中华按蚊气味结合蛋白基因AsinOBP1的克隆和表达分析

【目的】蚊虫的行为在很大程度上依赖于嗅觉系统, 例如寻找宿主和产卵场所等。中华按蚊Anopheles sinensis是我国最重要的传疟媒介之一, 但有关中华按蚊嗅觉信号传递过程的研究甚少。本研究旨在克隆和表达分析中华按蚊的气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）基因, 为进一步研究中华按蚊嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】通过分析中华按蚊的转录组数据克隆气味结合蛋白基因, 采用RT-PCR和实时定量PCR技术分析该基因在成虫不同组织和在吸血前后的表达模式。【结果】克隆到一个气味结合蛋白基因, 命名为AsinOBP1 (GenBank登录号为KJ958382)。AsinOBP1基因开放阅读框长435 bp, 编码144个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。RT-PCR组织表达谱分析发现, AsinOBP1在检测的所有成虫触角、下颚须、喙和头部组织中都有表达, 而在足和去掉头部以外的躯体组织中不表达。定量分析发现AsinOBP1在雌蚊触角中的表达水平最高, 吸食血液后, AsinOBP1的表达水平显著下降; 仅用小鼠气味处理后, AsinOBP1的表达水平也显著下降。【结论】研究结果说明AsinOBP1可能是嗅觉组织特异性表达的基因, 与雌蚊寻找宿主等行为有关, 其功能还需深入研究。     

棉铃虫气味结合蛋白HarmOBP16的组织表达谱及配基结合特性分析

【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味结合蛋白基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR对其进行组织[头部(去除触角和喙)、胸部、腹部、足、翅、触角和喙]表达谱分析;进一步采用原核表达系统表达和纯化重组蛋白;最后采用荧光竞争结合实验测定该重组蛋白与85种候选气味物质的结合能力。【结果】从棉铃虫成虫触角中克隆得到一个Atypical OBP家族基因Harm OBP16(Gen Bank登录号:JQ753074),其开放阅读框长441 bp,编码146个氨基酸,推断的编码蛋白等电点为6.87,具有10个保守的半胱氨酸。组织表达谱结果表明,Harm OBP16在雌成虫翅中高表达。纯化后的重组蛋白Harm OBP16对植物花的挥发物香叶基丙酮(Ki=14.2μmol/L)、β-紫罗兰酮(Ki=15.2μmol/L)、辛醛(Ki=15.3μmol/L)、芳樟醇(Ki=16.8μmol/L)、(R)-(+)-柠檬烯(Ki=14.9μmol/L)和β-蒎烯(Ki=17.3μmol/L)有较强的结合能力。【结论】Harm OBP16可能在棉铃虫识别寄主植物的过程中发挥一定的作用,可为基于气味物质的棉铃虫引诱剂或驱避剂的研发提供潜在的分子靶标。     

疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱，解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白，利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况；通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强，Ki=1.4 μmol/L。此外，PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力，Ki值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2 μmol/L。PsauOBP7与两种醇类化合物顺-3-己烯-1-醇和法尼醇也有较强的结合能力, Ki值分别为5.8和5.9 μmol/L。【结论】疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7表达于其幼虫和成虫的多种化学感受器官中，且能结合多种植物气味化合物，说明其在疆夜蛾寻找寄主植物过程中发挥重要作用。     

梨小食心虫Minus-C气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta的Minus-C气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并测定其在成虫不同组织中的表达量及其重组蛋白对气味配体的结合能力,推测其嗅觉生理功能。【方法】基于梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据,利用RT-PCR克隆MinusC OBP基因的完整编码区;qPCR测定该基因在成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅]中的表达量;构建原核表达系统表达重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯度;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与35种气味配体的结合能力。【结果】成功克隆了梨小食心虫的一个Minus-C OBP基因,命名为GmolOBP14(GenBank登录号:MF066361)。GmolOBP14开放阅读框长411 bp,编码136个氨基酸,成熟蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基,属于Minus-C OBP亚家族。GmolOBP14在雌雄成虫的不同组织中均有表达,但在雄成虫翅和雌成虫触角中的表达量显著高于同性别的其他组织。重组蛋白GmolOBP14与气味配体的结合谱较窄,仅能与16种配体表现出不同程度的结合活性,其中与梨酯和十二醛的结合能力较强,解离常数Ki分别为6.92和12.74μmol/L;与癸醛、十四醛、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇和己酸丁酯有中等程度的结合活性,Ki分别为25.54,20.61,24.35,23.44和23.33μmol/L;GmolOBP14对性信息素组分没有结合活性,提示该蛋白不参与对性信息素的感受和识别。【结论】根据GmolOBP14基因的组织表达特点及其重组蛋白的结合特性,推测GmolOBP14除具有选择性结合和运输寄主植物挥发物的作用外,还参与与嗅觉无关的生理过程。     

二化螟Minus-C气味结合蛋白的分子克隆及功能鉴定

气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在昆虫对寄主气味的感受中起重要作用, 但有关Minus-C OBP及其功能的报道很少。本研究通过基因组数据分析并利用RACE技术, 克隆和鉴定了二化螟Chilo suppressalis (Walker)的一个Minus-C OBP基因, 命名为CsupOBP1（GenBank登录号： KC492498）。CsupOBP1基因的开放阅读框长423 bp, 编码141个氨基酸, 其中N端的18个氨基酸为预测的信号肽序列, 成熟蛋白序列中具有4个保守的半胱氨酸位点。实时定量PCR分析显示, 该基因在幼虫头部及成虫雌雄足、 翅和雄性触角等化感组织中高表达, 其中在雄虫触角内的表达量显著高于雌虫触角。利用荧光竞争结合实验对CsupOBP1重组蛋白与38种化合物的结合特性的测定表明, 重组CsupOBP1与β 紫罗兰酮的结合能力最强（Ki=9.53 μmol/L）。触角电位测定表明, 二化螟成虫可对β-紫罗兰酮产生显著的触角电生理反应, 但雄虫反应明显强于雌虫, 与结合试验及雄虫触角中CsupOBP1的表达量显著高于雌虫触角的测定结果相一致。鉴于β-紫罗兰酮是水稻等植物中普遍存在的一种芳香气味组分, 推测CsupOBP1可能通过对该气味的结合和运输, 从而在二化螟对寄主植物的嗅觉定向中起作用。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

梨小食心虫气味结合蛋白GmolOBP3的cDNA克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】为了更好地了解昆虫气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在梨小食心虫Grapholita molesta（Busck）嗅觉识别中的作用,并明确其与寄主挥发物的结合特性。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆梨小食心虫OBP基因;采用RT-PCR和实时定量PCR对该基因在成虫不同组织和羽化后不同日龄成虫中的表达情况进行了测定;以N-phenyl-1-naphthylamine（1-NPN）为荧光探针,采用荧光竞争结合试验对GmolOBP3蛋白的结合特性进行了分析。【结果】得到梨小食心虫一个新的气味结合蛋白基因,命名为GmolOBP3（GenBank登录号：KF395363）。GmolOBP3开放阅读框全长492 bp,编码163个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为18.72 kDa和4.93,呈酸性,具有典型的6个半胱氨酸位点。GmolOBP3在雌、雄成虫触角和腹部均有表达,成虫在羽化后5 d内,雌蛾触角中GmolOBP3表达量随羽化后日龄而增加,但雄蛾在羽化后第5天触角中 GmolOBP3表达量显著降低。通过构建GmolOBP3原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达并获得了GmolOBP3重组蛋白。荧光竞争结合实验对GmolOBP3蛋白与16种寄主挥发物及4种性信息素类似物的结合力发现,在供试的4种梨小食心虫性信息素类似物中,GmolOBP3蛋白与反-8-十二碳烯醋酸酯和十二烷-1-醇不结合,而与顺-8-十二碳烯醋酸酯和顺-8-十二碳烯醇结合,但结合力较弱,结合常数分别为83.00和103.70 μmol/L;与16种寄主挥发物结合能力也不强,其中结合最强的是β 紫罗酮,结合常数为49.36 μmol/L。【结论】由此推断,GmolOBP3具有选择性识别和结合各种配基的特性。     

多异瓢虫气味结合蛋白HvarOBP2的基因克隆及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在克隆多异瓢虫Hippodamia variegata气味结合蛋白(odorant-bindingproteins, OBPs)基因HvarOBP2,并解析这一蛋白的配体结合特征。【方法】采用BLAST和生物信息学技术从多异瓢虫成虫触角转录组中鉴定候选气味结合蛋白基因HvarOBP2,PCR特异扩增HvarOBP2基因全长cDNA序列;通过体外原核表达和亲和柱层析等手段获得HvarOBP2重组蛋白;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白HvarOBP2与40种植物挥发物组分以及24种蚜虫相关挥发物组分的结合能力;使用PyMOL1.9.0进行重组蛋白HvarOBP2与4种配体（β-紫罗兰酮、邻苯二甲酸二丁酯、油酸和橙花叔醇）的分子对接模拟。【结果】HvarOBP2(GenBank登录号: OK340816)开放阅读框(open reading frame, ORF)长447 bp,其编码蛋白N端有17个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守的半胱氨酸位点,属于classical OBPs亚家族。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白HvarOBP2与植物挥发物组分油酸(解离常数Ki=1.68±0.04μmol/L)、邻苯二甲酸二丁酯(Ki=8.77±0.19 μmol/L)、橙花叔醇(Ki=15.93±0.33 μmol/L)和β-紫罗兰酮(Ki=10.79±0.24 μmol/L)有较强的结合能力;重组蛋白HvarOBP2与上述4种配体的分子对接模拟表明,HvarOBP2的Phe12和Phe118是与多个配体结合的氨基酸残基。【结论】结果提示HvarOBP2参与多 异瓢虫识别植物挥发物、间接定位猎物栖息地等行为,这些与HvarOBP2强结合的化合物在多异瓢虫搜寻定位寄主过程发挥作用。     

暗黑鳃金龟气味结合蛋白HparOBP15a基因的克隆及功能分析

【目的】暗黑鳃金龟Holotrichia parallela通过气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)识别性信息素和植物挥发物准确而迅速地定位配偶、寄主植物。本研究通过克隆暗黑鳃金龟气味结合蛋白15a(Hpar OBP15a)基因,解析该基因的编码蛋白特征、组织表达模式及与寄主植物气味等化合物的结合特性方面的研究,为阐明暗黑鳃金龟基于嗅觉识别的寄主植物选择机理奠定理论基础。【方法】根据暗黑鳃金龟成虫触角转录组测序的结果,利用RT-PCR克隆了Hpar OBP15a基因;Real-time PCR方法分析了该基因在成虫不同部位的表达量差异;荧光竞争结合测定了Hpar OBP15a蛋白和58种候选化合物的结合特征。【结果】暗黑鳃金龟Hpar OBP15a基因全长534 bp,编码147个氨基酸,Gen Bank登录号为AK1834747。Hpar OBP15a在触角中特异表达,且在雌虫触角中表达量显著高于雄虫。在被测的58种化合物中,Hpar OBP15a与46种气味化合物具有较好的亲和性,其中与十二烷、十二醇结合能力最强,其解离常数分别为8.5和11.3μmol/L;同时,对性信息素(L-异亮氨酸甲酯和R-芳樟醇)也有一定的结合能力(解离常数分别为21.0和18.5μmol/L)。【结论】Hpar OBP15a具有广泛的气味结合谱,其中对榆树挥发物十二烷的结合能力最强,因此该蛋白可能在暗黑鳃金龟对榆树的定位过程中具有重要作用。     

绿豆象气味受体基因的克隆和时空表达谱

【目的】本研究旨在克隆绿豆象Callosobruchus chinensis触角4个普通气味受体(odorant receptor, OR)基因,明确这些OR基因在绿豆象不同日龄雌雄成虫组织中的表达谱,为进一步研究基因功能奠定基础。【方法】基于绿豆象成虫触角转录组数据,预测绿豆象OR候选基因;利用RT-PCR克隆绿豆象4个OR基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用qPCR检测这4个OR基因在绿豆象雌雄成虫不同组织(触角、不含触角的头、腹、足和翅)中以及1, 3和5日龄雌雄成虫触角中的表达量。【结果】根据预测的基因序列,克隆得到4个绿豆象气味受体基因的cDNA全长序列,分别命名为CchiOR8,CchiOR10,CchiOR16和CchiOR39,GenBank登录号分别为MW732665, MN832705, MW732664和MN832706;编码的氨基酸数目分别为369, 352, 400和367。系统发育树分析表明,CchiOR8, CchiOR10和CchiOR16均与大猿叶甲Colaphellus bowringi的同源蛋白亲缘关系较近,而CchiOR39与果...     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制。【方法】通过qRT-PCR测定OBP14在20日龄中华蜜蜂成年工蜂、20日龄中华蜜蜂成年雄蜂、中华蜜蜂采粉蜂和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica采粉蜂触角中的表达量。构建原核表达载体pET28a/AcerOBP14,表达并分离纯化重组蛋白AcerOBP14。利用荧光竞争结合实验检测AcerOBP14与37 种气味配体化合物的结合特性。【结果】qRT-PCR分析发现, OBP14在中华蜜蜂采粉蜂触角中的表达量极显著高于20日龄中华蜜蜂成年工蜂和雄蜂以及意大利蜜蜂采粉蜂中的。荧光竞争结合实验表明,AcerOBP14与蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多种植物挥发物都具有结合能力,其中与β 罗勒烯的结合能力最强,解离常数 Ki=0.297 μmol/L。【结论】AcerOBP14的配体结合谱较宽,暗示其可能参与了中华蜜蜂的多种生理行为反应,且在中华蜜蜂的采粉行为中发挥着重要作用。     

蜂巢小甲虫气味结合蛋白基因AtOBP1的分子特性及功能研究

【目的】本研究旨在明确蜂巢小甲虫Aethina tumida气味结合蛋白1(odorant binding protein 1, OBP1)的表达模式,分析AtOBP1在蜂巢小甲虫嗅觉识别中的作用。【方法】基于蜂巢小甲虫转录组和基因组数据库扩增AtOBP1的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测该基因在蜂巢小甲虫不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和雌雄成虫)、羽化后第7天成虫不同组织(头、表皮、翅、足、脂肪体、肠道、马氏管、精巢和卵巢)以及羽化后不同日龄成虫头部的表达量;采用RNA干扰技术和Y型管行为选择实验,解析AtOBP1在蜂巢小甲虫嗅觉识别中的生物学功能。【结果】AtOBP1基因(GenBank登录号：MT211982.1)的cDNA全长序列包含6个外显子,其开放阅读框(ORF)长447 bp,编码148个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.9 kD和4.73,具有PBP＿GOBP亚家族的保守结构域;AtOBP1蛋白是由6个α螺旋组成的二聚体,且有6个保守的半胱氨酸形成3个二硫键;系统发育进化树显示该蛋白与鞘翅目(Coleoptera)黄粉虫Tenebrio...     

中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18的原核表达及配体结合特性

【目的】研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator气味结合蛋白MmedOBP18在触角中的表达定位,解析MmedOBP18重组蛋白的配体结合特性。【方法】原核表达中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18;采用荧光免疫组织化学技术研究MmedOBP18在中红侧沟茧蜂雌蜂触角中的表达定位;通过荧光竞争结合实验分析MmedOBP18重组蛋白与99种候选配体的结合特性。【结果】在原核表达系统中成功表达MmedOBP18重组蛋白。荧光免疫定位结果显示MmedOBP18主要表达在触角锥形感器Ⅰ内的淋巴液中。荧光竞争结合实验结果表明,MmedOBP18重组蛋白能够与16种候选配体结合,与低挥发性植物挥发物2-十三酮、十二醛、十四酸和十一酸的结合能力最强,其解离常数K_i值分别为5.21, 6.42, 6.49和6.58μmol/L;而且MmedOBP18重组蛋白与非挥发性植物次生物质棕榈酸、棉酚、槲皮素及亚麻酸也有较强的结合能力,K_i值分别为3.86, 5.07, 5.08和6.51μmol/L;此外,MmedOBP18重组蛋白与鳞翅目昆虫性信息素组分顺-9-十四碳烯醛及顺-11-十六碳醛表现出较强的结合能力,K_i值分别为9.09和11.67μmol/L,提示该蛋白在寄主定位过程中可发挥重要的作用。【结论】中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18能够结合长链低挥发和非挥发性化合物,推测其在嗅觉和味觉识别中发挥双重功能,主要参与对寄主和寄主生境的化学信息的近距离识别。     

枣食芽象甲化学感受蛋白PyasCSP4的基因克隆、表达及配体结合特征

【目的】本研究为明确枣树Zizyphus jujuba主要害虫枣食芽象甲Scythropus yasumatsui化学感受蛋白4(chemosensory protein 4, CSP4)的表达特点及配体结合特性。【方法】基于枣食芽象甲成虫触角转录组数据,利用RT-PCR方法克隆了枣食芽象甲PyasCSP4 cDNA序列,并进行生物信息学分析。通过RT-qPCR方法测定PyasCSP4在枣食芽象甲成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的表 达水平。通过原核表达系统和镍柱纯化获得PyasCSP4重组蛋白,采用荧光竞争结合实验测定重组蛋白PyasCSP4与35种枣树挥发物的结合特性。【结果】克隆获得枣食芽象甲PyasCSP4的cDNA序列(GenBank 登录号: OK322362),其开放阅读框全长为366 bp,编码121个氨基酸,N末端有18个氨基酸组成的信号肽序列, PyasCSP4成熟蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸残基。RT-qPCR结果表明, PyasCSP4基因在成虫不同组织中均有表达,在触角和翅中的表达量显著高于在其他组织中的表达量。重组蛋白PyasCSP4与25种配体具有结合活性,尤其与α-蒎烯、α-水芹烯和罗勒烯等的结合能力最强,解离常数(Ki)值分别为6.29, 6.58和6.69 μmol/L。【结论】PyasCSP4能够与多种枣树挥发物结合,推测其可能在枣食芽象甲定位寄主植物的过程中发挥重要作用。本研究的结果对阐明枣食芽象甲嗅觉机制和开展绿色防控研究具有重要意义。     

双委夜蛾气味结合蛋白AdisOBP6的原核表达抗体制备及表达谱分析

【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次免疫新西兰大白兔,制备AdisOBP6抗体;采用荧光定量PCR和Western blot技术检测AdisOBP6在双委夜蛾雌雄成虫触角、不同时期精巢以及受精卵和未受精卵中的表达情况。【结果】同源建模预测显示,AdisOBP6具有6个保守半胱氨酸残基和7个α-螺旋结构,并 折叠成一个结合口袋。原核表达结果显示,在20℃下0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达量最多、最稳定。4次免疫重复中,抗体效价分别超过1∶512 000, 1∶512 000, 1∶512 000和1∶64 000。Westernblot检测获得的抗体与AdisOBP6蛋白能够特异性结合。荧光定量PCR结果显示,AdisOBP6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的,在幼虫期精巢中AdisOBP6就已经开始表达,在蛹期精巢中表达量低于在幼虫期的, 成虫羽化后精巢中的表达量逐渐进入高峰,在未受精卵和受精卵中几乎不表达或表达量极低。Western blot分析发现,AdisOBP6蛋白也主要在精巢中表达,在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。【结论】本研究实现了AdisOBP6的原核表达,成功地制备了抗体;并证实AdisOBP6在双委夜蛾精巢中大量表达,成虫羽化后表达量达到高峰,推测AdisOBP6可能参与了授精过程。本研究结果为今后进一步研究AdisOBP6的功能奠定了基础。     

沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲钙结合蛋白(calcium-binding protein, CaBP)基因,分析其在沙葱萤叶甲成虫不同发育阶段及不同温度下的表达谱,为进一步探究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育过程中的作用奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组和蛋白质组数据,筛选CaBP基因序列信息,应用RT-PCR技术克隆获得CaBP基因的开放阅读框(ORF)全长序列,并对其进行生物信息学分析;通过qPCR检测其在沙葱萤叶甲成虫不同日龄(羽化后3, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90和110 d)及3日龄成虫在不同温度(0, 5, 10,15, 20, 25, 30和35℃)下处理1 h后的表达水平。【结果】克隆得到4条具有完整ORF的沙葱萤叶甲CaBP基因cDNA序列,分别命名为GdCaM, GdCAPSL, GdTnCl和GdCRT(GenBank登录号: MN695412-695415),ORF全长分别为480, 648, 516和1 209 bp,分别编码149, 215, 171和402个氨基酸;只有GdCRT拥有信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdCaM, GdCAPSL, GdTnCl和GdCRT分别与玉米根萤叶甲Diabroticavirgifera virgifera的CaM, CAPSL, TnCl及马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CRT的氨基酸序列一致性最高,分别为100.0%, 74.0%, 88.2%和92.5%。qPCR结果表明,4个CaBP基因在沙葱萤叶甲不同日龄成虫中均差异表达,且表达模式不同。GdCaM在成虫滞育前(羽化后3 d)表达量较高,进入滞育后(羽化后7 d)表达量降低,在滞育期间(羽化后7-60 d)表达量变化较小,而解除滞育后(羽化后90 d)表达量进一步下调。GdCAPSL在滞育初期(羽化后10 d)维持在最低水平,进入滞育中后期(羽化后40和60 d)开始回升,滞育解除后又突然下调至最低水平,而羽化后110 d急剧上升至最高水平。GdTnCl在滞育初期(羽化后15-20 d)高表达,进入滞育中后期(羽化后30-60 d)急剧下降至最低水平,滞育解除后再次上调,但羽化后110 d突然下调至最低水平。GdCRT在进入滞育后表达量开始逐渐下调,在滞育维持期间(羽化后15-60 d)维持在低水平,滞育解除后又开始上升。温度对3日龄成虫中除GdCRT外的其他3个CaBP基因的表达有显著影响。温度低于20℃时,GdCaM的表达量随温度的降低而升高,但0℃时突然下降;温度高于20℃时,GdCaM的表达量随着温度的升高而上升。GdCAPSL的表达量随着温度的升高而呈现上升的趋势,25℃时达到最高,然后下降。GdTnCl随着温度的升高,表达量呈现下降的趋势。【结论】钙结合蛋白可能在沙葱萤叶甲成虫生长发育及夏滞育调控过程中发挥着重要作用。