荷花液泡膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆与特性分析

采用简并引物和RACE等技术从荷花中分离出液泡膜型Na＋/H＋逆向转运蛋白基因NHX1的全长cDNA序列,命名为NnNHX1。该基因全长2237bp,预测其编码一个由538个氨基酸组成的多肽,其N-端是一个由11个跨膜结构组成的疏水区域,C-端是一个亲水的尾巴。序列比对表明,NnNHX1与葡萄NHX1等的同源性较高,并且都具有高度保守的氨氯吡嗪咪结合位点序列LFFIYLLPPI。系统进化树表明NnNHX1与液胞膜型Na＋/H＋逆向转运蛋白关系较近,而与质膜型Na＋/H＋逆向转运蛋白关系较远。qRT-PCR结果显示NnNHX1基因在植株中属于组成型表达,但经NaCl诱导后,根中NnNHX1的表达量急剧增高后又迅速下降,而叶中的表达量却先缓慢增加后又剧烈下降。     

NaCl处理对盐地碱蓬开花及Na＋、K＋含量的影响

为探讨盐地碱蓬（Suaeda salsa）开花与盐的关系, 研究了1 （对照）、200和400 mmol·L-1 NaCl处理对盐地碱蓬不同分枝和单株开花数目、叶片和茎及花器官中的Na＋、K＋含量及Na＋/K＋比的影响。结果表明： 与对照相比, 200 mmol·L-1 NaCl处理下盐地碱蓬分枝及单株开花数目增加最显著, 单株开花数目增加了69.90%, 花器官中的Na＋含量、Na＋/K＋比分别增加了1.41倍和1.77倍, 而一级叶片的Na＋含量、Na＋/K＋比分别增加了3.96倍和4.96倍, 茎中Na＋含量、Na＋/K＋比分别增加了7.00倍和12.39倍。400 mmol·L-1 NaCl处理下, 单株开花数目增加了19.00%, 花器官中的Na＋含量、Na＋/K＋比分别增加了2.09倍和3.21倍, 而一级叶片的Na＋含量、Na＋/K＋比分别增加了4.28倍和6.50倍, 茎中Na＋含量、Na＋/K＋比分别增加了7.65和15.40倍。这些结果表明, NaCl处理下真盐生植物盐地碱蓬可能通过把Na＋区域化到茎叶而动员其中的K＋到花器官中维持花器官中合适的Na＋/K＋比而促进开花。     

NaCl胁迫对杂交狗牙根品种‘苏植2号’和‘Tifgreen’生长及Na＋和K＋积累的影响

对0（对照）和20g·L-1NaCl胁迫条件下杂交狗牙根（Cynodondactylon×C.transvaalensis）品种‘苏植2号’（‘SuzhiNo.2’）和‘Tifgreen’不同部位的生长状况以及Na＋和K＋积累的差异进行了研究,并分析了2个品种间Na＋、K＋转运调控机制的差异。结果显示：在NaCl胁迫条件下,2个品种的叶片相对枯黄率、地下茎和根系的相对干质量、叶片和根系的Na＋含量和Na＋/K＋比以及钠钾选择性转运系数增加;修剪茎叶及冠层和地上部的相对干质量、植株相对总干质量以及叶片和根系的K＋含量均降低,但茎叶含水量无显著变化。NaCl胁迫条件下,不同土层中2个品种的根系相对干质量均不同程度增加,且20-40和40-60cm土层中根系干质量的增幅大于0-20cm土层;在0-20cm土层中2个品种根系的分配比例均有所降低,而在20-40和40-60cm土层中则不同程度提高。与‘Tifgreen’相比,NaCl胁迫条件下‘苏植2号’叶片相对枯黄率、Na＋含量和Na＋/K＋比更低,修剪茎叶及冠层和地上部的相对干质量、植株相对总干质量、叶片K＋含量和钠钾选择性转运系数更高;在20-40和40-60cm土层中‘苏植2号’根系相对干质量显著高于‘Tifgreen’,根系分配比例总体也高于‘Tifgreen’。综合比较结果表明：‘苏植2号’的抗盐性强于‘Tifgreen’,可能与其深层根系分配量更高和钠钾选择性转运能力较强有关。     

盐碱胁迫下碱地肤Na+/H+逆向转运蛋白基因KsNHX1表达分析

利用RACE技术得到碱地肤KsNHX1的3'cDNA序列,分子系统进化分析显示,KsNHX1为液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白编码基因.通过半定量RT-PCR检测了该基因在盐碱胁迫下的表达,结果表明:200 mmol·L-1 NaCl胁迫2～24h,KsNHX1在叶片中表达量持续增加;200 mmol·L-1 NaCl处理10 h,KsNHX1在根、茎、叶和花中的表达都上调;不同浓度NaCl处理下,叶片中KsNHX1表达上调,160 mmol·L-1时达到最高;低于400 mmol·L-1浓度下,根中该基因的表达也都上调.经不同浓度Na2CO3胁迫,根中KsNHX1的表达变化趋势与相应浓度NaCl胁迫下的变化相同;但叶片中除160 mmol·L-1 Na,CO3处理下KsNHX1表达略有上调外,其他浓度下KsNHX1的表达都低于对照.KsNHX1的表达模式暗示,在不同盐碱胁迫下,碱地肤能够维持体内相对稳定的K+/Na+,其耐盐特性可能与Na+/H+逆向转运蛋白的作用密切相关.     

盐胁迫下盐角草 Na ＋／H ＋转运基因表达分析

Na＋/H＋逆向转运蛋白具有调节细胞内离子浓度及维持pH值稳定的作用,是植物抵御盐胁迫的重要因子。从盐角草RNA-Seq数据中筛选Na＋/H＋逆向转运蛋白序列,利用生物信息学手段,拼接得到5条Na＋/H＋逆向转运蛋白完整cDNA序列,通过与NCBI已有序列比对分析,将其命名为SeNHX1、SeNHX3、SeNHX4、SeNHX5和SeN-haD。考察盐角草Na＋/H＋逆向转运蛋白在两种盐分变化情况下的表达变化：1）从无盐处理转移到200 mM NaCl处理;2）从200 mM NaCl培养基转移到无盐培养基。结果表明：SeNHX4的表达量非常低,在地下部几乎检测不到;SeNhaD在地上部的表达量是地下部的2倍左右,说明NhaD主要在盐角草地上部发挥作用;SeNHX1、SeNHX3和SeNHX5的表达量明显高于其他两个基因,对盐角草的耐盐机制起到更大的作用,并且SeNHX1和SeNHX5受盐分诱导表达,表达量与盐浓度呈正相关,可能在盐角草耐盐调控网络中发挥重要作用。综上,NHX基因家族和NhaD的表达量受到基质中盐分的调控作用,其表达在盐分处理或者盐分去除1～3d后发生变化。研究结果有助于阐明盐角草NHX基因家族和NhaD对盐分的响应特点。     

新疆无苞芥Na~+/H~+逆向转运蛋白基因OpNHX1的克隆、表达分析与功能验证

从耐盐植物无苞芥中克隆获得了1个Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,命名为OpNHX1(GenBank登录号:KC200248)。OpNHX1基因cDNA全长2 153 bp,包含一个1 605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。系统进化树分析表明,OpNHX1编码产物与拟南芥、小盐芥亲缘关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在无苞芥根、茎、叶、花和荚果中均有表达,其中茎中表达量最高。半定量RT-PCR分析表明,该基因受高盐、干旱、低温及ABA的诱导上调表达。进一步将该基因在拟南芥中过量表达,显著提高了转基因植株在盐胁迫下的存活率,说明OpNHX1基因参与了植物的耐盐性。酵母功能互补试验结果显示,该基因转化酵母Δnhx1后可以补充NHX1的缺失,表明OpNHX1参与Na+/H+的转运。     

二色补血草液泡膜H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个V-H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因全长cDNA序列。该基因全长为729bp。其中,开放读码框（ORF）为498bp,编码165个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为16.6kDa,理论等电点为8.62。用实时定量RT-PCR方法进一步研究二色补血草在NaCl、NaHCO3和NaCO3胁迫下的不同时间内该基因表达模式的结果表明,NaCl强烈诱导二色补血草叶组织中LbVHA-C基因的表达,但其根部的表达变化不明显。NaHCO3胁迫下LbVHA-C基因在根部组织的表达受抑制。Na2CO3胁迫24h时的LbVHA-C基因在根和叶部组织中的表达都强烈受抑制,随后在根和叶组织的表达量逐步升高。     

拟南芥谷氧还蛋白GRXC9负调控叶片大小

谷氧还蛋白(GRX)是一类以CXXC/S基序为活性位点的小分子热稳定蛋白,参与多种谷胱甘肽依赖的氧化还原反应。通过对该家族的GRXC9基因进行克隆、表达、亚细胞定位及功能分析,结果表明,GRXC9基因表达无组织特异性,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)的根、茎、叶、花和角果中均能表达,此结果与GUS显色结果基本一致。GRXC9-GFP定位于细胞质和细胞核中,过表达GRXC9的株系叶片明显小于野生型;进一步观察发现,其叶片栅栏细胞明显变小,而细胞总数与野生型差距不大。叶片大小相关基因的表达分析结果表明,过表达株系中AN、LNG1和LNG2的表达量明显下降,说明GRXC9可能通过抑制这些基因的表达从而导致叶片短小。综上所述,GRXC9可能在调控叶片发育方面发挥关键作用。     

农杆菌介导转AtNHX1基因杨树的获得

采用根癌农杆菌介导法,将拟南芥Na＋/H＋逆向转运蛋白（Na＋/H＋ antiporter）基因（AtNHX1）转入杨树.建立了杨树的继代及高频再生系统.经抗生素筛选,对再生植株进行PCR检测、PCR产物基因测序和杨树基因组DNA的Southern检测,证实已获得126株转AtNHX1基因的杨树植株.     

NaCl胁迫对滨梅扦插苗生物量和水分积累的影响

以1年生滨梅(Prunus maritima Marshall)扦插苗为实验材料,在盆栽条件下用质量浓度为0.15%、0.29%、0.58%、0.88%、1.17%、1.46%的NaCl溶液进行盐胁迫处理,测定胁迫后根、茎、叶Na+、K+含量以及全叶、一年生茎、二年生茎和根系生物量、含水率、根系活力变化,探讨滨梅的抗盐胁迫机制。结果显示:(1)盐胁迫80d后,随着盐胁迫强度提高,滨梅植株根、茎、叶Na+含量显著提高,而其根、茎K+含量显著降低,根、茎、叶K+/Na+值显著降低;根Na+含量在低于0.58%NaCl胁迫下显著高于茎、叶,而在高于0.58%NaCl胁迫下却表现为叶Na+含量显著高于根、茎。(2)滨梅根、茎、叶生物量均随盐胁迫强度的提高呈先增加后减少的趋势;随着盐胁迫时间的延长,茎、叶生物量在低于0.58%NaCl胁迫下均呈积累趋势,且茎生物量在0.58%NaCl胁迫下显著提高,而根、一年生茎、叶生物量在高于0.58%NaCl胁迫下均显著下降。(3)滨梅茎、叶含水率均随盐胁迫强度的增加呈先增加后减少的趋势,而随着胁迫时间的延长呈逐渐减少趋势;根系活力及根含水率均随盐胁迫强度的提高而增加,但根含水率随着胁迫时间的延长变化不明显。由此可见,滨梅能通过根系稀释并蓄积Na+,保护地上部分正常生长,当进入根系的Na+量超过吸收阈值时,Na+迅速在叶中积累储存,且叶中较高含量的K+对Na+形成了有效的缓冲。     

周期性张应力对面颌肌细胞Na~＋/K~＋-ATPase的影响

目的：研究周期性张应力对Na＋/K＋-ATPase功能活性及其表达的影响,明确Na＋/K＋-ATPase在功能矫形中面颌肌肉适应性改建的生物和分子机制。方法：构建面颌肌细胞体外培养-力学刺激模型;应用多通道细胞牵张应力加载系统,对面颌肌细胞施加不同时段的张应力刺激,测定Na＋/K＋-ATPase的功能活性;运用实时荧光定量PCR研究周期性张应力刺激对Na＋/K＋-ATPase功能亚基α亚单位mRNA的影响。结果：Na＋/K＋-ATPaseα1,α2亚单位随着加力时间延长,表达增强,同对照组比较,呈一致性上调（P〈0.001）;细胞加力1小时,α1的mRNA表达不受影响;加力2小时后,α1和α2的mRNA表达呈现逐渐增强趋势,48 h时达到最大值。张应力刺激对α2亚单位的mRNA表达似乎更为敏感,加力1 h时α2亚单位的mRNA表达水平即增加,增加量约为对照组的37.74%,具有显著的统计学意义。结论：周期性的机械牵张作用于培养的骨骼肌细胞,可诱导α1和α2亚单位mRNA的表达量增加;α1和α2亚单位对周期性张应力刺激的作用时间反应不同,α2亚单位的反应可能更为敏感。周期性张力刺激的增加所产生的压力可能是转录调节的主要因素;周期性张应力对骨骼肌细胞Na＋/K＋-ATPase水解亚的调节作用不同,可能在面颌肌肉对功能矫形力的适应性改建中具有重要作用。     

AM真菌提高烟草钾含量机制的初步研究

以烟草和AM真菌菌株摩西球囊霉（Glomous mosseae,G.m）为材料,研究了不同外界K＋浓度条件下AM真菌对烟草生长、K＋含量以及根中K＋-通道基因NtKT1、NtKT2和转运体基因NtHAK1、NtHA1相对表达量的影响。结果表明,在低钾和常钾条件下,接种G.m均可提高烟草的株高,增加根系长度,提高烟草根部和叶片中的K＋含量,在低钾条件下接种G.m使烟草根部和叶片的K＋含量分别提高了50.5%和24.5%。在常钾条件下,接种G.m 50 d后烟草根系中NtKT1和NtKT2的相对表达量显著提高;而低钾条件下,钾转运体基因NtHAK和NtHA1的相对表达量显著升高。由此推测,AM真菌能够调控烟草根中K＋-通道基因和钾转运体基因的表达进而促进其对K＋的吸收。     

拟南芥AtMGT3基因转运功能研究

对拟南芥AtMGT3基因的M矿转运功能进行了初步研究．AtMG73转录本的半定量分析表明。AtMG73在根、茎、叶、花、角果中均有表达,但在花中表达量最高,根中最少．MM281功能互补和液体生长曲线结果表明：At-MGT3功能互补细菌Mg^2＋转运突变株,具有Mg^2＋转运能力;AtMGT3介导Mg^2＋的低亲和性吸收,是一个低亲和性Mg^2＋转运蛋白;AtMGT3可能还能转运Fe^2＋,但转运Fe^2＋浓度超出了正常的生理浓度．在正常生理条件下．AtMGT3的主要生理功能是作为Mg2＋转运蛋白起作用．     

周期性张应力对面颌肌细胞Na~＋/K~＋-ATPase功能活性影响

目的：本研究在成功构建面颌肌细胞体外培养一力学刺激模型的基础上,探讨机械张应力对细胞内Na＋水平和面颌肌细胞Na＋/K＋-ATPase功能活性的影响。方法：本实验采用Blua法,对SD大鼠乳鼠面颌肌细胞进行体外原代培养、鉴定并绘制生长曲线;取第3代细胞接种于细胞加力板上,采用Forcel四点弯曲加力装置,对细胞分别施加1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h和48 h的张应力刺激,后测定细胞内Na＋水平变化和Na＋/K＋-ATPase功能活性改变。结果：（1）Na＋水平变化：与对照（不加力）组相比,加力1h细胞内Na＋显著增加（P〈0.05）,并随加力时间延长逐渐降低,加力至12h时降到正常水平,再延长加力时间Na＋无明显变化。（2）Na＋/K＋-ATPase功能活性变化：分别施加不同时间的周期性张应力后,Na泵的活性在加力8小时后才开始增加（0.5725mmolPi/mgPr.hr）,随加力时间延长进一步增加,48小时后达到最大值（0.8963mmolPi/mgPr.h）。结论：周期性张应力刺激会引起细胞内Na＋的改变,并可以增加骨骼肌细胞Na＋/K＋-ATPase的活性。     

重组人BMP-2在烟草不同组织中的表达

骨形态发生蛋白（BMPs）是一类调节骨组织发育的生长因子。BMP-2是BMP家族中诱骨活性最强的。在骨组织工程研究和临床应用中需要大量的BMP-2。因此,研究出一种能够有效地大量生产BMP-2的方法是十分必要的。随着植物分子生物学的进展,转基因植物被用作一种生物反应器来生产目的蛋白。以gus作为报告基因,研究了重组人bmp-2基因在烟草中的表达。通过GUS活性检测、半定量PCR和Western blotting分析了根、茎、叶组织中基因表达的水平,结果显示融合蛋白在根和茎组织中表达量显著高于叶组织。由于根和茎组织中蛋白组成与叶组织相比相对简单,提示其更易于进行目的蛋白的纯化。     

Leukamenin E调节拟南芥幼苗根部生长素极性运输及根系生长发育

本文采用14种拟南芥转基因报告株系,研究了对映-贝壳杉烷二萜(leukamenin E)调节拟南芥根部生长素极性运输转运蛋白表达并影响根生长发育的机制。结果表明:leukamenin E浓度在20～40μmol·L~(-1)范围显著抑制拟南芥幼苗主根的生长,较低浓度leukamenin E(10μmol·L~(-1))促进侧根提前发生并增加侧根数量; 10～30μmol·L-1的leukamenin E在处理拟南芥幼苗48 h后可显著提高其根尖部生长素水平;进一步检测根部生长素极性运输转运蛋白表达,发现该浓度条件下leukamenin E促进PIN1在转录水平表达并增加其蛋白丰度,但在转录水平抑制PIN2表达并减少其蛋白丰度;同时,显著减少PIN3、PIN7和PIN4蛋白在小柱和静止中心及其周围细胞的丰度以及AUX1的定位丰度; Leukamenin E对PIN1丰度的上调以及对PIN2、PIN3、PIN4、PIN7和AUX1定位丰度的减少可导致生长素在根尖顶部的积累以及根部生长素浓度梯度的改变,引起根生长的抑制及侧根的提前发生。     

菘蓝CYP83B1基因的克隆与表达分析

对菘蓝（Isatis indigotica Fort.）CYP83B1基因进行了克隆与表达模式分析。结果显示,IiCYP83B1基因全长为1652 bp,包含2个外显子和1个内含子;cDNA全长为1500 bp,编码499个氨基酸。IiCYP83B1编码的蛋白没有跨膜结构域和信号肽,主要定位于内质网膜,属于亲水性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲螺旋和α-螺旋组成,与萝卜（Raphanus sativus Linn.）、欧洲油菜（Brassica napus L.）、甘蓝（Brassica oleracea L.）和芜菁（Brassica rapa L.）等植物的CYP83B1蛋白具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果表明,IiCYP83B1基因在菘蓝的根、茎、叶、花和果中均有表达,且以叶中的表达量最高;在幼苗期、生长期和花期稳定表达且均显著高于萌芽期;茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和葡萄糖（glucose,Glu）能够显著促进该基因的表达,而低温（4℃）和水杨酸（salicylic acid,SA）处理对其表达具有一定的抑制效应。本研究结果可为进一步探讨IiCYP83B1基因的功能提供参考。     

花烟草NaNHX1基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达模式

植物NHX家族基因,在植物的生长发育以及生物与非生物胁迫的应答反应中发挥着十分重要的作用。为了探究花烟草Na+/H+逆向转运蛋白的生理功能,为花烟草耐盐分子机制的研究提供参考。采用同源克隆的方法进行基因克隆,对花烟草进行非生物胁迫,并运用qPCR的方法进行基因表达模式分析。结果表明,从花烟草(Nicotiana alata)中克隆了一个属于Na+/H+逆向转运蛋白家族的基因NaNHX1。该基因的开放阅读框全长为1 599 bp,编码了532个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白分子量为58.4 kD,等电点为5.66;具有Na+/H+逆向转运蛋白家族典型的保守结构域NhaP2;该蛋白属于疏水性蛋白,包含10个跨膜区。NaNHX1基因主要定位于细胞质膜,并含有多个磷酸化位点。同源性分析的结果显示,NaNHX1基因与美花烟草(Nicotiana sylvestris)、茸毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)以及番茄(Solanum lycoperisicum)NHX基因的亲缘关系最近,而与拟南芥的NHX基因同源性最低。NaNHX1基因的表达具有组织表达特异性,花中表达量最高,茎中次之,根和叶中表达量较低。在高盐、干旱、低温、ABA、低钾及H2O2等非生物胁迫下,NaNHX1的表达呈现3种不同的表达模式。其中,对高盐及低钾胁迫的响应强烈。本研究的结果表明,NaNHX1基因属于Na+/H+逆向转运蛋白家族,可能参与了花烟草高盐和低钾胁迫,以及其它非生物胁迫响应在内的众多生理过程。     

毛竹实时荧光定量PCR内参基因的筛选及成花基因PheTFL1表达分析

通过qRT-PCR对毛竹相关成花基因PheTFL1的表达进行研究,为毛竹开花机理的研究提供理论依据.从毛竹UBC18、PP2A和EF1α等9个候选内参基因中筛选出在叶、幼嫩花序、花序轴、枝、竹青等11个组织器官中都稳定表达的PP2A用于毛竹PheTFL1基因qRT-PCR结果的校正.结果显示:PheTFL1基因在开花竹叶、枝和竹青中低丰度表达,与未开花竹差异不显著,但在花和花序轴中高丰度表达;在实生苗叶和根中高丰度表达,在实生苗茎中低丰度表达.PheTFL1基因在具有分生能力的幼嫩组织中高丰度表达,说明其不仅参与花发育的调控,还参与了分生组织生长的调控.     

烟草磷转运蛋白基因NtPHT2;1的克隆和表达分析

植物对磷酸盐的吸收与利用主要依靠磷转运蛋白,其中PHT2家族编码的低亲和磷转运蛋白主要负责植物在正常供磷条件下磷酸盐的吸收、转运与再利用。为了探究低亲和磷转运蛋白基因NtPHT2;1在烟草转运磷酸盐中的作用和表达模式,本研究以普通烟草K326的cDNA为模板,克隆得到NtPHT2;1,对该基因进行生物信息学分析和蛋白质的亚细胞定位,并通过荧光定量PCR技术对该基因在低磷等非生物胁迫下的基因表达模式进行分析。结果表明：（1）NtPHT2;1基因的全长为1 764 bp,编码587个氨基酸。（2）亚细胞定位结果表明,NtPHT2;1蛋白定位于叶绿体上。（3）同源性比对发现,NtPHT2;1蛋白与辣椒CaPHT2;1蛋白的同源性最高达到91.00%。（4）启动子分析表明,NtPHT2;1启动子含有参与调控植物衰老、逆境胁迫相关的顺式作用元件。（5）组织表达模式分析表明,NtPHT2;1在叶片中的表达量最高,新叶中的表达量比老叶中的高;在低磷诱导条件下,该基因的表达量与正常条件相比差异不显著。（6）不同非生物胁迫下的表达模式表明,在盐胁迫和干旱胁迫下,该基因的表达量显著降低。研究认为,NtPHT2;1基因主要是负责烟株正常生长发育条件下磷酸盐的转运与利用。