利用ZFN敲除转基因猪细胞中多拷贝EGFP基因

锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)是由特异性识别DNA的锌指结构域和Fok I切割结构域组成,能够在基因组特定位点上切割DNA,引起DNA双链断裂(double-strand break,DSB).通过DSB修复机制,可以使基因修饰的效率比传统方法提高102~104倍.目前,利用ZFN对动物内源基因进行敲除的研究较多,但对转基因动物中外源多拷贝基因进行敲除的报道较少.本研究首先利用荧光定量PCR法对本实验室培育的两头转基因猪中增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的拷贝数进行鉴定,发现其拷贝数分别为11.95和17.36拷贝;然后将靶向EGFP的一对ZFN转染进拷贝数为17.36的EGFP转基因猪的成纤维细胞中,并通过流式和CEL-1酶切方法检测敲除效率.结果表明,转染400 ng、800 ng和1 200 ng ZFN的切割效率分别为0.97%、1.39%和1.76%,可见随着转染ZFN剂量的增加,ZFN的切割效率逐渐提高.但是,不发绿色荧光的细胞比例却没有明显提高,因此认为,ZFN敲除转基因动物中多拷贝基因的效率还是比较低.     

编辑MSTN半胱氨酸节基元促进两广小花猪肌肉生长

肌生长抑制素(myostatin,MSTN)是转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族成员之一,是一种肌肉生长抑制因子。解除MSTN的生长抑制功能是提高畜禽肌肉产量的一种有效途径。TGF-β的半胱氨酸节结构基元(cystine knot motif)能够稳定MSTN蛋白结构,对MSTN生物学功能的发挥具有重要调控作用。本研究应用CRISRP/Cas9基因编辑技术在两广小花猪肾细胞(Liang Guang small spotted pig kidney cells,LPKCs)中对MSTN基因外显子3进行编辑,破坏了其半胱氨酸节基元,以解除MSTN对靶基因的抑制功能。将流式分选获得的混合阳性MSTN编辑LPKCs作为供体细胞进行核移植和胚胎移植,获得8头MSTN基因编辑两广小花猪仔猪,其中2头存活至10日龄,经鉴定这2头均为基因编辑杂合子,它们在构成MSNT蛋白半胱氨酸节基元的两个半胱氨残基C106和C108编码序列附近分别发生碱基的缺失与替换,导致移码突变,使C106和C108突变为其他氨基酸。MSTN基因编辑两广小花猪杂合子肩部和臀部肌肉较为发达。H&E切片分析显示,MSTN基因编辑猪肌纤维横截面积显著减少,肌纤维数量显著增多。Western Blot分析结果显示,C106和C108缺失对MSTN蛋白表达无显著性影响,但显著促进其靶基因Myf5、MyoD和Myogenin等成肌相关因子的表达。本研究获得的基因编辑猪模型没有造成MSTN表达完全缺失,可保留MSTN其他生物学功能,在促进两广小花猪肌肉生长的同时还消除了MSTN完全缺失可能对小花猪造成的潜在影响。     

利用CRISPR/Cas9系统构建人HPRT1基因定点突变细胞株

Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase1 (HPRT1)基因突变会导致次黄嘌呤和鸟嘌呤代谢异常,严重的代谢障碍被称为Lesch-Nyhan综合征,表现为智力低下,行为上出现强迫性自我毁伤,并伴随痛风或肾结石等症状。HPRT1基因具有多种突变模式,近年来对其突变谱的研究表明该基因具有一些"突变热点"。本研究选取了导致翻译提前终止的热点突变c.508CT突变和c.151CT突变,在HEK293T和HeLa细胞中,以单链寡核苷酸(single-stranded oligo-deoxyribonucleotides, ssODN)作为同源重组模板,利用CRISPR/Cas9技术构建了这两种突变的单克隆细胞株,发生定点突变的效率分别为16.3%和10%。进一步通过Westernblot检测点突变的单克隆细胞的HPRT1蛋白表达水平,通过6-TG毒性实验检测点突变的单克隆细胞的次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性,结果表明纯合突变的单细胞克隆不能正常表达HPRT1蛋白,其次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性丧失;杂合突变的单细胞克隆的HPRT1蛋白表达量降低,仍具有部分次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性。HPRT1基因定点突变细胞模型的建立可为今后建立其他HPRT1基因突变的细胞系或动物模型提供借鉴,为研究Lesch-Nyhan致病机制提供基础。     

一种适用于生产转染色体动物的微细胞制备方法

微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)是一项将外源染色体转入哺乳动物细胞的技术,具有广阔的应用前景.与体细胞核移植技术结合,MMCT可用于生产具有重要医学药用价值和优良农业生产性状的转染色体动物.制备高质量的微细胞是关系MMCT技术成功的关键步骤之一.通过荧光染色和吉姆萨染色分析,结果表明,A9(neo12)细胞经0.2mg/L秋水仙素酰胺处理48h后,89%的细胞产生微核化,每个细胞平均形成10个微核.微核化的细胞在含有20mg/L细胞松弛B的Percoll密度梯度介质中,经39000g高速离心后,包含微细胞、完整细胞、细胞核和细胞碎片的混合液,依次通过8μm和5μm孔径的滤膜过滤后可获得纯化的微细胞溶液.通过光学显微镜和吉姆萨染色观察,可见微细胞为一群直径约为3～5μm的类细胞核的球形物质.微细胞PCR技术首次用于检测微细胞溶液的质量,检测结果显示,所制备的溶液中均匀分布着带有目的染色体的微细胞,适用于进一步作转染色体动物实验.     

利用ZFN删除转基因猪细胞中的多拷贝EGFP基因

锌指核酸酶（zinc finger nuclease, ZFN）是由特异性识别DNA的锌指结构域和Fok I切割结构域组成,能够在基因组特定位点上切割DNA,引起DNA双链断裂（double-strand break, DSB）. 通过DSB修复机制,可以使基因修饰的效率比传统方法提高102～104倍．目前,利用ZFN对动物内源基因进行敲除的研究较多,但对转基因动物中外源多拷贝基因进行敲除的报道较少．本研究首先利用荧光定量PCR法对本实验室培育的两头转基因猪中增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）基因的拷贝数进行鉴定,发现其拷贝数分别为11.95和17.36拷贝;然后将靶向EGFP的一对ZFN转染进拷贝数为1736的EGFP转基因猪的成纤维细胞中,并通过流式和CEL-1酶切方法检测敲除效率. 结果表明,转染400 ng、800 ng和1 200 ng ZFN的切割效率分别为0.97%、1.39%和1.76%,可见随着转染ZFN剂量的增加,ZFN的切割效率逐渐提高．但是,不发绿色荧光的细胞比例却没有明显提高,因此认为,ZFN敲除转基因动物中多拷贝基因的效率还是比较低．     

哺乳动物非经典分泌信号肽介导重组EGFP蛋白向毕赤酵母细胞壁转运

为探索哺乳动物非经典分泌信号肽在毕赤酵母表达系统中引导重组蛋白分泌的作用,本研究将一段来源于小鼠同源异型框蛋白(En2)的分泌信号序列(SS)融合至EGFP蛋白的N端,在毕赤酵母中表达。实验结果显示SS信号肽能通过一种不同于经典的内质网-高尔基体分泌通路的方式将EGFP蛋白分泌至细胞膜表面,与α交配因子前导肽相比,显著降低了细胞的内质网压力。本研究提示哺乳动物非经典分泌信号肽可作为递送重组蛋白至酵母膜表面的一项工具。     

应用SSA报告载体提高ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率

IGF2(Insulin-like growth factor 2)基因作为最复杂多样的生长因子之一,对猪胎儿发育以及出生后生长发育和肌肉生成起着非常重要的作用。通过基因组编辑技术对我国本地猪种的IGF2基因作精确的遗传修饰,对于提高本地猪种的瘦肉率具有重要的育种意义。文章在蓝塘猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblasts,PEF)中检测了锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)和CRISPR/Cas9对IGF2基因的打靶效率,结果表明CRISPR/Cas9对IGF2基因的切割效率最高可达9.2%,显著高于ZFN的切割效率(1%),但两者均未达到作为体细胞核移植(Somatic nuclear transfer,SCNT)供体细胞所需的打靶效率。应用SSA(Single-strand annealing)报告载体筛选技术来富集IGF2基因被ZFN和CRISPR/Cas9修饰过的PEF细胞,结果表明,该技术可使CRISPR/Cas9的打靶效率提高5倍左右,对ZFN的打靶效率具有更大的增强作用。     

基于FoldX力场的蛋白突变建模方法可用于人工锌指酶辅助设计

锌指酶是一种可对动植物基因组内特异序列进行高效遗传修饰的人工重组核酸酶.目前,获取一对有活性的人工锌指酶的常规方法是通过构建大量的锌指蛋白突变体,利用细菌杂交方法从中筛选有结合活性的个体,工作量庞大、专业性强,普通研究人员往往难以胜任,极大地限制了锌指酶技术的广泛应用.因此,采用计算机辅助人工锌指酶设计的方法降低筛选难度和工作量显得十分有必要.本研究选用FoldX分子力场软件对国际锌指酶协会研究人员采用OPEN方法构建的共420个锌指蛋白突变体进行蛋白-DNA复合体建模,并计算模型中锌指蛋白与靶标DNA的结合自由能.经统计分析发现,模拟复合体中的锌指蛋白-DNA结合自由能与该锌指蛋白在哺乳动物细胞内形成无活性锌指酶的概率存在明显相关关系.当结合自由能低于？13.132kcal/mol时形成无活性锌指酶的概率可降低至5%以下,而当结合自由能大于？5kcal/mol时形成无活性锌指酶的概率高达40%.因此,采用FoldX构建锌指蛋白-DNA复合体模型的方法可以辅助缩小锌指蛋白的筛选范围,提高人工锌指酶设计的成功率.