应用种特异性PCR技术快速鉴定辣椒实蝇

【目的】辣椒实蝇 Bactrocera latifrons (Hendel)为我国重要的检疫性有害生物,其寄主范围广泛,危害严重。由于传统鉴定方法受到饲养周期、饲养条件、虫态等因素的限制,使得果蔬进出口贸易通关速度、疫情快速鉴定受到较大的影响,因此迫切需要开发关于实蝇的快速鉴定识别的技术。【方法】本研究基于mtDNA COI序列设计了一对能够准确鉴定辣椒实蝇的种特异性引物FL680和RL1057,选用辣椒实蝇作为阳性对照,选用番石榴实蝇B. correcta (Bezzi)、桔小实蝇 B. dorsalis (Hendel)和颜带实蝇 B. cilifer (Hendel)等20种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。【结果】仅目标种辣椒实蝇能够扩增出清晰且单一的约378 bp的条带,其余实蝇种类均未出现条带。将本实验建立的种特异性PCR（SS-PCR）鉴定方法应用于实际检疫工作中并得到了验证,表明该方法具有强的种特异性。【结论】本文提出辣椒实蝇快速鉴定识别技术可应用于实蝇的疫情监测和口岸的检疫检测工作。     

地中海实蝇及其近缘种基因芯片检测研究

本研究选择线粒体DNA (mtDNA) 细胞色素氧化酶Ⅰ基因（COⅠ）为分子标记基因,以双翅目实蝇科昆虫DNA序列为目标,建立了我国进境植物检疫害虫地中海实蝇Ceratitis capitata、芒果小条实蝇C. cosyra和纳塔尔小条实蝇C. rosa等生物芯片检测方法。地中海实蝇及其近缘种检测芯片由检测探针（实蝇科通用探针1条,小条实蝇属通用探针1条,地中海实蝇、芒果小条实蝇和纳塔尔小条实蝇近缘种探针2条和种特异探针4条）、质控探针（定位点探针、阳性质控、阴性质控和空白对照探针各1条）组成。芯片检测结果表明,检测探针特异性强,能实现上述3种实蝇的种类快速区分和准确鉴定; 检测方法稳定性好,地中海实蝇不同虫态（卵、幼虫、蛹和成虫）和不同地理种群检测结果完全一致。地中海实蝇生物芯片检测技术将为我国进口果蔬中检疫性实蝇快速筛查和种类鉴定提供检测方法,同时,还可应用到其他属的实蝇以及相关害虫的检疫中,为有害生物的快速鉴定提供了新方法。     

辣椒疫毒致病毒素

辣椒疫霉（PhytophthoracapsiciLeonian）在培养液中振荡培养时可分泌毒素,这种毒素能引起辣椒叶片形成水渍状褐腐斑,类似病原菌侵染后形成的症状。Plich’s和V8C培养液适于P.capsici的生长和产毒;生长适宜温度和pH范围分别为20～30℃与pH6～7,在25～30℃、pH5～8的条件下培养滤液毒性最强;培养15天产毒达到最高值。滤液先后经85％硫酸铰沉淀、DE52、CM32和SephadexG－75柱层析将毒素纯化。经鉴定该纯毒素为39．8kD酸性糖蛋白,并对80℃以上高温或蛋白酶敏感,而β-D-葡萄糖苷酶处理不影响其毒性,蛋白亚基为毒素的活性中心。毒素处理寄主叶片引致病理性坏死,这一作用与辣椒品种抗病性有关。     

斜纹夜蛾发育起点温度和有效积温的研究

斜纹夜蛾Prodenialitura（Fabricius）属鳞翅目夜蛾科,是一种食性很杂的害虫,常间歇性大暴发。为给预测预报提供依据,更有效地防治斜纹夜蛾,作者对该虫发育起点温度和有效积温进行了研究。1材料与方法从烟田采回6龄幼虫放人养虫盆中,用新鲜烟叶饲养。羽化后,将成虫雌雄（1：1）配对移人产卵笼内,产卵笼内备有清洁的盆栽烟株,以收集经交配后所产的受精卵粒。1．1饲养方法：卵孵化后,挑取初孵幼虫单头饲养在备有烟叶的罐头瓶中,然后放人人工气候箱内恒温培养,24小时全光照,相对湿度控制在70％～80％,测试温度分别为18、21、24、…     

瓜实蝇的有效积温及其在中国的年发生代数预测

瓜实蝇Bactrocera cucurbitae Coquillett是世界上重要的检疫性害虫,通过在14、18、22、26、30、34℃温度下孵化和饲养实验,测定该虫卵、幼虫、蛹、产卵前期、世代的发育起点温度和有效积温分别是8．0982℃、4．5245℃、4．5245℃、7．4751℃、10．0019℃和28．8506、162．7462、145．7249、166．5126、503．8343日度。根据该虫的致死温度和有效积温模型,运用数学分析和地理信息系统技术,预测了瓜实蝇在中国的适生区和年发生代数,结果表明：该虫可在中国48．96％地区发生（气象站点所代表的地区）,1年发生2-12代,以4～6代为主。     

Establishment and application of DNA barcoding technology for identification of the immatures and adult debris of Bactrocera dorsalis (Hendel) ( Diptera: Tephritidae)

实蝇类害虫多为国内外检疫对象,其鉴定识别方法主要依据成虫的外部形态特征,而传统的形态学识别法对口岸经常截获的幼体及残缺的虫体,则无能为力.本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis的幼体(卵、幼虫、蛹)以及成虫残体(足、翅、头部、胸部、腹部)为对象,利用DNA条形码技术,构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系,并以其他4种常见实蝇(包括番石榴实蝇B.correcta、瓜实蝇B.cucurbitae、南亚果实蝇B.tau、柑桔大实蝇B.minax)为对象对该技术体系进行应用验证.结果显示,桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据库中靶标种CO Ⅰ基因碱基序列的一致性为99.51％～99.84％,其他4种实蝇相应序列与数据库中靶标种CO Ⅰ基因序列的一致性分别为100％,100％,99.81％～ 99.83％和100％;以邻接法(NJ法)构建系统发育树,靶标种实蝇均与数据库中对应种实蝇聚为一支,且置信度均为100％.以K2-P模型计算种内及种间遗传距离得出,5种实蝇的种间遗传距离为0.0597～0.2363,平均为0.1693;种内遗传距离为0.0000 ～0.0041,平均为0.0019.这些结果表明,基于DNA条形码的物种识别技术完全可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定.     

用2.5%敌杀死防治烟草粉螟老熟幼虫

烟草粉螟Ephestiaelulella（Htibner）,又名烟草粉斑螟,属鳞翅目、螟蛾科。以往由于长期单一地使用敌敌畏防治,致使该虫产生抗药性,防治效果减退。为解决卷烟生产的急需,我们在观察该虫生物学特性的基础上,于1993年7月起,用2．5％敌杀死在贵阳卷烟厂对烟草粉螟老熟幼虫进行了防治试验。l材料与方法烟草粉螟幼虫是从烟包内爬出来的老熟幼虫。2．5％敌杀死药剂由法国罗素——优克福公司生产。其方法：（l）将老熟供试幼虫分别放入培养皿（15X150）内,每组培养皿放幼虫10头,共设15组。设对照组,幼虫10头。然后将2．5％敌杀死分别稀…     

辣椒疫霉致病毒素

辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)在培养液中振荡培养时可分泌毒素,这种毒素能引起辣椒叶片形成水渍状褐腐斑,类似病原菌侵染后形成的症状。Hich’s和V₈培养液适于P capsici的生长和产毒;生长适宜温度和pH范围分别为20～30℃与pH6～7,在25～30℃、pH5～8的条件下培养滤液毒性最强;培养15天产毒达到最高值。滤液先后经85％硫酸铵沉淀、DE52、CM32和SephadexG-75柱层析将毒索纯化。经鉴定该纯毒索为39．8kD酸性糖蛋白。并对80℃以上高温或蛋白酶敏感,而β-D-葡萄糖苷酶处理不影响其毒性,蛋白亚基为毒紊的活性中心。毒素处理寄主叶片引致病理性坏死,这一作用与辣椒品种抗病性有关。     

家用调料植物粗提物防治小菜蛾的研究

以安全性和简易性为前提的庭园害虫防治成为休闲生活不可或缺的技术。本文以花椒Zanthoxylum bungeamtm、八角茴香lUicium veturn、辣椒Capsicum frutescens等日用品为材料,研究了不同种类、浓度和作用时间对小菜蛾Plutella xylostella这一重要庭园害虫的拒食、触杀及产卵忌避效果。拒食试验表明,供试3种植物对小菜蛾有显著拒食作用,拒食率从大到小依次为八角茴香（0．94）、花椒（0．86）、辣椒（0．76）;拒食率随处理时问长短变化的差异不显著,但随提取液浓度的升高而升高。触杀试验表明,供试3种植物对小菜蛾有显著触杀作用,24h内死亡率从大到小依次为花椒（45．6％）、八角茴香（35．6％）、辣椒（23．3％）,均显著高于对照处理的1．1％;触杀死亡率随虫龄的增加而降低。产卵忌避试验表明,3种植物对小菜蛾成虫产卵忌避作用由大到小依次为辣椒、八角茴香、花椒。综合本研究所得结果来看,八角茴香对小菜蛾的控制效果最好。所选材料容易获得,对小菜蛾忌避作用明显,在庭园小菜蛾防治中具有潜在的应用价值。     

木瓜实蝇对七种寄主果实的选择性

木瓜实蝇属于我国进境检疫性害虫。为明确该虫对不同寄主果实的选择性,以评价其危害风险,本研究选择橙子、苹果、番石榴、杨桃、木瓜、西红柿、辣椒7种果实作为供试寄主,在室内选择性条件下比较了木瓜实蝇在不同寄主上的产卵量和幼虫发育的适合性。结果表明,以寄主气味诱导产卵器采卵时,雌虫在番石榴、橙子上产卵量明显高于其它所有供试寄主;以果实直接诱导产卵时,则以番石榴饲养出的幼虫数最多,而在橙子、西红柿上的幼虫数为0。在非选择性条件下将幼虫接入果实供试,表明木瓜实蝇幼虫在不同供试寄主上的存活率(化蛹率)均较高,最高为木瓜和杨桃,分别为92.0%和91.3%,最低为苹果,达到66.0%。不同供试果实对木瓜实蝇幼虫的发育历期、存活率(化蛹率)和蛹重有显著影响,但各适合性指标在不同寄主间的变化趋势不一致。上述结果表明,寄主气味及果皮特征对成虫的产卵选择性具有明显的影响,以产卵选择性和幼虫发育为综合指标,认为木瓜实蝇对番石榴的选择性最高。     

辣椒红色素与辣椒碱的提取分离

以干辣椒粉为原料,用95％乙醇作溶剂进行索氏提取,溶剂的用量为原料质量的5倍,减压蒸馏回收溶剂至浸膏状,用石油醚溶解注入硅胶柱。用石油醚：丙酮（V/V）=5：1的复配液为洗脱剂把色素洗脱下来,回收洗脱液,得到深红色油状辣椒红色素产品。留在柱子上的辣椒碱则用75％乙醇作溶剂洗脱下来,去除溶剂,无水乙醚结晶得白色的矩形晶体。     

桔小实蝇、木瓜实蝇和番石榴实蝇耐热性的热动力学分析

果实蝇属是重要的检疫性有害生物之一, 其中桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)、 木瓜实蝇B. papayae Drew & Hancock和番石榴实蝇B. correcta (Bezzi)近几年在口岸检出率居高。本研究利用热水浸泡处理法比较这3种实蝇的卵、 1龄幼虫和3龄幼虫在44~47℃下的耐热性, 利用热动力学模型和活化能比较每种实蝇的耐热虫态以确定耐热种。结果表明： 在测定温度范围内, 3种实蝇卵、 1龄幼虫和3龄幼虫的死亡率都与处理时间呈正相关。热动力学系数取0.5时, 最适合热动力学模型预测3种实蝇在各实验温度LT_99.9968的致死时间。3种实蝇在44~47℃耐热性均为： 卵>1龄幼虫>3龄幼虫。番石榴实蝇在3种实蝇中最耐热。本研究结果为实蝇热处理指标的制定提供了实验依据。     

辣椒总碱主要组分改进的HPLC测定法

本文采用HPLC法对辣椒总碱样品的主要组分进行了定量测定。色谱条件为：ODS C18柱,柱温：25℃,流动相：甲醇-乙腈-水(65：25：10),流速：1mL／min,检测波长：280nm,进样量为2μL。分析过程中,辣椒总碱的组分与其他杂质达到基线分离,能够准确测出辣椒碱及二氢辣椒碱的含量。粗提物辣椒总碱中辣椒碱及二氢辣椒碱的含量分别为2．36％和2．89％,方法的平均加样回收率分别为99．22％和99．06％。结果表明,本实验提供的测定方法较以往的文献所提供的辣椒总碱的检测方法更快速、简便、准确。     

利用辣椒疫霉培养滤液体外筛选胡椒抗瘟病无性系研究

在胡椒（Piper nigrum Linn．)茎尖丛生增殖技术的基础上,以印尼大叶种“Lampong Type”无菌实生苗作外植体源,利用辣椒疫霉(Phytophthora capsici)培养滤液对胡椒茎尖及其增殖形成的丛生芽进行体外选择。辣椒疫霉培养滤液的不同灭菌方法对辣椒疫霉培养滤液的毒性影响显著,过滤灭菌方式可以保持辣椒疫霉培养滤液的毒性,而高温高压灭菌方式则不能。随着辣椒疫霉培养滤液浓度的增加,茎尖和丛生芽的存活率和增殖率都在下降。在存活的茎尖或丛生芽培养中,一部分可正常增殖,其余的形成愈伤组织,或者保持生长停滞的休眠状态。在选择性培养基上继代培养2次后进行生根和移栽,利用离体叶片针刺接种法对温室条件下生长的移栽植株进行抗瘟病测定。以3次抗病检测均无明显症状的植株作为抗病株。随着辣椒疫霉培养滤液浓度的增加,得到的再生植株数量降低,但其中抗病株的比例提高。利用过滤灭菌方式加入选择性培养基的处理中,25％、50％和75％的辣椒疫霉培养滤液分别获得1株、4株和3株抗病株,分别占各处理再生植株总数的1．54％、20．00％和42．86％,共获得8株,占该组处理再生植株总数的8．70％。     

茉莉酸甲酯和苯丙氨酸对辣椒果实品质的影响

本文研究了不同浓度的茉莉酸甲酯（MeJA）和苯丙氨酸（Phe）对‘湘研5号’辣椒果实不同发育时期的辣椒素、二氢辣椒素、维生素c以及干物质含量变化的影响。结果表明：500和1000mg·L-1 MeJA处理60d后的辣椒素含量分别比对照提高了41．7％和58．4％：同时500mg.L-1 MeJA处理能促进辣椒果实中的二氢辣椒素、维生素C的积累,对干物质积累也有一定作用。60mg·L-1 Phe处理能提高辣椒果实中辣椒素、二氢辣椒素和干物质的含量,但对维生素C影响不显著。     

二纹柱萤叶甲的生物学特性及防治研究

二纹柱萤叶甲CallerucidabifasciataMotschulsky属叶甲科,主要危害养麦属以及蒿属植物。据初步调查,在我国的黑龙江、云南、贵州、四川皆有分布和危害,此虫以成虫、幼虫取食养麦叶片和花序,致使养麦叶片受害率高达100％,产量减少5％～10％。为控制此虫的严重危害,笔者对该虫的生物学特性及防治进行了初步观察研究,现将结果报道如下。1形态特征1．1成虫：虫体近椭圆形,体背凸起,鞘翅及前胸背板具光泽。头部复眼、上颚触角、前胸背板均为黑色。雄虫体长6～7mm、宽4～smm,触角律状;雌虫体长7～smm、宽4～5．smm,触角丝状,雌、雄…     

取食不同辣椒品种果实成分对棉铃虫幼虫唾腺蛋白及相应基因表达的影响

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）在不同辣椒Capsicum annuum L. 品种上的寄主适合度存在较大差异。本研究的目的是弄清不同辣椒品种对棉铃虫唾腺蛋白及相应基因表达的影响。【方法】通过双向电泳和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）的方法,探讨棉铃虫5龄幼虫取食添加辣椒碱含量不同的4个辣椒品种果实成分的人工饲料后,其唾腺中蛋白及相应基因表达的变化。【结果】双向电泳结果表明：取食4个处理的人工饲料后,棉铃虫5龄幼虫唾腺中蛋白质表达存在显著差异（P<0.05）,定量分析发现 28个蛋白点在不同处理间差异表达。通过ESI-Q-TOF-MS分析鉴定出15种差异表达蛋白,其中β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）、热休克蛋白70（HSP70）和翻译起始因子5A（eIF5A）在不同处理间差异较大。进一步荧光定量PCR分析显示：人工饲料中添加辣椒碱含量较高的果实成分能够促进棉铃虫β-fructofuranosidase基因的表达,添加辣椒碱含量较低的果实成分则抑制了该基因的表达;4个处理对棉铃虫hsp70基因的表达均表现出持续抑制,对eIF5A基因则均表现出一定程度的抑制。【结论】该结果为丰富和拓宽β-fructofuranosidase,hsp70 和eIF5A在昆虫中的功能研究、揭示棉铃虫对辣椒的寄主适应机制和生产上抗虫辣椒品种的选育提供了重要的基础材料。     

橘小实蝇快速检疫鉴定方法

采用形态学观察与PCR技术相结合的方法,针对台湾水果中截获的可疑橘小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)幼虫和蛹进行快速鉴定。采用异硫氰酸胍方法快速提取昆虫基因组DNA,并根据特异性引物,采用PCR技术从截获的可疑橘小实蝇幼虫和蛹样本中均扩增得到224 bp的特异性条带,经测序比较发现,扩增产物序列与橘小实蝇目的基因序列完全相同,由此证明可疑样本为橘小实蝇的幼虫和蛹。该方法解决了橘小实蝇幼虫和蛹等未成熟虫态的快速检疫难题,大大缩短了检测周期,值得口岸检验检疫借鉴应用。     

黑粉虫幼虫肠道细菌的研究

从黑粉虫幼虫肠道环境中分离、纯化、培养,获得5个细菌菌株,对其培养性状、染色反应、菌体形态、生理生化反应等进行了系统研究.鉴定结果表明：上述5个细菌菌株分别属于金杆菌属（Aureobacterium）、李斯特菌属（Listeria）、微杆菌属（Microbacterium）、莫拉菌属（Moraxella）、短小杆菌属（Curtobacterium）,其中金杆菌属、微杆菌属、短小杆菌属菌也发现于黄粉虫幼虫肠道环境中.通过研究,既可为黑粉虫生产所需微生态制剂提供微生态理论依据,又发掘了微生物资源,丰富了微生物资源库.     

桔小实蝇幼体及成虫残体DNA条形码识别技术的建立与应用

实蝇类害虫多为国内外检疫对象, 其鉴定识别方法主要依据成虫的外部形态特征, 而传统的形态学识别法对口岸经常截获的幼体及残缺的虫体, 则无能为力。本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis的幼体（卵、 幼虫、 蛹）以及成虫残体（足、 翅、 头部、 胸部、 腹部）为对象, 利用 DNA 条形码技术, 构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系, 并以其他4种常见实蝇（包括番石榴实蝇B. correcta、 瓜实蝇B. cucurbitae、 南亚果实蝇B. tau、 柑桔大实蝇B. minax）为对象对该技术体系进行应用验证。结果显示, 桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据库中靶标种COⅠ基因碱基序列的一致性为99.51%~99.84%, 其他4种实蝇相应序列与数据库中靶标种COⅠ基因序列的一致性分别为100%, 100%, 99.81%~99.83%和100%; 以邻接法（NJ法）构建系统发育树, 靶标种实蝇均与数据库中对应种实蝇聚为一支, 且置信度均为100%。以K2-P模型计算种内及种间遗传距离得出, 5种实蝇的种间遗传距离为0.0597~0.2363, 平均为0.1693; 种内遗传距离为0.0000~0.0041, 平均为0.0019。这些结果表明, 基于DNA条形码的物种识别技术完全可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定。