,即PCR技术结合限制性内切酶片段长度多态分析 (restrictionfragmentlengthPolymorphism ,RFLP)。结果　mtDNAD -Loop、tR NAIle GIN Met、ND3基因片段经HaeⅢ、HinfⅠ、EcoRV、HindⅢ、HpaⅠ、BamHⅠ、ApaⅠ、NdeⅡ、XhoⅠ、XbaⅠ、AluⅠ、RsaⅠ、StuⅠ、DraⅠ、AvaⅠ、HaeⅡ 16种内切酶分别消化后 ,BALB/c、C3H、C57BL/ 6J、T739、DBA/ 2、TA2、6 15、BALB/c -nu/nu等小鼠均表现出相同的酶切格局 ,未发现多态性。结论　BALB/c、C3H、C57BL/ 6J、T739、DBA/ 2、TA2、6 15、BALB/c -nu/nu等近交系小鼠遗传背景较为狭窄 ,不同品系小鼠间遗传背景的差异远远低于动物种属间的差异     

基于线粒体Cytb基因全序列探讨两爪鳖和山瑞鳖的系统进化关系

采用PCR方法对两爪鳖(Carettochelys insculpta)和山瑞鳖(Pdea steindachneri)mtDNA的细胞色素b基因(Cytb)进行了扩增和测序,并结合GenBank中已公布的其它15种龟鳖类和两种鳄类的同源序列,进行了序列变异比较和系统发生分析.以凯门鳄和扬子鳄为外群,采用邻接(neighbor ioining,NJ)法、最大简约(maximum likelihood,ML)法和最大似然(maximum parsimony,MP)法重建分子系统树.结果均支持将龟鳖目分为3支:侧颈龟科(Pelomedusidae)(非洲侧颈龟Pelomedusa subrufa),两爪鳖科(Carettochelyidae)(两爪鳖Carettochelys insculpta)和一支由其它15种现生龟鳘类组成的进化支.在这里两爪鳘科被认为可能代表一新的亚目;而山瑞鳖聚于鳖科(Trionychidae)中,与中华鳌(Pelodiscus sinensis)最先聚成一支,再依次与马来鳖(Dogania subplana)、非洲鳖(Trionyx triunguis)、印度箱鳖(Lissemys punctata)聚成一组.     

水稻线粒体DNA酶切带型研究

水稻IR36线粒体DNA经6种限制酶酶切,用脉冲电泳和长距离琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段,获得高分辨率的清晰带型。每组酶切片段加和测得水稻IR36线粒体基因组大小分别为227kb(HindⅢ)、253kb(EcoRⅠ)、253kb(XhoⅠ)、294kb(BamHⅠ)、239kb(SalⅠ)和283kb(xbal)采用9个来自水稻和玉米线粒体基因组的基因探针与酶切条带杂交发现,水稻线粒体基因组含有包括编码基因在内的重复顺序。     

中华鳖非特异性免疫功能的群体差异研究

从补体总量、红细胞C3 b受体花环率、红细胞天然免疫肿瘤细胞花环率、T淋巴细胞活性E花环率及白细胞吞噬活性五方面 ,探讨了黄河鳖、淮河鳖、洞庭湖鳖、鄱阳湖鳖及太湖鳖在非特异性免疫功能上的差异。主要结果 :(1)在补体总量及红细胞天然免疫肿瘤细胞花环率上 ,五群体之间差异不显著 (F <0 .0 5 ) ;(2 )在红细胞C3 b受体花环率上 ,黄河鳖显著地高于鄱阳湖鳖与太湖鳖 (P <0 .0 5 ) ,而其余群体间则差异不显著 (F <0 .0 5 ) ,花环率大小顺序为 :黄河鳖 >淮河鳖 >洞庭湖鳖 >鄱阳湖鳖 >太湖鳖 ;(3)在T淋巴细胞活性E花环率上 ,黄河鳖显著高于鄱阳湖鳖 (P <0 .0 5 ) ,太湖鳖极显著地低于其他四个群体 (F >0 .0 1) ,其余群体间则差异不显著 (P >0 .0 5 ) ,花环率大小顺序为 :黄河鳖 >淮河鳖 >洞庭湖鳖 >鄱阳湖鳖 >太湖鳖 ;(4 )在白细胞吞噬活性上 ,除淮河鳖与鄱阳湖鳖差异不显著外 (P >0 .0 5 ) ,其余群体间则差异极显著 (F >0 .0 1) ,活性大小顺序为 :黄河鳖 >洞庭湖鳖 >淮河鳖 >鄱阳湖鳖 >太湖鳖。综上所述 ,在非特异性免疫功能上 ,黄河鳖最强 ,太湖鳖较弱。     

变色栓菌漆酶基因的克隆与序列分析

本研究以PCR扩增的方法,从变色栓(菌Trametes versicolor)的基因组DNA中扩增出了一预期大小的DNA片断,并将其克隆到了pUCM-T载体上。经筛选、酶切、PCR鉴定,序列分析,证明该片断为变色栓菌漆酶基因的克隆。该基因的开放阅读框由1560个核苷酸组成,编码一个由519个氨基酸组成的多肽。与GeneBank中发表的Laccase基因(AY081188)序列比较发现,编码的氨基酸序列同源性为96%,而核苷酸序列的同源性为92%。     

水稻细胞质雄性不育系和保持系的线粒体COⅠ、COⅡ基因组织结构差异的分析

我们研究了水稻珍汕97不育系和保持系的线粒体DNA的PstⅠ、HindⅢ、BamHⅠ酶切电泳带型,发现了不育系和保持系的线粒体DNA分子结构的显著不同,而不育系和保持系的叶绿体DNA的HindⅢ酶切片段没有差异。以线粒体的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ(COⅠ、COⅡ)基因为探针,与珍汕97不育系、保持系的叶绿体、线粒体DNA酶切片段进行分子杂交,证明叶绿体DNA没有COⅠ、COⅡ基因的同源顺序,发现不育系和保持系COⅠ、COⅡ基因有组织结构上的差异,但不能确证这些差异是否与细胞质雄性不育有关。     

山瑞鳖驯化养殖、保护及其开发利用的初步研究Ⅱ.山瑞鳖的生长、饲养管理及保护利用

(续上期 )4　山瑞鳖的稚幼鳖的生长4 1　刚孵出的山瑞稚鳖的大小　测量了不同窝次刚孵出 3 5只稚鳖 (在鳖类从卵内刚孵出的鳖通称稚鳖 ,至于稚鳖期与幼鳖的界限则无定论。本文对山瑞鳖按体重划分为 :5 0 ｇ以下为稚鳖期 ,5 0～ 40 0ｇ为幼鳖期 ,40 0～ 40 0 0 ｇ为商品鳖 ,40 0 0 ｇ以上视为成年鳖 ) ,平均体重 7 4(6 0～ 9 1 ) ｇ ,背甲长宽 3 7 6× 3 0 9(3 0× 2 3～ 47× 3 4)ｍｍ ,腹盘长 2 5 0 (2 4～ 2 7)ｍｍ。4 2　山瑞幼鳖的生长　前述刚孵出的 3 5只稚鳖经过7个月的加温 (2 5℃ )饲养结果 ,除中途死亡 1 1只外 ,剩下 2 4只幼鳖…     

中国昆明(KM)小鼠线粒体DNA限制性内切酶图谱的研究

线粒体DNA的限制性内切酶图谱在不同的种系及亚种间存在多态性。我们分别用五种限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅡ、HidⅢ、PstⅠ、MspⅠ对60只中国KM小鼠(雌雄各半)的线粒体DNA进行了酶切电泳分析,结果未发现多态性,且这五种限制性内切酶图谱均与BALB/c小鼠相同。这表明中国KM小鼠与绝大多数实验小鼠一样,均起源于欧州的野鼠M.m.domesticu。未见到KM小鼠经其它亚种野鼠母系遗传污染的迹象。     

Isolation and characterization of microsatellites in Chinese soft‐shelled turtle,Pelodiscus sinensis

Fifteen polymorphic microsatellite loci were developed for the Chinese soft‐shelled turtle (Pelodiscus sinensis) from the (GT)_n microsatellite‐enriched genomic library, using the fast isolation by amplified fragment length polymorphism of sequences containing repeats protocol. The polymorphism of all 15 loci ranged from two to seven alleles with observed heterozygosities ranging from 0.03 to 0.98 (mean 0.43) in one population of 40 individuals. These novel loci will be helpful for understanding the population structure at genetic level and marker‐assisted breeding of this vulnerable species.     

完全或部分的食物剥夺对中华鳖(Pelodiscus sinensis)幼体补偿生长反应的影响:生长率的时间变化模式与体组成的变化

为了探究中华鳖（Pelodiscus sinensis）幼体的补偿生长能力,我们对中华鳖幼鳖（平均湿重9．56g）进行如下6种处理：饥饿0（对照）、1、2、3、4周,或者食物限制4周,即只投喂体湿重百分之一的食物;然后对各组进行饱食处理直到10周的实验结束为止。结果发现在饱食期的第一周各饥饿处理组的特殊生长率均显著高于对照组（P〈0．05）,但是终体重均没有赶上对照组。当饥饿或食物限制结束时,脂肪含量随着饥饿期的延长而降低,灰分和水分则表现出相反的变化趋势：脂肪含量显著低于对照（P〈0．05）,而灰分和水分则显著高于对照（P〈0．05）。蛋白含量则没有显著变化（P〉0．05）。实验结束时,除了灰分外（P〈0．05）,其他个体组成指标均恢复到对照组的水平。以上结果表明中华鳖幼体在饥饿胁迫下首先利用脂肪作为主要能源以维持生存,以及在该研究条件下完全的食物剥夺可以诱发其部分补偿生长反应．而部分食物剥夺则不能诱发此反应。     

鳖的形态学统计分析

利用生物统计学的方法对鳖的形态进行了分析 ,结果如下 :鳖的年龄 (Y)与体重 (X)的一元回归方程为 :Y =0 0 0 736 1X 0 4 534,年龄 (Y)与腹甲长 (X)的一元回归方程为 :Y =0 2 4 59X- 0 5480 ;雌雄鳖尾长差异显著 (P <0 0 5) ,雄鳖体重 (Y)对尾长 (X)的一元回归方程为 :Y =2 56 6 4X - 82 8 6 0 ;野生鳖体重 (Y)对背甲长 (X1)、体高 (X5)、头长 (X8)、眼径 (X9)、口裂 (X12 )等 13个形态学指标的最优多元回归方程为 :Y =880 51 6 79 16X1- 10 6 0 91X5 146 4 72X8- 82 96 6 4X9- 3142 0 9X12 ;控温条件下快速生长鳖体重 (Y)对腹甲宽 (X4 )、体高 (X5)、头发 (X8)、眼间距(X10 )、尾长 (X13)等 13个形态学指标的最优多元回归方程为 :Y =- 97 4 6 38 99X4 30 2 6X5-2 9 34X8 140 83X10 - 30 4 2X13.     

中华鳖GHSR基因SNPs的筛选及生长性状的关联分析

为探究GHSR基因多态性对中华鳖(Pelodiscus sinensis)生长相关性状的影响,采用直接测序法在GHSR基因5'侧翼和3'侧翼上筛选SNPs位点,共检测到5个单核苷酸多态性位点:A335T、G397T、A527G、A13482C和T13526A。随机选取同批繁殖的1冬龄200只中华鳖用直接测序法进行SNPs位点的分型,并分析与生长性状的相关性。检测结果显示,所有SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡状态(p>0.05)。方差分析显示,A336T位点的AT、TT基因型的体重、背甲长、背甲宽和裙边宽4项生长数据均显著高于AA基因型。A13482C位点的AC基因型的体重、背甲长、背甲宽和裙边宽4项数据均显著高于AA基因型(p<0.05)。研究表明,本实验在GHSR基因上获得的这些SNP位点可能影响着中华鳖的生长性状或与之紧密连锁,可为中华鳖分子辅助育种提供助力与参考。     

西藏林芝市发现北椋鸟

中华鳖(Pelodiscus sinensis)是我国重要的特种水产经济动物，也是鳖科动物的代表物种。中华鳖阴茎头为阴茎末端的黑色部分，是进行交配和排精的关键，但其系统性研究还未见报道。本研究以6龄性成熟雄性中华鳖为研究对象，通过解剖学和组织学方法，观察勃起和自然状态下中华鳖阴茎头结构和组织特性。结果显示，中华鳖阴茎体背侧存在两条排精沟，并顺着阴茎体一直延伸到阴茎头两侧的末端。阴茎头背侧的表皮为褶皱状血窦，血窦在阴茎充血后膨大，使得阴茎头的突触状组织充分伸展，形成了独特的“蝴蝶状”结构，并且该结构可以在射精时做开合运动。此外，阴茎头表面还具有丰富的绒毛和黏液。中华鳖阴茎头在勃起状态下形成特殊“蝴蝶状”结构，我们推测这种结构可能直接与交配的稳定和排精相关。     

Effect of thermal acclimation on thermal preference,resistance and locomotor performance of hatchling soft-shelled turtle

The significant influence of thermal acclimation on physiological and behavioral performance has been documented in many ectothermic animals, but such studies are still limited in turtle species. We acclimated hatchling soft-shelled turtles Pelodiscus sinensis under three thermal conditions （10, 20 and 30~C） for 4 weeks, and then measured selected body temperature （Tsel）, critical thermal minimum （CTMin） and maximum （CTM~x）, and locomotor performance at different body temperatures. Thermal acclimation significantly affected thermal preference and resistance of P sinensis hatchlings. Hatchling turtles accli- mated to 10~C selected relatively lower body temperatures and were less resistant to high temperatures than those acclimated to 20~C and 30~C. The turtles＇ resistance to low temperatures increased with a decreasing acclimation temperature. The thermal re- sistance range （i.e. the difference between CTM~x and CTMin, TRR） was widest in turtles acclimated to 20~C, and narrowest in those acclimated to 10~C. The locomotor performance of turtles was affected by both body temperature and acclimation tem- perature. Hatchling turtles acclimated to relatively higher temperatures swam faster than did those acclimated to lower temperatures. Accordingly, hatchling turtles acclimated to a particular temperature may not enhance the performance at that temperature. Instead, hatchlings acclimated to relatively warm temperatures have a better performance, supporting the ＂hotter is better＂ hypothesis.     

中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.     

不同产地中华鳖的线粒体控制区序列分析及结构比较

采用PCR特异引物,扩增了两产地中华鳖（Pelodiscus sinensis）个体的mtDNA控制区（CR）及其邻近片段,测序获得了长度分别为1830bp和1630bp的序列。结合GenBank中已发表的韩国产中华鳖mtDNA的CR区序列,比较了3个产地中华鳖的CR区结构。分析显示：中华鳖不同产地mtDNA CR区DNA中的A＋T含量分别为60.5%、63.6%和64.8%,它们的5′、3′末端以及CSB1-CSB2之间均存在丰富的可变数目串联重复序列（variable numbers oftandem repeats,VNTR）。基于mtDNA CR区序列和结构分析,显示中华鳖不同产地的野生个体中存在丰富的遗传多样性。     

摄食水平对中华鳖稚鳖生长、氮排泄和能量收支的影响

在 30℃水温下进行摄食 -生长实验 (实验周期为 5 6d) ,设饥饿、1%、2 %、4 %和饱食 5个摄食水平 ,研究了中华鳖稚鳖 (39 5 4— 4 4 2 2g)的生长和能量收支。结果表明 ,中华鳖稚鳖的特定生长率随摄食水平的增加 ,其湿重、干物质、蛋白质和能量的特定生长率均呈二次曲线增加 ,其中干物质的特定生长率 (SGRdr)与摄食率 (Rl)的关系式为 :SGRdr=- 1 8799 1 0 795Rl- 0 0 832Rl2 (r=0 90 6 ,n =2 5 ,P <0 0 1) ;除干物质转化效率外 ,湿重、蛋白质和能量的转化效率在 2 %组均达到最大 ,分别为 36 31%、2 1 4 7%和 2 8 10 % ;除能量转化效率外 ,4 %组湿重、干物质和蛋白质的转化效率与最大值均无显著差异 ;摄食水平对中华鳖稚鳖总氮排泄率、氨氮排泄率、尿素氮排泄率以及氨氮占总氮排泄率的比例均有显著影响 (P <0 0 1) ,除氨氮占总氮比例外其他指标均随摄食水平的增加而增加 ,氨氮比例在饥饿组最高为 5 5 83% ,由饥饿到饱食其变化范围是 4 4 5 0 %— 5 5 83% ;总氮排泄率、氨态氮排泄率和尿素氮排泄率的变动范围分别是 19 81%— 6 5 87%、9 4 4 %— 36 31%和 8 2 4 %— 2 9 5 6 % ,回归分析表明 ,幼鳖的总氮排泄率 (μmol/g·d) (G N)、氨氮排泄率 (μmol/g·d) (NH3 N)及尿素氮排泄率 (μmol/g·     

慢性氨暴露对中华鳖幼鳖生长及非特异性免疫反应的影响

在高密度养殖模式下,中华鳖经常暴露于高氨环境中。本研究评价了慢性氨暴露对中华鳖(Pelodiscussinensis)幼鳖生长及非特异性免疫功能的影响。将鳖(体重90.5±20.5g)饲养于非离子氨浓度分别为1.49mg/L(C1)、2.61mg/L(C2)和4.14mg/L(C3)的环境中84d,以不外加氨氮的自来水饲养组为对照(C0),实验期间各处理组均保持恒定的温度(29.5±0.5℃)和pH(7.8±0.1)值。氨暴露21、42和84d后测体重,氨暴露84d后取各实验组鳖的血样。在本实验设定浓度范围内,氨对中华鳖的生长及非特异性免疫指标如血清溶血活性、血清杀菌活性、血清溶菌活性和脾脏系数没有显著影响。但氨暴露组中华鳖血液和脾脏淋巴细胞α-乙酸萘酯酶(ANAE)阳性率与对照组相比均显著下降。研究结果表明中华鳖对高氨耐受能力比鱼类更强。