基于FoldX力场的蛋白突变建模方法可用于人工锌指酶辅助设计

锌指酶是一种可对动植物基因组内特异序列进行高效遗传修饰的人工重组核酸酶.目前,获取一对有活性的人工锌指酶的常规方法是通过构建大量的锌指蛋白突变体,利用细菌杂交方法从中筛选有结合活性的个体,工作量庞大、专业性强,普通研究人员往往难以胜任,极大地限制了锌指酶技术的广泛应用.因此,采用计算机辅助人工锌指酶设计的方法降低筛选难度和工作量显得十分有必要.本研究选用FoldX分子力场软件对国际锌指酶协会研究人员采用OPEN方法构建的共420个锌指蛋白突变体进行蛋白-DNA复合体建模,并计算模型中锌指蛋白与靶标DNA的结合自由能.经统计分析发现,模拟复合体中的锌指蛋白-DNA结合自由能与该锌指蛋白在哺乳动物细胞内形成无活性锌指酶的概率存在明显相关关系.当结合自由能低于？13.132kcal/mol时形成无活性锌指酶的概率可降低至5%以下,而当结合自由能大于？5kcal/mol时形成无活性锌指酶的概率高达40%.因此,采用FoldX构建锌指蛋白-DNA复合体模型的方法可以辅助缩小锌指蛋白的筛选范围,提高人工锌指酶设计的成功率.     

O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶研究进展

C⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶是细胞中一种重要的DNA损伤修复酶,它在抵御烷化剂所致的细胞突变和死亡中扮演重要的角色。本文综述近年来关于这个酶的研究进展,内容包括酶及其基因,酶与细胞突变,酶与肿瘤化疗的关系。     

P2-DNA的转染及提纯

P₂-DNA即Phage 2型噬菌体的染色体DNA,是一条线状双股螺旋的DNA分子,分子量为2．2×10⁷Da。有19个碱基的牯性末端．可以连接成环状^[1]．1970年Bertani L.E. 和 Bertani G分离纯化得到P₂噬苗体并对其遗传学及理化特性进行了研究^[2],发现它在DNA复制,溶源性的控制以及基因重组等方面与温和性λ菌体不同;1979年Saint R B 等和Westoo A等先后研究了P₂-DNA的几种限制酶的切割图谱^[3]。P₂-DNA可望成为分子生物学研究的重要工具和实验材料。目前国内尚无这种材料．我们试图将少量的P₂-DNA转染获得P₂噬菌体,加以扩增纯化．抽提得到大量的P₂-DNA。为分子克隆和限制酶的研究提供有实用价值的材料和研究工具。     

酵母质粒的结构、功能及其基因表达 Ⅱ酵母Saccharomyces cerevisiae 7209-1A质粒(pCBy1)全分分子在大肠杆菌中的无性繁殖

本文报道了酵母质粒pCByl~[1]在大畅杆菌中的无性繁殖。Pstl酶解的pCByl和pBR322质粒片段,用T_4-DNA连接酶连接,构建成的重组质粒pCBy3,经酶解、凝胶电泳分析、电子显微镜观察,证明含有pCByl整分子,可供进一步研究这一质粒的结构、功能之用。     

较长单链DNA在质粒DNA中定位插入

一般重组DNA的方法都是用T_4-DNA连接酶把限制性内切酶处理过的外源DNA片段和载体DNA,连接到一起,但这种方法必须要有合适的内切酶切点,因而使得这种方法的灵活应用受到一的定限制。     

3种钝顶螺旋藻株胞内核酸酶活性效果研究

取钝顶螺旋藻A9、抗刀豆氨酸(CS)突变株A9c、藻体长直型 A9L的无菌纯藻藻株胞内核酸酶粗提取液,分别对λ-DNA或p8760进行酶切消化后研究酶活.对于A9藻株,p8760更适于作为酶切底物进行酶活研究;酶切最适反应温度为37～45℃,酶切最适反应时间为3h,50℃开始酶活被抑制;A9c藻株酶切最适反应温度为37℃,酶切最适反应时间为3～4h,45℃开始酶活被抑制;A9L藻株,λ-DNA更适于作为酶切底物进行酶活研究,酶切最适反应温度为37～55℃,酶切最适反应时间为2～3h,60℃开始酶活被抑制.对此3种无菌藻株胞内核酸酶活性效果的初步研究表明,藻株形态的变异或抗氨基酸类似物突变,都会影响和改变其胞内核酸酶的活性,这些可为控制胞内核酸酶对螺旋藻转基因操作的影响和选择合适的藻株用于螺旋藻的遗传转化奠定一定的基础.     

鼻咽癌转移淋巴结中EB病毒相关的DNA多聚酶的分离及其特性研究

一种新的DNA多聚酶已从鼻咽癌(NPC)转移淋巴结胞核酶液,通过DEAE-纤维素柱层析而被部分纯化,并可与细胞的α-及β-DNA多聚酶分开。 此酶有下列特点可与细胞DNA多聚酶区分:(1)可放DEAE-纤维素吸附,需用130mMK_2HPO_4缓冲液方可洗脱下来。(2)可被浓盐所激活,150——200mMKCl或75mM(NH_4)_2SO_4可使它显示最高的酶活性。(3)最适pH为8.0。(4)对磷酰甲酸盐的抑制较敏感。(5)能很好地利用某些合成模板,如poly(dA)·oligo(dT)_(10)及poly(dA)·oligo(dT)_(12-18)。但不能利用poly(rA)·oligo(dT)_(10),证明此酶并非细胞的γ-DNA多聚酶,而与巴基特淋巴瘤的EB病毒相关的(EBV)DNA多聚酶性质十分相似。对照的Raji细胞未见此种EBV-DNA多聚酶。 从鼻咽癌淋巴结中分离出此种EBV-DNA多聚酶,将对EB病毒与NPC的发病关系提供新的证据。     

细胞外诱捕网介导的抗微生物途径

活化中性粒细胞与肥大细胞在细胞外形成纤维样诱捕网结构（ETs）。ETs以染色质-DNA为骨架,吸附有抗微生物肽和抗微生物酶组成,具有捕获与杀灭微生物的作用。由ETs介导的抗微生物途径构成了一种重要的先天免疫应答机制。     

大鼠高重复顺序DNA的核苷酸顺序分析及其与灵长类类α-DNA顺序的比较

 啮齿目动物高重复顺序DNA的结构特征,虽已有人进行过分析,并提出大鼠DNA中有酶切位点分布独特的高重复顺序,也有人认为在Sprague-Dawlay大鼠中有类似于α-DNA大小的高重复顺序,并命名为α型(α-type),是否大鼠中也含有类α顺序,并没有人讨论过。我们对Wistar大鼠高重复顺序DNA进行了分离、纯化、分子克隆及核苷酸序列分析,测定了全序列为370bp,它也是具有酶切点分布独特的高重复顺序,但与前者存在着18％的差异性。我们对此顺序与灵长类类α-DNA进行了比较分析,发现二者在几方面都不存在相似之处,如此序列G-C含量占全部碱基组成的37.3％,而类α顺序的G-C含量约在40％以上,一些酶切位点也与类α-DNA完全不相同,另外在此序列的相应位置上也不具有灵长类类α-DNA的三个“冷点区”等等,由此得出大鼠这一高重复顺序并非类α顺序,而类α顺序只是灵长类动物所特有的。     

SLE血清中抗-DNA抗体分离和性质的研究

本文用国产高分子树脂(T)接枝小牛胸腺DNA,通过亲合层析从系统性红斑狼疮SLE患者血清中纯化出抗-ds DNA抗体和抗-ss DNA抗体。酶联免疫吸附分析(ELISA)的研究表明:SLE抗-DNA抗体和DNA结合的差异性很大,是高度非均一性的。抗-ss DNA抗体不仅组成成分比抗-ds DNA抗体复杂,ss DNA/抗-ssDNA亲合能力也明显高于ds DNA/抗-ds DNA。纯化的抗-DNA抗体以IgG类抗体占主导,同时也有其它类型抗体存在(例如IgM等)。抗-ds DNA抗体有较抗-ss DNA抗体高的IgG含量(两者的IgG/IgM分别是7.0和4.0),说明IgG抗-DNA抗体更倾向于同dsDNA结合。     

条斑紫菜丝状体总RNA提取方法比较

目的:为了获得质量较高的条斑紫菜丝状体总RNA,对几种常用提取方法进行研究。方法:以条斑紫菜自由丝状体为材料,比较了用异硫氰酸胍法、CTAB法、SDS/酚法、TRIzol法、RNAplant法提取的RNA的质量和纯度。结果:异硫氰酸胍法提取RNA的成本低,但纯度不高;CTAB法产率较小,且不能完全去除多糖或蛋白质;SDS/酚法未能获得完整的RNA;TRIzol法未能见到5SrRNA条带,且带有杂带;而RNAplant法提取RNA的质量好、纯度高、提取效率高,其D260nm/D280nm值为1.836,经逆转录得到的双链cDNA扩增产物长度在200bp以上。结论:实验结果表明RNAplant法更适于条斑紫菜丝状体总RNA的提取。     

FISH检测宫颈脱落细胞与宫颈组织中hTERC基因制片方法的研究

目的:探讨FISH实验中用直接涂片法、盐水制片法、TCT制片法、低渗滴片法制片法和宫颈切片组织取材方法对于FISH成功率的影响.方法:收集2008年3月至2009年3月青岛大学医学院附属医院妇科162例宫颈脱落细胞标本及2008年5月至2009年3月手术切除或活检的宫颈组织63例,用荧光原位杂交(FISH)方法检测hTERC基因.结果:直接涂片法、盐水制片法、生理盐水法、TCT制片法和石蜡包埋组织切片法hTERC基因杂交成功率分别为58.3%,65%,55%,87.1%,85.7%,TCT制片高于其它四组;低渗滴片法背景干净度、细胞形态、裸核数量满意度最高;TCT制片法细胞数量满意率最高;石蜡包埋组织切片法荧光信号满意率最高.结论:在检测hTERC基因的宫颈癌筛查中,TCT制片法明显优于其他方法,而在指导宫颈病变及宫颈癌的治疗中,石蜡包埋组织切片法的染色体破坏最小,实际意义更大.     

不同取样方式在稻田节肢动物采集中的效率评估

水稻是我国主要粮食作物,每年都会因虫害造成大量的经济损失,为了挽回害虫造成的损失,必须对害虫进行防治。田间节肢动物群落调查是评价害虫防治效果的重要依据,取样方式对节肢动物群落调查的准确性具有重要的影响。另外,对转基因作物对稻田生物多样性安全性进行评价时,取样方式对多样性评价的准确性也具有重要的影响。本文采用吸虫器法、盆拍法和马氏网诱集法3种取样方式进行稻田节肢动物调查,并评估不同取样方式的采集效率。得到的结果有:1.采集到的节肢动物物种数:马氏网诱集法吸虫器法盆拍法;2.采集的节肢动物数量:盆拍法吸虫器法马氏网诱集法;3.吸虫器取样法在调查叶蝉科、秆蝇科、茧蜂科、姬蜂科、金小蜂科、缘腹细蜂科、蕈蚋科时,取样效率较高;4.盆拍取样法在调查叶蝉科、瘿蚊科、微蛛亚科、跳蛛科、狼蛛科、猫蛛科、弹尾虫目、飞虱科时,取样效率较高;5.马氏网诱集法在调查缟蝇科和毛蠓科时取样效率较高。马氏网诱集法善于采集具有飞行能力的节肢动物;吸虫器法对不同习性的节肢动物采集效果均较高;盆拍法适合采集活动于水稻基部的节肢动物。     

演化极端结合分支分类方法

从生物演化的逆方向考虑,提出一种聚合的分支分类运算方法,称为演化极端结合分支分类法。文章阐明其设计思路、演算步骤,并以实例具体说明其演算过程。最后以演化长度系数、合理解与合理方法等概念,对演化极端结合法进行评价。     

改进的SDS-CTAB法提取濒危植物连香树总DNA

对珍稀濒危植物连香树(Cercidiphyllum japonicum)的6种总DNA提取方法进行了对比试验,结果表明改进的SDS-CTAB法更适合于连香树总DNA提取。该方法提取的DNA经紫外消光值检测,其A260/A280为1.8532,优于CTAB法(1.4872)、SDS法(1.3552)、PVP法(1.5079)、尿素法(1.1858)和高盐低pH法(1.4534)。琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增结果也得出同样的结论。     

深圳地区参考作物蒸散量计算方法适用性分析

根据深圳1998~2007日值气象资料,以4种方法计算参考作物蒸散量,并以FAO Penman-Monteith公式计算结果为标准,评价其他各公式在深圳的适用性。结果表明:Irmark-Allen公式的月平均参考作物蒸散量及年参考作物蒸散量与Penman-Monteith公式结果没有显著差异,与Hargreaves公式和Pristley-Taylor公式计算结果差异显著,Hargreaves最大,Pristley-Taylor最小;Irmark-Allen公式、Pristley-Taylor公式与Penman-Monteith公式的相关性较高,而Hargreaves相关性较低。Irmark-Allen法可作为深圳地区缺少相关气象资料条件下计算ET0较理想的替代方法。     

The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees

A new method called the neighbor-joining method is proposed for reconstructing phylogenetic trees from evolutionary distance data. The principle of this method is to find pairs of operational taxonomic units (OTUs [= neighbors]) that minimize the total branch length at each stage of clustering of OTUs starting with a starlike tree. The branch lengths as well as the topology of a parsimonious tree can quickly be obtained by using this method. Using computer simulation, we studied the efficiency of this method in obtaining the correct unrooted tree in comparison with that of five other tree-making methods: the unweighted pair group method of analysis, Farris's method, Sattath and Tversky's method, Li's method, and Tateno et al.'s modified Farris method. The new, neighbor-joining method and Sattath and Tversky's method are shown to be generally better than the other methods.      

A new semiparametric estimation method for accelerated hazard model

The accelerated hazard model has been proposed for more than a decade. However, its application is still very limited, partly due to the complexity of the existing semiparametric estimation method. We propose a new semiparametric estimation method based on a kernel-smoothed approximation to the limit of a profile likelihood function of the model. The method leads to smooth estimating equations and is easy to use. The estimates from the method are proved to be consistent and asymptotically normal. Our numerical study shows that the new method is more efficient than the existing method. The proposed method is employed to reanalyze the data from a brain tumor treatment study.     

用气相色谱-质谱联用比较牛耳草代谢物的提取方法

通过比较不同的提取方法对牛耳草新鲜和脱水叶片中代谢物的提取效率,旨在建立一种可以有效鉴定并分析牛耳草脱水过程中关键小分子代谢物的种类和含量变化的方法,为研究植物耐脱水分子机制提供技术方法。本研究以气相色谱-质谱联用(GC-MS)为分析方法,对复苏植物牛耳草代谢物提取方法进行比较。从提取总色谱峰数目、提取效率、代谢物保留时间和提取效率稳定性等方面比较甲醇溶液(A法)和甲醇-氯仿-水溶液(B法)两种提取方法的提取效果。对牛耳草新鲜样品提取结果表明,B法提取的总色谱峰数目多于A法;对9种共有代谢物的提取效率比较结果表明,B法的提取效率高于A法;对10种色谱峰的保留时间和提取效率的方法学考察结果表明,两者保留时间RSD(相对标准偏差)值均小于1%,A法提取效率的RSD值≤10%的比例为50%,B法的为100%。A法对干样的提取色谱峰数目远少于鲜样,而B法对干样的提取色谱峰数目和鲜样没有显著差异,保留时间RSD值均小于1%,提取效率的RSD值与鲜样没有差异,稳定性良好。     

粪便中大肠埃希菌分离方法的筛选

比较了滤膜法、涂布法和纸片法对粪便中大肠埃希菌的分离效果。通过对分离粪便大肠埃希菌的数量可知,纸片法与m—TEC培养基上滤膜法分离的大肠埃希菌数量结果基本一致。m—TEC培养基滤膜法分离的大肠埃希菌平均数量分别是伊红美蓝培养基涂布法分离大肠埃希菌平均数量的1．4倍、伊红美蓝培养基滤膜法分离大肠埃希菌平均数量的2．8倍、m—TEC培养基涂布法分离大肠埃希菌平均数量的2．25倍。分离粪便样品中大肠埃希菌选择滤膜法用m—TEC培齐基进行分离为最佳分离方法。