桃蛀螟气味结合蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的基因克隆、原核表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在明确气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)在桃蛀螟Conogethespunctiferalis化学感受过程中的生理功能,为以OBPs蛋白为防治靶标的桃蛀螟绿色防控提供理论依据。【方法】基于前期桃蛀螟触角转录组测序数据,利用PCR技术从桃蛀螟触角中获得桃蛀螟气味结合蛋白基因CpunOBP3和CpunOBP4的cDNA序列,采用生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列;构建重组表达载体pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4,原核表达并纯化获得重组目的蛋白CpunOBP3和CpunOBP4;最后利用荧光竞争结合实验测定了重组蛋白CpunOBP3和CpunOBP4对24种配体的结合能力。【结果】克隆获得桃蛀螟气味结合蛋白基因CpunOBP3(GenBank登录号: GEDO010000010.1),开放阅读框全长387 bp,编码128个氨基酸,预测分子量大小为14.72 kD;CpunOBP4(GenBank登录号: GEDO010000011.1)开放阅读框全长438 bp,编码145个氨基酸,去除信号肽的CpunOBP4蛋白预测分子量大小为12.82 kD。CpunOBP3和CpunOBP4均具有OBPs的典型特征,即含有6个保守的半胱氨酸残基。CpunOBP3和CpunOBP4重组蛋白均以包涵体形式存在。荧光竞争结合实验发现,CpunOBP3重组蛋白能与测试的7种植物挥发物有效结合,尤其与3-蒈烯的结合能力最强,解离常数K_i值为10.33 μmol/L,但不能与测试的2种桃蛀螟性信息素有效结合;而CpunOBP4重组蛋白既可以与测试的2种性信息素(顺-10-十六碳烯醛和十六醛)结合(解离常数K_i值分别为14.65 μmol/L和7.83 μmol/L),又可以与测试的8种植物挥发物有效结合,尤其与丁酸乙酯的结合能力最强,解离常数K_i值为4.32 μmol/L。【结论】根据这些结果,我们推测CpunOBP3主要在桃蛀螟寄主定位与寄主转移过程中发挥重要作用,而CpunOBP4在桃蛀螟识别性信息素和寄主植物挥发物过程中发挥双重作用。研究结果为利用干扰桃蛀螟嗅觉感受从而调控其发生与危害提供了理论依据。     

梨小食心虫气味结合蛋白GmolOBP3的cDNA克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】为了更好地了解昆虫气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在梨小食心虫Grapholita molesta（Busck）嗅觉识别中的作用,并明确其与寄主挥发物的结合特性。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆梨小食心虫OBP基因;采用RT-PCR和实时定量PCR对该基因在成虫不同组织和羽化后不同日龄成虫中的表达情况进行了测定;以N-phenyl-1-naphthylamine（1-NPN）为荧光探针,采用荧光竞争结合试验对GmolOBP3蛋白的结合特性进行了分析。【结果】得到梨小食心虫一个新的气味结合蛋白基因,命名为GmolOBP3（GenBank登录号：KF395363）。GmolOBP3开放阅读框全长492 bp,编码163个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为18.72 kDa和4.93,呈酸性,具有典型的6个半胱氨酸位点。GmolOBP3在雌、雄成虫触角和腹部均有表达,成虫在羽化后5 d内,雌蛾触角中GmolOBP3表达量随羽化后日龄而增加,但雄蛾在羽化后第5天触角中 GmolOBP3表达量显著降低。通过构建GmolOBP3原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达并获得了GmolOBP3重组蛋白。荧光竞争结合实验对GmolOBP3蛋白与16种寄主挥发物及4种性信息素类似物的结合力发现,在供试的4种梨小食心虫性信息素类似物中,GmolOBP3蛋白与反-8-十二碳烯醋酸酯和十二烷-1-醇不结合,而与顺-8-十二碳烯醋酸酯和顺-8-十二碳烯醇结合,但结合力较弱,结合常数分别为83.00和103.70 μmol/L;与16种寄主挥发物结合能力也不强,其中结合最强的是β 紫罗酮,结合常数为49.36 μmol/L。【结论】由此推断,GmolOBP3具有选择性识别和结合各种配基的特性。     

桃蛀螟性信息素结合蛋白CpunPBP3的表达模式及性信息素结合特性(英文)

【目的】本研究旨在对桃蛀螟Conogethes punctiferalis性信息素结合蛋白CpunPBP3进行鉴定和定性分析,完善对桃蛀螟性信息素感受机制的理解。【方法】扩增、分析桃蛀螟CpunPBP3的cDNA序列,并与其他草螟科昆虫的同源蛋白氨基酸序列进行比较。利用qRT-PCR测定桃蛀螟不同日龄雄成虫触角中CpunPBP3的表达量变化,以及该基因表达的昼夜波动;以性信息素反-10-十六碳烯醛(E10-16∶Ald)(150 ng)和顺-10-十六碳烯醛(Z10-16∶Ald)(6 ng)对雄成虫进行诱导,并检测诱导后24 h内不同时间节点时触角中CpunPBP3的表达量。构建重组表达载体pET-30a(+)/CpunPBP3,通过大肠杆菌Escherichia coli表达获得重组蛋白,并通过荧光竞争实验检测纯化重组蛋白CpunPBP3与上述2种性信息素成分的结合能力。【结果】系统发育分析结果显示,CpunPBP3与已经鉴定的桃蛀螟PBP基因CpunPBP2和CpunPBP5分布在不同分支中,但与其他昆虫物种的PBP基因亲缘关系较近;qRT-PCR结果表明,雄成虫触角中CpunPBP3的表达量在羽化后0-8 d呈先升高后下降的趋势,24 h光周期内17∶00时的表达量显著高于1∶00时的,其余时间节点间的表达量无显著差异;150 ng的E10-16∶Ald诱导3和6 h后的表达量显著下降,6 ng的Z10-16∶Ald诱导6和24 h后的表达量显著增加。荧光竞争结合实验结果表明,CpunPBP3重组蛋白与性信息素E10-16∶Ald和Z10-16∶Ald均有强结合能力,K_i值分别为9.267和8.656 μmol/L。【结论】本研究明确了CpunPBP3的核苷酸和氨基酸序列及其表达模式,能够响应性信息素的诱导而表达,而且CpunPBP3重组蛋白能够很好地结合性信息素,表明CpunPBP3是桃蛀螟的一条性信息素结合蛋白。     

暗黑鳃金龟气味结合蛋白HparOBP15a基因的克隆及功能分析

【目的】暗黑鳃金龟Holotrichia parallela通过气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)识别性信息素和植物挥发物准确而迅速地定位配偶、寄主植物。本研究通过克隆暗黑鳃金龟气味结合蛋白15a(Hpar OBP15a)基因,解析该基因的编码蛋白特征、组织表达模式及与寄主植物气味等化合物的结合特性方面的研究,为阐明暗黑鳃金龟基于嗅觉识别的寄主植物选择机理奠定理论基础。【方法】根据暗黑鳃金龟成虫触角转录组测序的结果,利用RT-PCR克隆了Hpar OBP15a基因;Real-time PCR方法分析了该基因在成虫不同部位的表达量差异;荧光竞争结合测定了Hpar OBP15a蛋白和58种候选化合物的结合特征。【结果】暗黑鳃金龟Hpar OBP15a基因全长534 bp,编码147个氨基酸,Gen Bank登录号为AK1834747。Hpar OBP15a在触角中特异表达,且在雌虫触角中表达量显著高于雄虫。在被测的58种化合物中,Hpar OBP15a与46种气味化合物具有较好的亲和性,其中与十二烷、十二醇结合能力最强,其解离常数分别为8.5和11.3μmol/L;同时,对性信息素(L-异亮氨酸甲酯和R-芳樟醇)也有一定的结合能力(解离常数分别为21.0和18.5μmol/L)。【结论】Hpar OBP15a具有广泛的气味结合谱,其中对榆树挥发物十二烷的结合能力最强,因此该蛋白可能在暗黑鳃金龟对榆树的定位过程中具有重要作用。     

甜菜夜蛾触角结合蛋白Ⅱ的cDNA克隆、 组织分布及配体结合特性分析

触角结合蛋白（antennal binding proteins, ABPs）是气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）的一个亚类, 推测其在昆虫嗅觉中起作用。为了探讨这一问题, 本研究通过转录组数据分析并利用RACE技术, 克隆了甜菜夜蛾Spodoptera exigua触角结合蛋白Ⅱ基因（SexigABP2）的全长cDNA序列（GenBank登录号为HQ234486）。序列分析表明, 该基因开放阅读框长444 bp, 编码148个氨基酸, 具有OBPs典型的6个半胱氨酸位点; 其氨基酸序列和烟芽夜蛾Heliothis virescens的HvirABP2的一致性最高, 达72%。实时定量PCR分析显示, 该基因主要在触角中表达, 在喙、 足、 翅等组织中也有少量表达, 且在雌蛾触角及足中的表达量显著高于雄蛾。进一步对该基因进行原核表达和纯化, 利用荧光竞争结合实验测定了SexigABP2对35种气味物质的结合能力, 发现其对甜菜夜蛾性信息素组分(Z)-9-十四碳烯醇和植物挥发物法尼醇的结合能力较强, 结合常数分别为8.24 μmol/L和8.14 μmol/L。结合能力比较表明, SexigABP2对不饱和长碳链化合物较饱和短碳链化合物具有更强的结合能力; 在不饱和长碳链化合物中, 对醇类物质又较乙酸酯类物质具有更强的结合能力。结果提示SexigABP2可能参与了成虫对不饱和长碳链的植物挥发物的感受。     

绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP7的表达及气味结合特性

气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs) 在昆虫嗅觉识别中起着重要的作用, 尤其是在运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体(olfactory receptors, ORs)的过程中发挥关键作用。明确OBPs在昆虫同外界进行信息交流过程中的作用有利于阐明昆虫嗅觉识别的机制, 同时可为利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治奠定理论基础。本研究克隆了一个绿盲蝽Apolygus lucorum (Meyer-Dür)气味结合蛋白AlucOBP7基因（GenBank登录号: JQ675724）, 并进行了原核表达, 以1-NPN为荧光探针采用荧光竞争结合实验研究了AlucOBP7蛋白和10种棉花挥发物及 6种性信息素类似物的结合能力。结果表明： 在10种棉花挥发物中, AlucOBP7能够和2 己酮及水杨酸甲酯有效结合, 结合常数分别为55.13 μmol/L和28.26 μmol/L。在6种盲蝽性信息素类似物中, 4-氧代-反-2-己烯醛和AlucOBP7 具有较强的结合能力, 结合常数为23.14 μmol/L。丁酸乙酯、 丁酸丁酯及己酸己酯也能够和AlucOBP7 有效结合, 但结合能力中等, 结合常数分别为30.58, 39.26和35.81 μmol/L。初步推测, AlucOBP7 可能是绿盲蝽性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs), 并在感受性信息素和植物挥发物的过程中发挥双重功能。     

中华蜜蜂性信息素结合蛋白ASP1的原核表达及配基结合特性分析

【目的】研究中华蜜蜂Apis cerana cerana信息素结合蛋白ASP1与蜜蜂信息素及某些植物挥发物分子的结合功能。【方法】构建中蜂ASP1的原核表达载体, 对其进行重组蛋白的诱导表达和分离纯化, 并得到具有生化活性的中蜂ASP1重组蛋白, 最后以1-NPN作为荧光报告探针, 通过荧光竞争结合实验研究中蜂重组ASP1蛋白与蜜蜂信息素及其他气味分子的结合功能。【结果】在22种潜在信息气味物质中, 有7种与中蜂ASP1有较强的结合能力, 能将1-NPN的相对荧光强度降至50%以下。其中发现蜂王信息素两种成分对 羟基苯甲酸甲酯和香草醇的竞争能力最强, 可分别引起1-NPN相对荧光值下降99.31%和95.50%, 解离常数K_D分别为13.39和98.44 μmol/L; 而与除蜂王信息素外的其他信息素如幼虫信息素和工蜂信息素等分子均不结合。此外中蜂ASP1对于水杨酸甲酯、 苯乙醛、 3, 4-二甲基苯甲醛4-烯丙基藜芦醚和β-紫罗兰酮等5种植物挥发物质能产生强度不一的结合。【结论】中蜂信息素结合蛋白ASP1对蜂王信息素具有非常强的特异性, 同时也能结合某些植物挥发性气味分子, 暗示中蜂ASP1是一种以蜂王信息素识别为主要功能、 植物挥发物识别为次要功能的多功能信息素结合蛋白。     

中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18的原核表达及配体结合特性

【目的】研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator气味结合蛋白MmedOBP18在触角中的表达定位,解析MmedOBP18重组蛋白的配体结合特性。【方法】原核表达中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18;采用荧光免疫组织化学技术研究MmedOBP18在中红侧沟茧蜂雌蜂触角中的表达定位;通过荧光竞争结合实验分析MmedOBP18重组蛋白与99种候选配体的结合特性。【结果】在原核表达系统中成功表达MmedOBP18重组蛋白。荧光免疫定位结果显示MmedOBP18主要表达在触角锥形感器Ⅰ内的淋巴液中。荧光竞争结合实验结果表明,MmedOBP18重组蛋白能够与16种候选配体结合,与低挥发性植物挥发物2-十三酮、十二醛、十四酸和十一酸的结合能力最强,其解离常数K_i值分别为5.21, 6.42, 6.49和6.58μmol/L;而且MmedOBP18重组蛋白与非挥发性植物次生物质棕榈酸、棉酚、槲皮素及亚麻酸也有较强的结合能力,K_i值分别为3.86, 5.07, 5.08和6.51μmol/L;此外,MmedOBP18重组蛋白与鳞翅目昆虫性信息素组分顺-9-十四碳烯醛及顺-11-十六碳醛表现出较强的结合能力,K_i值分别为9.09和11.67μmol/L,提示该蛋白在寄主定位过程中可发挥重要的作用。【结论】中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18能够结合长链低挥发和非挥发性化合物,推测其在嗅觉和味觉识别中发挥双重功能,主要参与对寄主和寄主生境的化学信息的近距离识别。     

甘薯蚁象气味结合蛋白CforOBP8的基因表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确甘薯蚁象Cylas formicarius气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP) OBP8的基因表达谱及与配体化合物的结合特性。【方法】基于甘薯蚁象成虫转录组数据,利用RT-PCR方法从甘薯蚁象成虫触角中克隆了气味结合蛋白OBP8基因,并进行生物信息学分析;采用qPCR方法测定该基因在甘薯蚁象成虫触角、口器、翅和跗节中的表达谱;构建原核表达载体,进行诱导表达及蛋白纯化。利用荧光竞争结合实验测定纯化的重组蛋白与16种配体化合物(1种性信息素和15种植物挥发物)的结合特性。【结果】获得甘薯蚁象气味结合蛋白基因CforOBP8(GenBank登录号:MH549528)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码138个氨基酸,预测分子量为15.56 kD,等电点为4.71,N末端具有21个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸,CforOBP8属于Minus-C OBPs亚家族。荧光定量PCR结果表明,CforOBP8在甘薯蚁象成虫触角中特异性表达,在其他组织中微量表达。SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。CforOBP8与配体化合物的结合力测试表明,CforOBP8与性信息素(E)-2-丁烯酸顺-(Z)-3十二烯基酯结合能力最强,解离常数K_i为4.13μmol/L;其次与5种植物挥发物也有一定的结合能力,依次为乙酸顺-3-己烯酯(K_i=7.54μmol/L)、柠檬烯(K_i=15.23μmol/L)、橙花醇(K_i=16.31μmol/L)、壬醛(K_i=28.71μmol/L)和苯乙醛(K_i=29.54μmol/L)。【结论】CforOBP8可能是甘薯蚁象性信息素结合蛋白,并且在感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中都发挥作用。     

苜蓿盲蝽气味分子结合蛋白AlinOBP2结合特性初步分析

昆虫具有灵敏的嗅觉系统,能够特异性地识别性信息素和寄主挥发物来进行寻找配偶、定位寄主植物和产卵位点.气味分子结合蛋白在昆虫嗅觉识别过程中发挥关键作用.本研究表达和纯化了一个新的苜蓿盲蝽气味分子结合蛋白AlinOBP2,采用qRT-PCR方法解析了AlinOBP2基因的表达谱,结果表明AlinOBP2绝大部分在触角中表达,且在雌雄触角中的表达量相当,在头部也有少量的表达.以N-phenyl-1-naphthylamine（1-NPN）为荧光探针,采用荧光竞争结合实验研究了5种性信息素类似物和13种棉花挥发物与AlinOBP2蛋白的结合能力.结果显示,5种性信息素类似物均不能和AlinOBP2有效结合,暗示AlinOBP2在苜蓿盲蝽寻找配偶过程中不发挥作用.在13种棉花挥发物中,庚酸乙酯和AlinOBP2的结合能力最强,结合常数为9.22μmol/L.二甲基萘、3-己酮、乙酸叶醇酯、乙酸壬酯、香芹醇5种化合物和AlinOBP2结合能力一般,结合常数分别为15.49,17.31,21.53,18.86和13.47μmol/L.据此推测,AlinOBP2可能为普通气味结合蛋白,能够选择性地结合某些棉花挥发物并参与苜蓿盲蝽识别普通气味过程.     

豌豆蚜触角转录组化学感受蛋白的鉴定、表达和结合特性分析

[目的]本研究旨在鉴定豌豆蚜Acyrthosiphon pisum触角转录组中化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因,明确触角中高表达的豌豆蚜CSP蛋白与蚜虫报警信息素、性信息素以及植物挥发物的分子结合特性.[方法]通过对豌豆蚜成蚜触角进行转录组测序,鉴定触角中候选CSP基因;采用RPKM...     

Molecular characterization,expression pattern and ligand‐binding properties of the pheromone‐binding protein gene from Cyrtotrachelus buqueti

Pheromone‐binding proteins (PBPs) play important roles in the information exchange between insect sexes, specifically in the process of transporting fat‐soluble odour molecules from the external environment to olfactory receptors through the olfactory sensillum lymph. The PBP functions in this process may explain the sex pheromone identification mechanism used by insects, laying a theoretical foundation for the prevention and control of pests by interfering with olfactory recognition. In the present study, a PBP gene of Cyrtotrachelus buqueti (GenBank accession number: KU845733) is cloned for prokaryotic expression. Using N‐phenyl‐1‐naphthylamine as the fluorescent probe in a competitive binding assay, the ability of CbuqPBP1 to bind 12 sex pheromone analogues and three volatiles of Neosinocalamus affinis shoots is examined. Of the 12 C. buqueti sex pheromone analogues, dibutyl phthalate gives the greatest displacement (inhibitory constant value of 11.1 μm ), whereas the other sex pheromone components show much smaller displacements. Consistent with other PBPs, the three plant volatiles (linalool, benzaldehyde and indole) show only a limited displacement of CbuqPBP1. However, the binding abilities of 1 : 1 ratios of each of the three plant volatiles with dibutyl phthalate show increases of 62.3%, 65.1% and 51.7% over the binding abilities of the three plant volatiles alone. CbuqPBP1 has dual roles in the processes of sensing sex pheromones and plant volatiles.     

Binding specificity of OBPs in the yellow peach moth Conogethes punctiferalis (Guenée)

Odorant-binding proteins (OBPs) are translators of the external chemical signals, which are critical for maintaining insect life. However, few OBPs were reported in the yellow peach moth (YPM), Conogethes punctiferalis (Guenée). In the current study, five OBPs (CpunOBP1, CpunOBP2, CpunOBP7, CpunPBP2 and CpunPBP4) were expressed and purified from the antennae of the YPM. The results showed that the proteins encoded by five CpunOBPs had six conserved cysteine residues, which were typical structural features of classic OBPs. Moreover, the fluorescence competitive binding assays indicated that the binding affinity of five CpunOBPs to the selected YPM female sex pheromones, host plant volatiles and Penicillium-inoculated apple volatiles was obviously different. The binding affinities of CpunOBP1 and CpunOBP2 with β-ionone were the strongest. CpunOBP7 could bind with 12 host plant volatiles but was unable to interact with any one of the three tested female sex pheromones. CpunPBP2 and CpunPBP4 exhibited the highest binding affinity to female sex pheromone trans-10-hexadecenal among 30 tested compounds. In conclusion, these results suggest the functional differentiation of the CpunOBPs in recognizing sex pheromones, host plant volatiles and fungus-infected host plant volatiles, which will provide new insights into selecting target proteins for YPM biocontrol.     

中华按蚊气味结合蛋白AsinOBP2的基因克隆、表达谱及与人体气味物质的结合特性分析

【目的】克隆中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白2(odorant binding protein 2, OBP2)基因AsinOBP2,分析该基因的表达及其重组蛋白与人体气味物质的结合能力。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆AsinOBP2的全长cDNA序列,通过qPCR分析AsinOBP2基因在中华按蚊不同发育时期(雌雄蛹及羽化后第0, 1, 2, 3, 6和9天的成虫)、3日龄成虫不同嗅觉组织(触角、喙和下颚须)和吸血前后3日龄雌成虫中的表达水平;通过原核表达和亲和层析,表达并纯化AsinOBP2重组蛋白,运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白AsinOBP2与39种人体气味物质的结合能力。【结果】克隆并测序了AsinOBP2的全长cDNA序列(GenBank登录号: MT700441),其开放阅读框长492 bp,编码163个氨基酸,N末端30个氨基酸为信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸结合位点,属于Classic亚家族成员。qPCR结果显示,AsinOBP2在中华按蚊羽化后的表达水平逐渐增强,羽化后第6天表达水平最高,随后开始下降;AsinOBP2主要在雌成蚊触角中表达;吸食血液后3日龄雌成虫中AsinOBP2的表达水平显著下降。荧光竞争结合实验显示,在测定的39种人体气味物质中,重组蛋白AsinOBP2与12种化合物具有结合活性,其中与吲哚结合能力较强,解离常数Ki=27.15 μmol /L,其次是与正丙胺、2-甲基丁醛和葵醛,解离常数Ki分别为42.49, 48.33和47.90 μmol /L。【结论】根据AsinOBP2基因的表达特点及其重组蛋白与人体气味物质的结合能力,后者表明AsinOBP2对人体气味物质具有明显的选择结合特性,我们推断AsinOBP2在雌蚊追寻宿主的行为中起着重要的作用。