威宁绵羊GHR基因多态性分析

为了更好地保护和开发利用威宁绵羊这一优良地方品种,本试验利用威宁绵羊构建DNA池,设计8对引物扩增威宁绵羊GHR基因外显子及部分内含子序列。将PCR产物纯化并进行双向测序,通过DNAStar和BLAST等生物软件分析确定SNP位点。利用生物信息学软件分析SNPs对GHR基因的m RNA二级结构的影响、生长激素受体二级和三级结构的改变。结果表明,在扩增的GHR基因中筛选到4个SNPs:Exon1-C~(112)T、Exon4-C~7T、Exon8-A~(27)T、Intron4-C~(27)T,其中Exon8-A~(27)T为错义突变,导致编码的异亮氨酸(Ile)变为苯丙氨酸(Phe);Exon1-C~(112)T和Exon4-C~7T位点对其编码的氨基酸没有影响,是同义突变;Intron4-C~(27)T在内含子区,不参与氨基酸编码。本研究将为更好地保护和开发利用威宁绵羊提供一些参考。     

版纳微型猪近交系 GHR 基因克隆及生物信息学分析简

目的 获得版纳微型猪近交系（BMI）生长激素受体基因（GHR）序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析.方法 以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异.结果克隆出了BMI GHR 编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114.该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸.生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p.E381D、p.A409S、p.L556V和p.A580G,均发生在胞内域.GHR基因多组织表达谱分析显示：GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低.结论 成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础.     

版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)生长激素受体基因(GHR)序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RTPCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果克隆出了BMI GHR编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p.E381D、p.A409S、p.L556V和p.A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示:GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。     

藏系绵羊BMP2基因克隆及组织表达分析

本研究旨在克隆藏系绵羊BMP2基因序列,并获得其生物学特征,同时阐明其组织表达规律。提取藏系绵羊皮肤组织的总RNA,利用RT-PCR技术克隆BMP2基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测该基因在不同组织中的表达情况。结果表明,获得藏系绵羊BMP2基因序列1 217 bp,其中CDS区长度为1 188 bp,编码395个氨基酸。BMP2蛋白有36个磷酸化位、6个糖基化位点和1个跨膜结构,属于不稳定不溶性碱性蛋白,主要在细胞核和线粒体中发挥生物学作用。藏系绵羊BMP2氨基酸序列与山羊、绵羊和牛等的氨基酸同源性很高。BMP2基因在藏系绵羊肺脏组织中表达水平最高,极显著高于其他组织(p0.01)。本研究结果将为进一步研究藏系绵羊BMP2基因的结构和功能提供参考资料。     

绵羊EGFR基因的克隆、表达及序列分析

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是酪氨酸激酶受体家族成员之一,不仅参与细胞增殖、生长和凋亡等多种生命活动,也可调节哺乳动物的乳腺发育及泌乳维持,但对绵羊EGFR基因的序列特征及组织表达情况鲜有报道.本试验以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)及低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)母羊为研究对象,利用RT-PCR、克隆及测序技术获得绵羊EGFR基因完整的CDS区,分析了 EGFR蛋白的结构特征及理化性质,利用RT-qPCR技术研究了基因的组织表达情况.结果表明,绵羊EGFR基因CDS区全长为3 627 bp,编码1 208个氨基酸.绵羊EGFR的氨基酸序列在各物种间较保守,与黄牛EGFR的氨基酸序列同源性最高.EGFR为跨膜蛋白,包含111个磷酸化位点,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.网络互作分析表明EGFR蛋白与肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、表皮调节素(EREG)、双调蛋白(AREG)及生长因子受体结合蛋白2(GRB2)结合发挥作用.EGFR主要参与MAPK,PI3K/AKT,JAK/STAT及Wnt信号通路,从而参与了动物的乳腺发育及泌乳功能的调节.RT-qPCR结果表明,绵羊EGFR基因的表达具有组织特异性、时空特异性和品种特异性.该基因在所研究的8个组织中均表达,但在肾脏、卵巢、肝脏、乳腺和肺脏组织中的表达量较高;在小尾寒羊的乳腺组织中,该基因在空怀期的表达量显著高于泌乳高峰期的(P＜0.05);在泌乳高峰期的乳腺组织中,该基因在小尾寒羊中的表达量高于甘肃高山细毛羊的.本试验为深入研究绵羊EGFR基因的泌乳生物学功能提供了基础数据.     

成年核移植山羊生长相关基因的表达分析

体细胞核移植过程有可能影响克隆动物生长相关基因尤其是印迹基因的表达水平。本研究运用同源引物 PCR 扩增、RACE 技术并结合同源克隆策略, 克隆了 7 个山羊生长相关基因包括 3 个印迹基因(H19、IGF2 和 IGF2R)和 4 个非印迹基因(IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR)的完全 CDS 或者部分 cDNA 序列, 经生物信息学技术确认后, 用荧光实时定量 PCR 对 8只成年克隆山羊中这些基因的表达水平进行分析, 结果表明 3 个印迹基因中 IGF2R 基因表达水平极显著高于对照组的自然繁殖山羊(P<0.01), 而 H19 和 IGF2 的表达则没有很大区别; 4 个非印迹基因中只有 IGF1R 的表达水平极显著高于对照组(P<0.01), IGF1、GHR 和 GHSR 的表达与对照组相似。表明即使在表型正常的成年克隆动物也存在一定的表观遗传异常。通过对获得完全 CDS 和 3′UTR 的 IGF2 基因经过生物信息学分析表明, 山羊 IGF2 基因包含一个 540 bp 的开放阅读框 (ORF)编码 179 个氨基酸。IGF2 基因 cDNA 序列和氨基酸序列以及其它基因部分序列比较分析表明, 山羊所有这些基因与绵羊的同源性要高于同牛的同源性。     

绵羊CCNG1基因克隆及表达分析

细胞周期蛋白cyclin G1(CCNG1)是一个重要的细胞周期调控因子,参与哺乳动物颗粒细胞增殖、卵母细胞成熟等繁殖生物学过程,但其在绵羊中鲜有报道。为了研究CCNG1基因对绵羊发情调控以及季节性繁殖的影响,文章对绵羊CCNG1基因进行了克隆和组织表达谱分析,利用Real-time PCR对该基因在多浪羊(常年发情)与中国美利奴羊(季节性繁殖)发情周期不同阶段性腺轴组织的表达变化进行了实时检测。获得了绵羊CCNG1基因部分cDNA序列,其中编码区全长885 bp,编码294个氨基酸。CCNG1蛋白结构经预测存在多个磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点。CCNG1基因在所检测绵羊各组织中均有表达,但在卵巢与肾脏中为高丰度表达;CCNG1在不同绵羊品种发情周期不同阶段性腺轴组织的表达变化规律基本一致,卵巢、子宫、松果体、垂体均是在发情期达到峰值。但是在发情期和发情后期卵巢CCNG1的表达量存在显著的品种间差异(P<0.01)。研究结果表明,CCNG1可能通过参与卵泡的生长发育继而达到对绵羊发情和季节性繁殖的调控。     

建鲤生长激素受体基因分离、转录子多态性以及组织表达特性

使用PCR、RT-PCR和RACE方法分离克隆了建鲤基因组内的4个jlGHRs基因,同源性分析和系统树表明它们两两分属于鱼类GHR1和GHR2,命名为jlGHR1a、jlGHR1b;jlGHR2a、jlGHR2b。jlGHR1s和jlGHR2s的两个旁系同源基因间氨基酸差异分别为5%和11%,但功能保守区FGVFS基序、Box1、Box2基本一致,jlGHR1s和jlGHR2s氨基酸差异为41%。jlGHRs和斑马鱼GHRs基因结构相同,在阅读框内存在7个内含子,两旁系同源基因间内含子长度或序列存在差异。jlGHR1s、jlGHR2s与不同鱼类GHR1、GHR2同源性高低与传统分类地位一致。实验过程中发现建鲤肝脏存在jlGHRs的多种转录子,包括丢失了外显子4的jlGHR1b’、保留了内含子3的jlGHR2a’、丢失了部分外显子8的jlGHR2as。实时定量RT-PCR组织表达结果显示4个jlGHRs在脑、肝、心、头肾、肾、肠、脾、肌肉各组织中均有表达,但表达量差异明显,其中肌肉组织中4个基因表达量均最高,脑中4个基因的表达水平相当,其余各组织中jlGHR2b的表达量均最高。从多转录子和较低表达量推测jlGHR2a所受的选择压力低于jlGHR2b。鲤鱼基因组内分离到GHR1、GHR2的两个旁系同源基因在功能基因方面证实了鲤鱼体内存在两套基因,表明鲤鱼是研究同源基因变异分化的好材料,也为今后正确查找jlGHRs基因上的SNP位点奠定了基础。     

大熊猫生长激素受体(GHR) cDNA 的克隆与序列分析

根据已报道的若干物种GHR 基因cDNA 序列设计引物, 利用RT- PCR 技术首次从大熊猫肝脏组织总RNA中扩增出GHR 基因编码区全长cDNA 序列, 克隆于pGEM®-T 载体后进行测序和序列分析。结果表明,大熊猫GHR 的ORF为1 917 bp , 编码638 个氨基酸的前体蛋白, 由18 个氨基酸的信号肽和620 个氨基酸的成熟肽组成,与人、狗、猪GHR 结构相似, 大熊猫GHR 成熟肽由246 个氨基酸的胞外区、24 个氨基酸的跨膜区和350 个氨基酸的胞内区组成, 并具GHR 的特征性结构。序列相似性比较显示, 大熊猫GHR 与哺乳类GHR 具有69 %～93 %的高序列相似性, 与爬行类和鸟类的序列相似性也达到60 % , 而与鱼类的序列相似性较低, 仅为30 %左右。与其它哺乳动物GHR 相比, 大熊猫GHR 在氨基酸序列上也存在明显的特异性。     

绵羊MHC区段3个预测基因的验证与表达分析

对新疆美利奴细毛羊基因组MHC(Major histocompatibility complex)区段细菌人工染色体(BAC)文库的DNA序列进行测定,经过序列比对分析,首次预测了约130个新基因,其中有8个CDS(Coding sequences)未在其他物种中发现其同源序列,推测可能系绵羊所特有。在此基础上,文章对绵羊MHC区段预测的3个新基因(分别命名为OaN2、OaN5、OaN6)进行了实验验证和表达分析。从绵羊肺组织中克隆到了OaN2的cDNA序列,其长度为270 bp;从肠系淋巴结中扩增得到OaN5和OaN6的cDNA序列,长度分别为309 bp和205 bp。上述3个基因的GenBank登录号分别为JF330782、JF330783和JF330784。利用Northern blotting技术进行转录本水平分析,发现这3个新基因均在免疫器官肠系淋巴结中高表达。通过Western blotting和原位免疫组化技术对OaN2蛋白水平进行了表达谱分析,结果表明OaN2蛋白在绵羊脾脏和肠系淋巴结等免疫器官中高表达,在心、肝及胰脏中不表达。这是首次通过实验验证绵羊MHC区段的3个预测的新基因,为其在绵羊免疫器官中的功能研究奠定了基础。     

Isolation, characterization, and distribution of two cDNAs encoding for growth hormone receptor in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

Growth hormone (GH) plays important roles in a vast array of physiological processes, including growth, metabolism, and reproduction. In this study, cDNAs for two unique growth hormone receptor variants were cloned and sequenced from rainbow trout. The two cDNAs, one consisting of 2920 bp and the other of 2820 bp, share 87.2% identity in nucleotide sequence and 85.5% identity in deduced amino acid sequence and presumably arose through gene duplication. The cDNAs encode for putative 593- and 594-amino acid growth hormone receptors (designated GHR1 and GHR2, respectively), each containing a single transmembrane domain and other motifs characteristic of the receptor family. Both GHR1 and GHR2 mRNAs were present in all tissues examined. Trout GHR mRNAs are differentially expressed, both in terms of abundance among tissues and in terms of abundance within selected tissues. GHR1 was more abundant than GHR2 in the brain, whereas GHR2 was more abundant than GHR1 in pancreas and spleen. These findings expand our understanding of the evolution of the GH receptor family and suggest that independent mechanisms serve to regulate the tissue-specific expression of GHR mRNAs.     

藏绵羊GHR基因5′侧翼区序列特征分析

对欧拉型藏绵羊生长激素受体(GHR)基因5′侧翼区(包括P1启动子和外显子1A)进行了T-A克隆和序列测定(GenBank accession No. EF116490), 在分析其序列结构特征的基础上与GenBank中摩弗伦羊、山羊、普通牛、欧洲野牛进行了比较基因组学和系统进化研究, 结果表明: (1)欧拉型藏绵羊GHR基因启动子P1区存在C/EBP、C/EBPb、SP1、Cap、USF、HFH-2、HNF-3b、Oct-1等多个潜在的转录因子结合位点, 可能与GHR基因的转录调控和起始以及特异表达有关。在该非编码序列中, 重复序列所占比率为2.55%, 不存在SINEs、LINEs、LTR类反转录元件和DNA转座子元件, 而发现存在一(TG)11微卫星位点; (2)在启动子P1区, 藏绵羊与摩弗伦羊、山羊、普通牛、欧洲野牛各物种间同源性大小分别为99.7%、94.2%、85.9%、86.5%; 而在外显子1A区段, 藏绵羊与摩弗伦羊、山羊、普通牛、欧洲野牛各物种间同源性大小分别为 99.0%、97.0%、92.7%、94.6%。物种间欧拉型藏绵羊与摩弗伦羊同源性最高, 而欧拉型藏绵羊与普通牛最低。(3)邻接法(即NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明, 欧拉型藏绵羊与摩弗伦羊先聚为一类, 再与山羊聚类形成一个大分支, 而普通牛和欧洲野牛先聚类形成另一大分支, 两大分支最后再聚为一起, 其聚类结果与线粒体DNA和动物学分类的研究结果一致。