猪ANK1新的可变剪接体功能预测、组织表达谱分析与真核表达载体构建

为进一步了解猪ANK1基因,本研究以广西巴马猪作为实验对象,分析ANK1基因结构与功能,并利用实时荧光定量PCR方法,分析ANK1基因在广西巴马小型猪11个不同组织(心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,大肠,小肠,胰腺,皮下脂,胃,背最长肌)中的表达水平。组织表达谱分析结果表明ANK1基因在11个组织中均有表达,mRNA表达量表现为:胰腺心脏背最长肌胃大肠肝脏肾脏小肠脾脏肺脏脂肪。ANK1基因编码的蛋白通过生物信息学分析表明,编码156个氨基酸,存在跨膜结构和跨膜信号肽,分子量为17 799.27,理论等电点6.31,α螺旋和无规则卷曲所占比例比较大。通过酶切技术成功获得p EGFP-ANK1重组质粒并转染到C2C12细胞中,于48 h拍照发现细胞发出荧光,说明ANK1基因真核表达载体构建成功。     

猪激素敏感脂酶和甘油三酯水解酶基因组织表达特性研究

以八眉猪为研究对象,采用RT-PCR和Western blot方法对猪激素敏感酯酶(HSL)和甘油三酯水解酶(TGH)基因组织表达特点进行了研究。RT-PCR半定量检测显示,HSL基因的mRNA在检测的7种组织中都有表达,其中在脂肪组织表达量较高,中等程度表达于心脏、肝脏、肺、脾和肾脏。TGH基因在7种组织也均有表达,其中肝脏和脂肪组织表达量较高,心脏和肾脏次之,脾脏和肺脏表达量较低。Western blot检测显示,HSL基因在大网膜脂肪和皮下脂肪表达量最高,而在肾脏中没有检测到表达,其他组织中中度表达;TGH基因在大网膜脂肪、皮下脂肪、肝脏、肺脏和脾脏组织中表达,其中在脂肪组织和肝脏组织中表达量最高,而在心脏和肾脏中没有检测到表达。以上结果表明:HSL和TGH基因存在转录后调控,这可能与其在不同组织中的功能差异有关。     

广西巴马小型猪SLC30-A8基因克隆及组织表达差异分析

本研究的目的是克隆广西巴马小型猪SLC30-A8基因,并确定各组织的表达量。利用RT-PCR的方法扩增并克隆SLC30-A8基因;荧光定量PCR检测SLC30-A8基因在12月龄广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、小肠和脂肪中的表达。结果显示,成功克隆广西巴马小型猪SLC30-A8基因CDS区全长1 110 bp,荧光定量PCR结果显示SLC30-A8基因在12月龄广西巴马小型猪胰腺组织中表达量最高,其次是心脏、脾脏,在肺脏、小肠以及脂肪组织中几乎不表达。本研究成功克隆了广西巴马小型猪SLC30-A8基因并确定在胰腺组织中表达最高。该研究将为下一步研究SLC30-A8基因在糖尿病的发生过程中对糖代谢的作用奠定基础。     

鸡PPARs基因组织表达特性的研究

以8周龄Arber Acres(AA)肉鸡为研究材料,采用RT-PCR和Northern blot方法对鸡PPAR基因组织表达特点进行了研究。RT-PCR半定量检测显示,在检测的10种组织中除胸部肌肉组织外,PPAR-α基因在其他9种组织中都表达,其中较高表达于脑、肺脏、肾脏、心脏和小肠,中等程度表达于胃、肝脏和脂肪,较低表达于脾脏。PPAR-γ基因除了在肝脏和肌肉中没有检测到外,在其他8种组织都有表达,其中高表达于脂肪,其次是脑和肾脏,低量表达于脾脏、心脏、肺脏、胃和小肠。Northern blot检测显示,PPAR-α基因在心脏、肝脏、肾脏和胃这4种组织表达,其中在肝脏杂交信号最强;PPAR-γ基因只在脂肪和肾脏表达,其中在脂肪组织有强的杂交信号。以上结果表明,鸡PPARS基因的组织表达特点同啮齿动物和人基本一致,但也有其自身的特殊性,即PPAR-α基因不在肌肉组织中表达,PPAR-γ基因在肾脏中有高表达。PPAR基因与鸡的多种组织的生长和发育有关。     

猪SOCS-3 cDNA序列克隆及在各组织中表达

 根据大鼠细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS)-3设计并合成一对引物,从八眉猪皮下脂肪组织提取总mRNA,RT-PCR扩增获得猪SOCS-3 cDNA;利用半定量（semi-quantitative, SQ）RT-PCR技术检测大白猪各组织中SOCS-3 mRNA的表达量.扩增获得SOCS-3 基因GenBank 登陆号DQ644577,用CDD软件进行SOCS-3 基因结构分析,该序列具有SOCS-3 特有的保守结构域SH2和SOCS-box. 用Clustal W软件进行同源性分析发现,猪SOCS-3 基因与人、大鼠和小鼠的同源性分别为92%、88%和88%.SQ RT-PCR组织表达检测表明：SOCS-3 基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、皮下脂肪和内脏脂肪中均有表达,其中肺脏和脾脏的表达丰度最高,肝脏和内脏脂肪中的表达量最低.     

藏猪和大约克猪MYL1基因多态性及差异表达分析

为研究猪不同品种的MYL1基因的多态性及mRNA表达差异.本试验以藏猪和大约克猪作为实验动物,采用一代测序技术对藏猪(59头)和大约克猪(58头)MYL1基因起始密码子上游3 kb区域进行多态性检测;利用实时荧光定量PCR技术检测MYL1基因在背最长肌、背脂、肝脏组织差异表达情况.结果表明:藏猪和大约克猪在起始密码子上游3 kb区域发现T-159A突变位点并呈极显著差异(P＜0.01);MYL1基因在背最长肌表达量最高,其次是背脂,肝脏的最低,在背最长肌中藏猪MYL1基因表达量极显著高于大约克猪(P＜0.01),在背脂和肝脏组织中,藏猪MYL1基因表达量显著高于大约克猪(P＜0.05).推测T-159A位点可能是参与肌肉生长发育的重要调控位点.本研究为下一步开展MYL1基因对猪生长性能及其肉品质的影响提供参考依据.     

威宁绵羊GHR基因克隆及组织表达

本试验以6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公母羊为研究对象,利用分子手段对威宁绵羊GHR基因编码区序列进行克隆,并进行生物信息学分析,此外,本试验同时采用实时荧光定量PCR的手段对GHR基因在威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及背最长肌6个组织中mRNA水平上的表达规律进行探究,结果显示:威宁绵羊GHR基因CDS区序列长度为1 905 bp,发现2个SNP位点。GHR基因在威宁绵羊各组织均有不同程度的表达,在不同性别、不同生长阶段相同组织中的表达具有一定的显著性差异。     

PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪不同组织中的表达水平探究

为探究PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪不同组织中的表达与脂肪沉积的关系,本实验以10月龄苏太猪为研究对象,运用实时荧光定量PCR (q RT-PCR)技术检测PPARγ与c/EBPα基因mRNA在苏太猪心、肝、脾、肺、肾、胃、背最长肌和皮下脂肪8个组织中的表达水平。结果表明,PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪的8个组织中均有不同程度的表达,其中,PPARγ基因在苏太猪脾脏组织中的表达量最高,皮下脂肪中的表达水平仅次于脾;以背最长肌中PPARγ基因的相对表达量作对比,背最长肌与脾、肺和皮下脂肪的相对表达差异极显著(p<0.01),其余为差异不显著(p>0.05),表达量高低顺序为脾>皮下脂肪>肺>心>胃>肾>肝>背最长肌;c/EBPα基因在苏太猪的皮下脂肪的表达量最高,以背最长肌中c/EBPα基因的相对表达量作对比,在肝、脾、皮下脂肪组织中表达差异极显著(p<0.01),肺的相对表达差异显著(p<0.05),其余组织中差异不显著(p>0.05),表达量的高低顺序为皮下脂肪>肝>脾>肺>肾>心>胃>背最长肌。两基因在各组织中表达趋势趋于一致。试验结果表明PPARγ和c/EBPα基因可能对猪脂肪沉积有重要影响。     

贵州从江香猪FoxO4、PRKAA1基因在不同组织中的表达分析

为研究FoxO4、PRKAA1基因在从江香猪不同组织中的表达情况,本实验采用实时荧光定量PCR技术,检测FoxO4、PRKAA1基因的mRNA表达量,分析FoxO4、PRKAA1在贵州从江香猪不同组织的差异表达。结果显示,FoxO4基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中均有表达,其中在脂肪组织中表达量最高,且差异极显著(p0.01),在背最长肌组织中表达量最低;PRKAA1基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中也均有表达,其中在肺组织中表达量最高,且差异极显著(p0.01),在脂肪组织中表达量次之,在背最长肌组织中表达量最低。FoxO4、PRKAA1基因可能在肌内脂肪(IMF)沉积中发挥重要作用,为进一步研究FoxO4、PRKAA1的功能奠定基础。     

宗地花猪和从江香猪ADRP基因多态性及生物信息学分析

为研究宗地花猪和从江香猪ADRP基因的单核苷酸多态性,为选种选育提供理论参考,试验以宗地花猪和从江香猪为对象,构建DNA池,采用PCR产物测序法对ADRP基因8个外显子进行单核苷酸多态性检测,并利用生物信息学方法对ADRP基因编码产物进行结构功能预测。结果显示,在两个猪种ADRP基因中筛查到5个SNPs,分别是T37C、T140C、G777A、A1061G、A1117G,其中T37C位于非编码区内,T140C和A1061G为同义突变,G777A(Val→Ile)和A1117G(Asn→Ser)为错义突变;突变前后ADRP基因m RNA二级结构、编码蛋白二级结构及三级结构均发生了变化。研究结果表明,宗地花猪和从江香猪ADRP基因具有较高的遗传多样性,可为猪种的选育和创新提供参考。     

屯昌猪MYLPF基因序列分析及其组织表达量检测

为获得屯昌猪MYLPF基因的CDS区序列并分析其分子结构特征,研究屯昌猪、杜洛克猪以及其杂交F1代猪不同组织中的MYLPF mRNA表达水平,本研究以GenBank上公布的猪MYLPF基因序列(登录号:NM_001006592)为参考设计引物,通过RT-PCR扩增、测序获得屯昌猪MYLPF基因CDS区.结果显示:该基因CDS区长度510 bp,编码169个氨基酸,在CDS区存在33 G＞T的同义突变;该基因编码产物既没有跨膜结构,也不存在信号肽,属于非分泌型蛋白,主要在细胞质中发挥作用,预测存在1个潜在的糖基化位点和9个磷酸化位点,α螺旋区域在预测的二级结构中占比最大.荧光定量PCR检测结果显示MYLPF基因在屯昌猪背最长肌中表达量最高,屯昌猪背最长肌中MYLPF mRNA的表达量均显著高于杜洛克猪及其杂交F1代猪.本研究为探明MYLPF基因对猪肌内脂肪的影响提供了分子理论依据.     

猪小窝蛋白1（caveolin-1）的基因结构及在各组织中的表达分析

caveolin基因家族成员在基础细胞过程如细胞的形态调控、迁移以及肌肉细胞中基因的表达方面发挥着重要作用．本研究采用大白猪与广东蓝塘猪的背最长肌,利用mRNA差异显示技术对caveofin基因家族成员caveolin-1（Cav-1）进行了鉴定．同源分析结果表明,猪Cav-1蛋白的氨基酸序列中有一个caveolin结构域,并且该蛋白在不同物种间具有很高的保守性．RT-PCR分析发现,该蛋白在本实验所检测的猪心脏、肝、肾、大脑、脾、肺、背最长肌和背膘等8个部位组织中均有表达,其中背膘表达量最高．采用实时荧光定量PCR,首次证实该蛋白在蓝塘猪与大白猪的背膘及背最长肌中的表达量存在极显著与显著性差异,该结果表明Cav-1基因可能是一个胴体性状的候选基因．同时也说明,利用猪作为研究小窝蛋白在脂肪沉积中信号传导机制的动物模型将为未来研究提供非常有价值的信息．     

猪小窝蛋白1(caveolin-1)的基因结构及在各组织中的表达分析

caveolin基因家族成员在基础细胞过程如细胞的形态调控、迁移以及肌肉细胞中基因的表达方面发挥着重要作用.本研究采用大白猪与广东蓝塘猪的背最长肌,利用mRNA差异显示技术对caveolin基因家族成员caveolin-1(Cav-1)进行了鉴定.同源分析结果表明,猪Cav-1蛋白的氨基酸序列中有一个caveolin结构域,并且该蛋白在不同物种间具有很高的保守性.RT-PCR分析发现,该蛋白在本实验所检测的猪心脏、肝、肾、大脑、脾、肺、背最长肌和背膘等8个部位组织中均有表达,其中背膘表达量最高.采用实时荧光定量PCR,首次证实该蛋白在蓝塘猪与大白猪的背膘及背最长肌中的表达量存在极显著与显著性差异,该结果表明Cav-1基因可能是一个胴体性状的候选基因.同时也说明,利用猪作为研究小窝蛋白在脂肪沉积中信号传导机制的动物模型将为未来研究提供非常有价值的信息.     

牦牛水通道蛋白AQP1和AQP3基因克隆及在不同组织中表达和定位

水通道蛋白（Aquaporin,AQP）广泛存在于生物体的各组织部位,影响着生物体水代谢的过程。为进一步研究水通道蛋白1（AQP1）和水通道蛋白3（AQP3）生物学功能,本文对牦牛（Bos grunniens）不同组织中AQP1和AQP3基因的表达与定位进行了研究。采用PCR方法扩增牦牛AQP1和AQP3基因,对其序列进行生物信息学分析,采用qPCR方法检测2个基因在牦牛不同种组织中的表达量,采用免疫组织化学的方法分析AQP1和AQP3蛋白在组织中的定位和表达。结果表明,牦牛AQP1和AQP3基因CDS区分别为816 bp和840 bp,与野牦牛的同源性最高为99%。AQP1和AQP3基因的表达量在肾脏中最高,显著高于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肌肉、小肠和瘤胃,AQP1基因在各组织中的表达均高于AQP3基因的表达。AQP1和AQP3蛋白定位发现其主要分布于肾脏近曲小管、小肠固有层细胞和瘤胃颗粒层细胞中,均在肾脏中的表达量最高。AQP1蛋白在脾脏、小肠和肌肉组织中的表达极显著高于AQP3蛋白表达。该研究结果对高寒低氧环境中动物的研究具有借鉴意义,有助于牦牛AQP1和AQP3功能研究。     

山羊不同组织器官的内参基因筛选

本研究通过比较9个内参基因在山羊不同组织中的表达水平进而确定最适合研究山羊组织表达的内参基因。本试验以简州大耳羊为试验材料,利用实时荧光定量PCR技术分析9个内参基因(GAPDH,PPIA,18S rRNA,PPIB,UXT,RPLP0,ACTB,EIF3K和TBP)在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、瘤胃、背最长肌和皮下脂肪等组织中的表达差异情况,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等程序分析了它们的表达稳定性。geNorm和NormFinder程序一致显示TBP表达最稳定,其次是UXT和RPLP0;BestKeeper分析显示18S rRNA表达最为稳定,其次为TBP和ACTB;3个程序一致认为GAPDH表达稳定性最差。综合3个程序分析得出TBP最适合作为山羊组织中的内参基因,其次为UXT和RPLP0,GAPDH表达稳定性最差,不适合作为山羊组织内参,这为后续研究其他目的基因在山羊组织器官中的表达模式提供数据保障。     

藏山羊FGF1基因克隆、生物学特征及组织表达分析

本研究旨在克隆藏山羊FGF1基因的CDS序列,并获得其生物学特征,同时阐明其组织表达规律。选取2.5周岁健康公藏山羊6头,采集皮下脂肪、背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织样品,提取组织总RNA,利用RT-PCR方法克隆FGF1基因序列,同时利用实时定量PCR检测其m RNA在不同组织中的表达水平。结果表明,获得藏山羊FGF1基因序列1 165 bp(Gen Bank登陆号:KX509990),其中CDS为468 bp,5'UTR 255 bp和3'UTR 422 bp,编码155个氨基酸,藏山羊FGF1基因与山羊(KT899959)的核苷酸同源性为99.57%,氨基酸同源性为99.35%。FGF1 m RNA在藏山羊皮下脂肪组织中的表达水平较高,极显著高于其他组织(p0.01)。本研究将为进一步研究藏山羊FGF1基因的结构和功能提供参考资料。     

广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区（CDS）序列,利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1αmRNA组织表达情况。方法本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版,PCR扩增PGC-1α基因CDS序列,将其连接至pEASY-T5载体,转染细菌、验证和序列测定;通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。结果克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列,全长2391 bp,编码796个氨基酸,与参考序列的同源性为99.9%,两处碱基发生同义突变,分别是C-A1105和GA1524;PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高,其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌,而在胰腺中未检测到其表达。结论成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。     

鸡PPARγ基因的表达特性及其对脂肪细胞增殖分化的影响

为分析鸡PPARγ基因的组织表达特性及其在脂肪细胞增殖和分化过程中的功能,文章以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系肉鸡为实验材料,利用Western blotting方法,检测PPARγ基因的组织表达特性及其在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织间的表达差异;采用RNAi技术,在鸡原代脂肪细胞中抑制PPARγ基因的表达后,通过MTT和油红O提取比色的方法,研究鸡PPARγ基因对脂肪细胞增殖和分化的调控作用;利用Real-timePCR和Western blotting技术,分析PPARγ基因表达下调后,其他脂肪细胞分化转录因子以及与脂肪细胞分化相关的重要基因的表达变化情况。结果表明,PPARγ基因在7周龄高脂系肉鸡腹部脂肪组织、肌胃、脾脏、肾脏组织中表达量较高,在心脏中表达量较低,在肝脏、胸肌、腿肌、十二指肠中未检测到表达信号;与高脂系相比,PPARγ基因在5和7周龄低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达量较低(P<0.05);PPARγ基因的表达量下降后,鸡脂肪细胞的增殖能力增强,分化能力减弱;同时,C/EBPα、SREBP1、A-FABP、Perilipin1、LPL、IGFBP-2基因的表达量均下降(P<0.05)。由此可见,PPARγ基因的表达可能与肉鸡腹部脂肪的沉积有一定的关系,该基因可能是调控鸡脂肪细胞增殖与分化的关键因子。     

绵羊ILK基因的克隆及其在毛囊生长期的表达

整合素连接激酶(ILK)是一种支架蛋白,在毛囊发育过程中发挥重要作用。文章利用PCR技术,首次获得绵羊ILK基因的编码区全长序列,并进行了生物信息学分析;同时对该基因的组织表达谱及其在不同绵羊品种毛囊生长期皮肤组织中的表达变化进行了研究。结果表明,绵羊ILK基因ORF全长1 359 bp,编码452个氨基酸。ILK蛋白结构经预测含有3个锚定重复序列和1个激酶结构域,并存在多个磷酸化位点和蛋白激酶C的磷酸化位点。半定量RT-PCR结果显示该基因在绵羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌、皮肤和小肠组织中均有表达,皮肤、脾脏和肝脏中表达量较高;实时荧光定量PCR结果表明在3~5月份(毛囊生长起始期),ILK基因在中国美利奴超细型和哈萨克羊皮肤组织中的表达水平较高并均呈逐月上升趋势;在6~10月份(毛囊生长期),中国美利奴超细型皮肤ILK基因表达水平高于同期的哈萨克羊。分析认为ILK可能在调控绵羊次级毛囊生长发育过程中起一定作用。     

F1代苏香杂交猪GAS7、JHDM1A基因组织表达水平研究

[目的]研究GAS7、JHDM1A基因在组织中的表达分布情况。[方法]试验采用荧光定量PCR技术,测定了苏香杂交猪的心、肝、脾、胃、肾、脑、小肠和背最长肌在各组织的分布表达情况。[结果]GAS7基因在脑表达含量最高(5.23±2.14),在心脏中表达量最低(0.07±0.03),且与脑中的表达量呈极显著差异(P<0.01),JHDM1A基因在脑部表达含量最高(32.79±12.76),在心脏(0.18±0.08)和肝脏(0.18±0.09)中表达量最低,且与脑中的表达量呈极显著差异(P<0.01)。[结论]GAS7基因主要在脑、肝脏组织表达并发挥其生理作用,而JHDM1A基因主要在脑组织表达并发挥其生理作用,此研究结果为进一步分析GAS7基因、JHDM1A基因在肉质或生长性能方面具体的分子作用机理奠定基础。