二斑叶螨不同抗性品系最佳内参基因的筛选及CYP392E亚家族基因的表达分析

【目的】 筛选二斑叶螨Tetranychus urticae敏感品系（SS）、 抗阿维菌素品系(Av-R)和抗螺虫乙酯品系（Sp-R）中合适的内参基因, 研究二斑叶螨不同抗性品系CYP392E亚家族基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR （quantitative real time PCR, qRT-PCR）技术, 对二斑叶螨α-tubulin, β-actin, ELFn, GAPDH, 5.8S rRNA基因和SDHA共6个看家基因的表达稳定性进行分析以期筛选出合适的内参基因, 并在此基础上进一步分析二斑叶螨不同品系P450酶系CYP392E亚家族基因的表达量差异。【结果】在二斑叶螨SS, Av-R和Sp-R品系中稳定性最高的内参基因为ELFn。以ELFn为内参基因, CYP392E7基因相对表达量在二斑叶螨Av-R品系中显著高于SS品系(P<0.05), 为后者的2.18倍, 而在Sp-R品系和SS品系中差异不显著; 其余基因的相对表达量在2个抗性品系中均没有增加, Av-R品系的CYP392E4, CYP392E9和CYP392E10基因以及Sp-R品系的CYP392E1和CYP392E9基因相对表达量甚至显著下调, 分别为SS品系的48%, 74%, 65%, 63%和73%。【结论】在二斑叶螨SS, Av-R和Sp-R品系中ELFn为理想的内参基因, Av-R品系CYP392E4, CYP392E7, CYP392E9和CYP392E10基因相对表达量的显著变化可能与二斑叶螨对阿维菌素的抗性形成有关, Sp-R品系CYP392E1和CYP392E9基因也可能与二斑叶螨对螺虫乙酯的抗性形成有一定联系。     

二斑叶螨抗螺螨酯品系GST基因的克隆与表达分析

【目的】揭示二斑叶螨Tetranychus urticae对螺螨酯的分子抗性机理。【方法】利用RT-PCR克隆了二斑叶螨的谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase, GST)基因 cDNA 全长序列, 采用生物信息学软件分析了克隆基因的编码蛋白特性; 利用实时荧光定量PCR 方法分析GST基因在二斑叶螨的螺螨酯抗性与敏感品系中的表达差异。【结果】克隆获得的谷胱甘肽-S-转移酶2个基因分别被命名为TuGSTd1和TuGSTd2 (GenBank登录号分别为： KC445659和KC445660)。序列分析发现, TuGSTd1的开放阅读框长度为648 bp, 编码215个氨基酸, 分子量约为24.47 kDa, 理论等电点为5.49; TuGSTd2的开放阅读框为648 bp, 编码215个氨基酸, 分子量约为24.57 kDa, 理论等电点为6.33。系统发育分析表明这两个基因与桔全爪螨Panonychus citri Delta家族的GST基因的氨基酸序列一致性为93%。实时荧光定量PCR 结果表明, TuGSTd1和TuGSTd2在二斑叶螨抗螺螨酯品系中的相对表达量分别为敏感品系的5.60和3.75 倍。【结论】 GST基因在二斑叶螨抗螺螨酯品系中的相对表达量均显著高于敏感品系, 据此推测GST基因的过量表达可能与其对螺螨酯的抗性形成有关。     

Bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR 内参基因的筛选

【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella (L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA (18S rRNA)、 肌动蛋白（ACTB）、 延伸因子（EF1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、 核糖体蛋白L32 (RPL32)、 核糖体蛋白S13 （RPS13）、 核糖体蛋白S20 （RPS20）和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因, 以geNorm、 Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在Bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2（aminopeptidase N2, APN2）基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因, NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析Bt毒素诱导后的小菜蛾Bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时, 新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性, 二者作为标准化因子, ANP2表达量结果基本一致, 而使用18S rRNA作为内参基因, 却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因, 对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础, 也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。     

烟粉虱不同发育阶段解毒代谢酶基因的特异性表达

【目的】基于烟粉虱Bemisia tabaci转录组数据,系统分析了烟粉虱解毒代谢酶基因在噻虫嗪抗性品系中的表达模式,探讨了这些基因在烟粉虱不同发育阶段差异表达的生物学意义。【方法】分别收集室内长期饲养的烟粉虱噻虫嗪抗性和敏感品系的卵、4龄若虫和刚羽化1 d的雌成虫,在烟粉虱转录组数据库中挑选8 394条解毒代谢相关基因设计探针,通过探针杂交,得到烟粉虱噻虫嗪抗性品系表达谱芯片,比较了这些基因在抗性烟粉虱3个不同发育阶段的表达情况。并随机挑选了9个基因,在抗感品系间3个不同发育阶段进行了荧光定量PCR验证。【结果】在抗性烟粉虱的卵和4龄若虫发育阶段,共有3 424个差异表达基因,其中489个是编码3类解毒代谢酶(羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和细胞色素P450多功能氧化酶)的基因;有14个基因在4龄若虫发育阶段过量表达,其中10个为P450基因,4个为GST家族基因。在抗性烟粉虱的4龄若虫和雌成虫发育阶段,总共有1 273个差异表达基因,193个为3类解毒代谢酶家族的基因,其中有9个P450家族基因在雌成虫期的表达量超过4龄若虫期的10倍。此外,表达谱芯片分析还筛选到了一些候选抗性基因。qRT-PCR验证显示在这些候选基因中,与敏感品系相比,9个基因在抗性烟粉虱的3个不同发育阶段表达上调,其中GST基因家族的p_06027和P450基因p_06013在抗性品系的卵和4龄若虫中过量表达;p_05885和p_07806和编码CYP6家族蛋白的p_00988在抗性品系的4龄若虫期的表达量上调;p_05916和p_00478在抗性品系卵和4龄若虫期表达量很低,而在成虫期过量表达;而p_00059和p_00428在抗性品系雌成虫发育阶段表达量显著上调,其中编码CYP4C1的p_00059的差异表达倍数在雌成虫期约为15.15倍。【结论】表达谱芯片分析结果提示,CYP6和CYP4C1基因的过量表达可能会是烟粉虱抗性产生的机制之一。解毒代谢酶基因在烟粉虱不同发育阶段的特异性表达,可能与其在抵御杀虫剂胁迫时体内能量的分布及有效利用率有关,也可能是害虫在环境选择压下的一种适应机制。     

土耳其斯坦叶螨多重抗性品系选育及解毒酶活性的变化

为探索土耳其斯坦叶螨的多重抗药性及其生化机理,在室内对敏感系(SS)土耳其斯坦叶螨分别用螺螨酯、甲氰菊酯和阿维菌素的混剂进行处理,选育出多重抗性品系(Mp-R).结果表明: 选育至15代,土耳其斯坦叶螨的抗性指数达35.74倍.对不同品系的解毒酶活性分析显示,Mp-R品系相对SS品系的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)的比活力分别是SS品系的1.21、1.53、9.18倍.说明CarE、GSTs、MFO的活性升高可促进土耳其斯坦叶螨对3种杀虫剂多重抗性的形成;MFO的活性升高可能是土耳其斯坦叶螨对3种杀虫剂产生多重抗性的主要原因.测定Mp-R品系和单抗品系(Ip-R)的农药感性和解毒酶活力变化发现,3种杀虫剂的混合使用可能会延缓土耳其斯坦叶螨对甲氰菊酯的抗性形成,加快对阿维菌素的抗性形成.     

二斑叶螨田间种群对阿维菌素的抗性及抗性相关基因表达分析

【目的】二斑叶螨Tetranychus urticae Koch是为害多种农作物的世界性重大害螨。本研究旨在明确二斑叶螨不同田间种群对阿维菌素的抗药性、抗性相关基因的突变频率及其表达量变化。【方法】采用药管浸叶法测定了我国二斑叶螨8个地理种群对阿维菌素的抗药性并检测其抗性基因突变频率,结合荧光定量PCR技术分析了高抗种群中抗性相关基因表达量变化。【结果】测试的二斑叶螨8个田间种群均对阿维菌素具有抗药性。北京密云、山东潍坊、海南三亚和湖南长沙种群均对阿维菌素产生了极高水平的抗性,抗性倍数分别为1 526.75,481.00,315.25和160.75倍,而北京通县、北京海淀、山西运城和山东泰安种群对阿维菌素的抗性倍数达54.38~136.38倍,处于高抗性水平。二斑叶螨对阿维菌素抗性相关的谷氨酸氯离子通道基因Glu Cl的突变频率在各个田间种群中存在差异。北京密云种群中Glu Cl的突变频率最高(91.7%),其次是山东潍坊(66.7%)和海南三亚(63.3%)种群;山西运城种群最低(13.3%),且点突变频率与抗性倍数之间呈显著的正相关(P0.05)。与相对敏感种群相比,高抗性二斑叶螨种群中Glu Cl和γ-氨基丁酸受体基因GABAR表达量显著下降。【结论】二斑叶螨田间种群普遍对阿维菌素产生了高水平抗性,抗性相关基因Glu Cl的点突变及其表达量的降低可能与田间抗药性产生相关;田间防治二斑叶螨应避免使用阿维菌素。     

麦长管蚜miRNA实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选特定条件下麦长管蚜Sitobion avenae稳定表达的微小RNA(miRNA)表达分析内参基因。【方法】根据麦长管蚜miRNA Illumina测序结果筛选出miR-10-3p, miR-993, miR-276, miR-275, miR-252a, miR-1, miR-375, pc-15, pc-73和1个常用内参基因U6共10个候选内参基因。利用qRT-PCR测定10个候选内参基因在麦长管蚜有翅蚜和无翅蚜不同发育时期、不同组织以及4种化学药剂(95.1%吡虫啉原药、97.8%噻虫啉原药、95%阿维菌素原药和40%氧乐果乳油)处理无翅蚜中的相对表达量。利用GeNorm, NormFinder, ΔCt法, BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价。【结果】qRT-PCR结果表明,在麦长管蚜有翅蚜不同发育阶段、无翅蚜不同发育阶段、有翅蚜和无翅蚜不同组织中和4种药剂处理的无翅蚜中表达量较高的内参基因分别是miR-276, miR-276, miR-10-3p和miR-10-3p;5种方法综合分析得出,在上述4种条件下表达稳定性都较好的内参基因分别是miR-252a, miR-993, miR-275和miR-993。GeNorm软件分析表明不同条件下麦长管蚜内参基因的较佳数目为2,结合RefFinder稳定性综合排序的结果分析可知在有翅蚜不同发育阶段、无翅蚜不同发育阶段、有翅蚜和无翅蚜不同组织中和不同药剂处理无翅蚜中稳定表达的内参基因组合分别是miR-252a和miR-276, miR-993和miR-276, miR-275和miR-10-3p, miR-993和miR-10-3p。【结论】麦长管蚜有翅蚜不同发育阶段、无翅蚜不同发育阶段、有翅蚜和无翅蚜不同组织中和不同药剂处理无翅蚜中内参基因优化组合分别为miR-252a和miR-276, miR-993和miR-276, miR-275和miR-10-3p, miR-993和miR-10-3p。研究结果为麦长管蚜miRNA基因定量表达的研究提供了内参基因选择的依据。     

橘全爪螨对双甲脒的抗性选育及其P450基因的表达差异分析

为了对双甲脒进行抗性风险评估, 弄清P450基因在橘全爪螨Panonychus citri抗药性中的作用, 在室内用双甲脒对橘全爪螨进行了抗性选育和交互抗性研究, 同时分析了橘全爪螨双甲脒抗性和敏感品系P450基因表达差异。经过12代抗性选育, 获得了橘全爪螨双甲脒抗性品系, 与敏感品系比较, 橘全爪螨对双甲脒的抗性倍数达到26.32倍。抗性风险评估表明, 橘全爪螨对双甲脒抗性遗传力h²为0.148。螺螨酯、 丁醚脲、 炔螨特和三唑锡对抗性品系的LC₅₀分别为敏感品系的16.85, 4.98, 2.13和2.05倍, 表明双甲脒抗性品系对螺螨酯、 丁醚脲、 炔螨特和三唑锡具有明显的交互抗性。阿维菌素、 苯丁锡、 哒螨灵、 矿物油对抗性品系LC₅₀分别为敏感品系的1.10, 1.21, 0.67和0.99倍, 表明双甲脒抗性品系对上述4种药剂没有显著的交互抗性。基因差异性分析发现, 抗性品系中有16条P450基因发生了上调, 27条P450基因发生了下调, 其中CYP389A6上调倍数最高［log₂ratio (RS/SS)=11.526］, CYP389A2下调倍数最高［log2ratio(RS/SS) =-12.683］, 由此推断, CYP389A6上调和CYP389A2下调可能是橘全爪螨对双甲脒产生抗性的重要原因。     

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的...     

朱红毛斑蛾实时荧光定量PCR内参基因的筛选

筛选朱红毛斑蛾Phauda flammans(Walker)在不同成虫组织、性别及发育阶段处理条件下稳定表达的内参基因,为进一步开展朱红毛斑蛾相关基因的定量研究提供参考.本研究以不同成虫组织(头、胸、腹、足、翅和触角)、不同成虫性别和不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)为实验材料,对10个候选内参基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR),并使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件及RefFinder网站对候选内参基因的表达稳定性进行评价和综合分析.结果表明:在朱红毛斑蛾不同成虫组织基因定量研究中,TUB2＞GAPDH＞TUBJ＞AK＞EFlα＞ACTIN3＞TBP＞TUB3＞ACTIN2＞RPL32,建议以TUB2和GAPDH作为内参基因;在不同成虫性别基因定量研究中,TUB1＞EFlα＞ACTIN3＞RPL32＞ACTIN2＞TUB2＞AK＞GAPDH＞TUB3＞TBP,建议以 TUB1 和EFlα作为内参基因;在不同发育阶段基因定量研究中,ACTIN3＞TBP＞TUB1＞EFlα＞TUB3＞ACTIN2＞GAPDH＞RPL32＞TUB2＞AK,建议以ACTIN3和TBP作为内参基因.基于GeNorm分析,最佳内参基因使用数目为2个.     

斑地锦RT-qPCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata)合适的RT-qPCR内参基因,该文利用同源克隆法克隆斑地锦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段,RT-qPCR检测7个候选内参基因在斑地锦不同生长期根、茎、叶和果实中的表达情况,并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物学软件对各候选基因表达稳定性进行评价。结果表明:(1)克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段为729、808、753、422、233、656、313 bp,分别编码242、269、250、140、77、218、103个氨基酸,与其他植物相应氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。(2)综合3个分析软件分析内参基因表达稳定性得出,表达稳定性排名为UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此,可以选取UBQ作为斑地锦RT-qPCR分析的内参基因,用于不同生长期基因组织特异性表达研究。     

牧草盲蝽实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出适合牧草盲蝽Lygus pratensis在不同条件下稳定表达的内参基因。【方法】选取编码牧草盲蝽α-微管蛋白、β-微管蛋白、肌动蛋白、延伸因子、琥珀酸脱氢酶复合体A、泛素、转录起始因子TFIID亚基、谷胱甘肽S-转移酶、核糖体蛋白L32及TATA盒结合蛋白的10条基因为候选内参基因,采用qRT-PCR技术测定其在牧草盲蝽不同性别成虫、成虫不同组织、不同龄期、对功夫菊酯不同抗性成虫、不同温度及不同杀虫剂分别处理后的成虫共6类样品中的表达量;采用BestKeeper, geNorm, NormFinder及RefFinder 4种计算程序对各候选基因的表达稳定性进行评价。【结果】依据获得的有效qRT-PCR数据前提,利用不同计算方法综合分析得出：在牧草盲蝽成虫不同组织中和对功夫菊酯不同抗性成虫中最稳定表达的内参基因均为RPL32;不同温度处理、不同性别成虫中、不同杀虫剂处理和不同龄期牧草盲蝽中最稳定表达的内参基因分别为UBQ, SDHA, β-tubulin和TAF。通过geNorm软件判断配对变异数确定的内参基因最佳数目,结合RefFinder对基因表达稳定性综合排序的结果可得：牧草盲蝽不同成虫组织中、不同性别成虫中、不同龄期、对功夫菊酯不同抗性成虫中、不同温度及杀虫剂分别处理的成虫等各组的最优内参基因组合分别为RPL32+TAF, SDHA+GST, TAF+GST+UBQ, RPL32+GST, UBQ+ACT+β-tubulin和β-tubulin+TAF+RPL32。【结论】本研究获得的牧草盲蝽在不同条件下表达最稳定及最适内参基因组合,都可用于后续的基因定量表达研究。     

Selection of reference genes for gene expression studies in rats

Selection of the most stable reference gene is critical for a reliable interpretation of gene expression data using RT-PCR. In order so, 17 commonly used genes were analyzed in Wistar rat duodenum, jejunum, ileum and liver following a fat gavage and at two time periods. These reference genes were also tested in liver from Zucker (fa/fa) on a long-term dietary trial. Four strategies were used to select the most suitable reference gene for each tissue: ranking according to biological coefficient of variation and further validation by statistical comparison among groups, geNorm, NormFinder and BestKeeper programs. No agreement was observed among these approaches for a particular gene, nor a common gene for all tissues. Furthermore we demonstrated that normalising using an inadequate reference conveyed into false negative and positive results. The selection of genes provided by BestKeeper resulted in more reliable results than the other statistical packages. According to this program, Tbp, Ubc, Hprt and Rn18s were the best reference genes for duodenum, jejunum, ileum and liver, respectively following a fat gavage in Wistar rats and Rn18s for liver in another rat strain on a long-term dietary intervention. Therefore, BestKeeper is highly recommendable to select the most stable gene to be used as internal standard and the selection of a specific reference expression gene requires a validation for each tissue and experimental design.     

褐飞虱热胁迫下内参基因的筛选及热激蛋白基因表达分析（英文）

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)是为害水稻的重要害虫之一,温度是影响其暴发、迁飞的主要环境因子之一。本研究旨在探讨研究褐飞虱对高温胁迫适应性的热激蛋白基因表达调控模式。【方法】分别以不同的高温(30℃~40℃)处理褐飞虱雌、雄虫1 h和2 h,利用荧光定量PCR技术检测其体内的β-actin 1,β-actin2,β-actin3,28S rRNA,18S rRNA和α-2-tubulin 6个内参基因的表达量,用geN orm和BestK eeper软件分析确定最稳定表达的内参基因,并检测热胁迫后hsp70和hsp90基因在处理褐飞虱成虫体内的表达模式。【结果】geN orm软件分析结果表明,热胁迫后褐飞虱内参基因稳定性在雌虫体内为:β-actin1=β-actin328S rRNAα-2-tubulin18S rRNAβ-actin2;在雄虫体内为:β-actin1=β-actin3α-2-tubulin28S rRNA18S rRNAβ-actin2。BestK eeper软件分析结果显示,在热胁迫的雌、雄虫体内β-actin1均最稳定,18S rRNA次之,β-actin2最不稳定。两种软件分析结果基本一致。以β-actin1为校正内参基因,荧光定量PCR分析hsp70和hsp90在不同热胁迫条件下的表达模式,结果表明,各高温处理下hsp70表达量与对照26℃下的表达量没有显著性差异;而hsp90基因表达模式表现为被高温诱导上调表达,在雌、雄虫体内表达量达到最高的处理条件分别为40℃和38℃处理2 h。【结论】β-actin1基因可以作为热胁迫下褐飞虱雌雄虫体内基因表达模式分析的校正内参基因使用。褐飞虱hsp90基因能被高温诱导表达,该基因可能在褐飞虱适应热胁迫过程中起着重要的作用。     

柑橘大实蝇内参基因的评估

【目的】柑橘大实蝇Bactrocera minax (Enderlein)是一种危害严重的柑橘害虫。本研究旨在筛选柑橘大实蝇在特定条件下体内稳定表达的内参基因, 以确保使用实时荧光定量PCR分析目标基因表达的可靠性。【方法】选择10种候选内参基因用于进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）, 利用5种软件对柑橘大实蝇在不同虫态下（低龄幼虫、3龄幼虫、1日龄蛹、80日龄蛹、160日龄蛹、雄成虫、雌成虫）以及成虫不同部位（成虫头、胸、腹、整体）中候选内参基因的Ct值进行分析, 明确其表达的稳定性。【结果】在柑橘大实蝇不同虫态和成虫不同部位, 10种候选内参基因的Ct值都处于15~30之间, 各基因Ct值的不同表明各基因的表达量存在差异。 综合分析各种软件对内参基因稳定性的排名, 结合geNorm软件对最佳内参基因数量的分析结果, 推荐在不同虫态下采用UBQ, GAPDH和GST作为内参基因, 在不同成虫部位中采用TUB, GAPDH和GST作为内参基因。【结论】为了获取可信的目标基因表达分析结果, 建议根据不同条件选择使用不同的内参基因组合。本研究结果有利于进一步研究柑橘大实蝇在特定条件下的目标基因表达。