gas6基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定

目的:制备携带生长停滞特异性基因6(gas6)的慢病毒,并构建和鉴定稳定表达生长停滞特异性蛋白6(GAS6)的小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)。方法:采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs,用流式细胞术检测MSCs标志分子;根据Gen Bank中小鼠gas6基因序列设计并合成上下游引物,以MSCs提取的m RNA制备的c DNA为模板扩增gas6基因片段,克隆入慢病毒表达载体,获得Lenti-gas6-GFP-zeocin质粒并测序鉴定;采用三质粒包装系统(穿梭质粒p Lenti-gas6-GZ、包装质粒p SPAX2和p MD2.G)包装慢病毒,并验证其表达目的基因情况;将浓缩的慢病毒离心感染第4代MSCs,用吉欧霉素(zeocin)筛选培养后获得稳定表达GAS6的MSCs,采用流式细胞术检测其阳性率以及表面标志分子表达情况。结果:构建了携带gas6基因的慢病毒,建立了gas6基因修饰的MSCs。结论:慢病毒载体可介导gas6基因在小鼠MSCs中过表达,且不会干扰MSCs的生物特性,为进一步研究gas6基因修饰的MSCs的治疗作用奠定了实验基础。     

大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用, 构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs (rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列, 设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面, 产生pRiCXCR4, 将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP, 产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞, 包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后, 用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示, 酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确, 产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP, 未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后, 与空载体组和空白组相比, 3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达, CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%, 抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功, 为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。     

SDF-1/CXCR4信号通路介导的低浓度过氧化氢对间充质干细胞促增殖、迁移作用及其机制

该文探讨了低浓度过氧化氢(H_2O_2)对骨髓间充质干细胞增殖、迁移及其相关信号通路的影响,阐明了低浓度H_2O_2发挥生物学效应的分子机制,为临床应用提供了可靠的实验证据。通过差速贴壁分离培养小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)。流式细胞术鉴定第三代BMSCs表面标志物。采用随机数字表法分组,以不同低浓度H_2O_2(0、25、50、100、150、200μmol/L)处理BMSCs 24 h,应用甲氮甲唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测干细胞表面标志物以及凋亡率,划痕实验和Transwell实验检测H_2O_2对细胞迁移能力的影响。Western blot检测细胞老化相关蛋白质p16和Cyclin D1、基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)与其受体CXCR4(CXC chomekine receptor 4)的表达以及相关下游信号通路PI3K/AKT/mTOR关键蛋白质的表达。流式细胞术检测结果显示,BMSCs细胞表面分化抗原CD29、CD44为阳性,CD34、CD45为阴性。MTT检测结果显示,与对照组相比,25和50μmol/L H_2O_2能有效促进BMSCs增殖(P0.05)。划痕实验和Transwell实验检结果显示,50μmol/L H_2O_2处理细胞能促进其迁移能力。流式细胞术检测显示,25、50和100μmol/L H_2O_2对干细胞凋亡无影响,150和200μmol/L H_2O_2则显著促进细胞凋亡(P0.01);25和50μmol/L低浓度H_2O_2处理干细胞能抑制老化相关蛋白质p16表达下降(P0.05,P0.01),相反,细胞周期蛋白Cyclin D1表达则显著升高(P0.05,P0.01),H_2O_2为200μmol/L时,p16表达上调(P0.01),而Cyclin D1下调(P0.01);同样,25~100μmol/L H_2O_2能增强细胞SDF-1和CXCR4的表达(P0.05)以及上调下游信号通路关键蛋白质PI3K、AKT、mTOR的磷酸化水平(P0.05)。结果表明,低浓H_2O_2度通过活化干细胞SDF-1/CXCR4信号轴,活化其下游PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进干细胞增殖和迁移。     

shRNA慢病毒表达载体对肝癌细胞HepG2中CXCR7表达的影响

目的:探讨趋化因子受体7(Chemokine receptor7,CXCR7)的短发夹RNA(a small hairpin Ribonucleic acid,shRNA)慢病毒表达载体对人肝癌细胞HepG2中CXCR7表达的影响.方法:合成4个针对CXCR7靶基因序列的shRNA,分别与Age Ⅰ和EcoRl酶切后的pGCSIL-RFP载体连接,构建CXCR7的shRNA慢病毒表达载体pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA;构建含有CXCR7互补DNA(complementary DNA,cDNA)的真核过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-CXCR7,与pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA共转染HEK293T细胞,筛选具有显著敲减作用的CXCR7-shRNA;将具有显著敲减作用的pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(Human embryonic kidney cells,HEK293T)产生慢病毒颗粒LV-CXCR7-shRNA,并将纯化的慢病毒颗粒感染人肝癌HepG2细胞,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)分别检测CXCR7信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的沉默效果.结果:聚合酶链反应(Polymerasechain reaction,PCR)鉴定及测序结果表明成功构建4个CXCR7的shRNA慢病毒表达载体,并筛选出具有显著敲减作用的pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA2;包装含有CXCR7一shRNA2的慢病毒颗粒LV-CXCR7-shRNA2(病毒滴度为3x 109TU/ml),感染HepG2细胞,CXCR7mRNA和蛋白的表达水平下调.结论:成功构建靶向CXCR7基因的shRNA慢病毒表达载体,可有效抑制人肝癌HepG2细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达.     

LMP-1单链抗体基因修饰人外周血单个核细胞的构建及鉴定

目的:构建携带抗-1型潜伏膜蛋白(anti-LMP-1)的单链抗体序列的过表达载体并包装慢病毒,构建及鉴定LMP-1单链抗体基因修饰的人外周血单个核细胞(PBMCs)。方法:根据Gen Bank中LMP-1单链抗体、CD28及CD3ζ序列设计引物并合成,从已有pVitro-IgG-1载体钓取IgG-1-Fc段,并分别插入慢病毒表达载体,获得p CDH-anti-LMP-1-IgG-Fc-CD28-CD3ζ(CAR)及pCDH-CD28-CD3ζ(对照VEC)并测序鉴定,测序成功后采用三质粒包装系统(核心质粒pCDH、包装质粒pSPAX2和pMD2.G)分别包装慢病毒CAR及VEC;浓缩慢病毒并离心感染PBMCs,经荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并利用流式细胞术检测GFP+比率以鉴定目的蛋白的表达。结果:构建了过表达LMP-1单链抗体基因的质粒并成功包装慢病毒,浓缩慢病毒感染PBMCs后GFP+细胞数可达42.5%(VEC-PBMCs)及51.0%(CAR-PBMCs)。结论:为进一步研究anti-LMP-1修饰的PBMCs对LMP-1阳性肿瘤细胞的靶向杀伤奠定了实验基础。     

敲低CXCR4表达抑制胃癌细胞HGC27的增殖

目的:初步探索CXCR4与胃癌细胞HGC27增殖的关系。方法:构建携带CXCR4短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体质粒,并转染至293T细胞中,48 h后收集上清感染HGC27细胞,用Western印迹鉴定其干扰CXCR4蛋白表达的效果,采用CCK8实验检测敲低CXCR4表达对HGC27细胞增殖的影响。结果:双酶切鉴定和基因测序表明敲低CXCR4慢病毒载体质粒构建成功;慢病毒感染后有效抑制HGC27细胞中CXCR4蛋白水平,敲低CXCR4表达对HGC27细胞增殖有显著的抑制作用。结论:CXCR4参与了胃癌细胞HGC27的增殖,提示CXCR4有望成为一个新的胃癌治疗靶点。     

CXCR4慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的：构建趋化因子CXC亚族CXCR4的慢病毒表达载体并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达。方法：用逆转录PCR方法获取CXCR4基因编码区片段,将构建的慢病毒载体质粒pLVTHM-EGFP-CXCR4与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染293T细胞,包装生产慢病毒。用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）,后采用Real time PCR检测CXCR4 mRNA、Western Blot方法检测蛋白质的表达。结果：PCR、酶切和测序结果表明成功的构建了CXCR4基因重组慢病毒载体。同时用该慢病毒载体转染MSCs后可有效地增加MSCs中CXCR4的表达。结论：成功构建了CXCR4的慢病毒表达载体并能在MSCs中表达,为进一步研究其在干细胞移植中的应用奠定基础。’     

RNAi沉默CXCR7对人结肠癌细胞SW620特异性靶向抑制的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法:(1)设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;(2)将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7 mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验表达载体;(3)MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;(4)通过细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;(5)Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果:(1)测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别为3.16×108TU/ml、4.27×108TU/ml、3.93×108TU/ml和2.95×108TU/ml;(2)3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7 mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P0.05);(3)CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有显著性差异(P0.05);(4)SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,有统计学意义(P0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,有统计学意义(P0.05);(5)CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P0.05)。结论:CXCR7-shRNA慢病毒表达载体转染SW620细胞后可有效下调CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平并能够抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,为下一步研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的结直肠癌慢病毒基因沉默治疗打下了良好的基础,为结直肠癌的基因治疗提供了新方向。     

慢病毒介导神经生长因子过表达诱导脐带间充质干细胞向神经元样分化

目的探讨神经生长因子(NGF)过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞(UMSCs)对细胞分化的影响。方法分离培养UMSCs,流式细胞术鉴定后利用慢病毒载体感染细胞,使其过表达NGF,72h后,通过免疫荧光检测NGF和GFP的表达,Western blot检测NGF蛋白表达水平,ELISA法检测细胞上清液NGF的含量,qRT-PCR检测相关神经因子基因的表达。结果流式细胞术显示细胞表面CD105、CD90、CD73阳性而CD34、CD45、CD19和CD14阴性,鉴定为脐带间充质干细胞。慢病毒转染后细胞NGF和GFP阳性,细胞内NGF和培养液中b-NGF含量都显著性增加,NGF、nestin、GFAP、MAP2及tubulin等mRNA的表达显著性增加。结论神经生长因子过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞会促使细胞向神经元样细胞分化,可应用于后续研究。     

高表达CXCR4/CXCR7对小鼠胚胎肝干细胞增殖、迁移和抗氧化应激损伤的影响

该研究探讨了基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)/趋化性细胞因子受体4(chemotaxis cytokine receptor 4,CXCR4)和SDF-1/趋化性细胞因子受体7(CXCR7)对小鼠胚胎肝干细胞14-19(HP14-19)增殖、迁移和抗氧化应激损伤的影响。重组腺病毒Ad-CXCR4和Ad-CXCR7感染HP14-19细胞,流式细胞术和Western blot检测细胞膜上CXCR4/CXCR7受体的表达;MTT法检测细胞增殖;Transwell法检测细胞迁移;过氧化氢(H2O2)处理细胞,建立氧化应激损伤模型,MTT法检测细胞活力;酶学法检测乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。结果显示,感染腺病毒Ad-CXCR4/CXCR7后,HP14-19细胞膜CXCR4/CXCR7受体水平显著上调;高表达CXCR7可增强细胞增殖活性,而高表达CXCR4对细胞增殖活性无显著效果;高表达CXCR4或CXCR7可显著增强SDF-1诱导的HP14-19细胞的迁移和氧化应激状态下的细胞存活率,其中,CXCR7对迁移效应较强;与对照组比较,高表达CXCR4或CXCR7可降低H2O2造成的细胞LDH活性,增强SOD活性。因此,CXCR4参与了SDF-1诱导的HP14-19细胞增殖作用,且CXCR4/CXCR7介导SDF-1诱导HP14-19细胞的迁移和抗氧化应激损伤作用。     

Oxygen Dependence of Elongation Growth and Oxygen Uptake in Maize Coleoptiles

Auxin-mediated elongation growth of maize coleoptile segments is inhibited by reducing the O₂ concentration in the incubation medium to GT 100 μmol . 1^?1. The half-maximal elongation rate is reached at 40 μmol . 1^?1 O₂, i.e. about two orders of magnitude higher than with mitochondrial respiration. O₂ uptake of the segments measured under similar conditions with an O₂ electrode shows a very similar dependence on O₂ concentration. Auxin increases O₂ uptake by 5–10% when it induces growth. About 40% of the O₂ uptake is insensitive to inhibition by KCN. Auxin has no effect on O₂ uptake in the presence of KCN. The possibility that auxin-mediated elongation growth depends on a KCN-sensitive oxidative process, other than cytochrome c oxidase-catalyzed respiration, is discussed.     

超临界CO2技术萃取蛋黄磷脂

采用新型物理分离技术──超临界CO₂萃取法,提取天然蛋黄粉中的磷脂.在40MPa,先去除蛋黄粉中甘油三酯和胆固醇,再萃取磷脂.结果显示,磷脂纯度为95%,N/P比值为1.003,λ_max=214nm,薄层层析显示磷脂着色点清晰,并去除了绝大部分甘油三酯和胆固醇.此法操作简单、产品质量高、安全和不污染环境,还可得到天然纯蛋黄油和蛋白.     

Direct regulation of IL-2 by curcumin

Interleukin-2 (IL-2) is a crucial growth factor for both regulatory and effector T cells. Thus, IL-2 plays a critical role in the stimulation and suppression of immune responses. Recently, anti-IL-2 antibodies (Abs) have been shown to possess strong IL-2 modulatory activities by affecting the interaction between IL-2 and IL-2 receptors. In this study, we screened an herbal library to identify a compound that regulates IL-2, which resulted in the identification of curcumin as a direct binder and inhibitor of IL-2. Curcumin is a phytochemical with well-known anti-cancer properties. In this study, curcumin mimicked or altered the binding pattern of anti-IL-2 Abs against IL-2 and remarkably inhibited the interaction of recombinant IL-2 with the IL-2 receptor α, CD25. Interestingly, curcumin neutralized the biological activities of IL-2 both in vitro and in vivo. In this report, we elucidated the unsolved mechanism of the anti-cancer effect of curcumin by identifying IL-2 as a direct molecular target. Curcumin, as a small molecule IL-2 modulator, has the potential to be used to treat IL-2 related pathologic conditions.     

乳腺癌转移中的磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱分析

我们以前曾报道花生四烯酸（arachidonic acid,AA)代谢产物可以促进乳腺癌细胞增殖和迁移。为了进一步寻找维持高转移乳腺癌细胞中AA高水平代谢的内源机制,深入探求AA代谢促进乳腺癌细胞转移的分子机理,我们应用HPLC/ESI/MSⁿ技术检测和分析了乳腺癌MCF-7和高转移乳腺癌LM-MCF-7细胞中溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholines,LysoPCs）和磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines,PCs）的成分和含量。我们发现了10种LysoPC的含量在LM-MCF-7细胞中显著高于MCF-7细胞,有6种PC可水解产生AA,它们在LM-MCF-7细胞中的含量显著低于MCF-7细胞,提示这些溶血磷脂含量的升高和磷脂含量的降低可能与乳腺癌转移相关。在LM-MCF-7细胞中,COX-2抑制剂吲哚美辛（indomethacin,Indo）和LOX抑制剂（nordihydroguaiaretic acid,NDGA）共同作用可明显下调cPLA2的活性,应用HPLC-ESI-MSⁿ技术比较cPLA2活性下调前后LM-MCF-7细胞中LysoPC和PC含量的变化,发现其中4种PC可被cPLA2水解产生AA。我们还发现,细胞内LysoPC与PC的比值可以反映cPLA2的活性。通过以上研究我们进一步证实了由cPLA2活性调节的AA释放及代谢对乳腺癌转移具有重要作用。     

创伤性脑损伤对大鼠海马骨架蛋白及学习记忆功能影响

创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是极为常见的外伤性疾病,致死率和致残率很高。存活者伴随的空间认知功能障碍,给患者家庭和社会造成了极大的负担。目前,对TBI造成的空间记忆障碍缺乏系统研究。脑损伤后海马组织与记忆有关的分子以及组成神经元骨架的分子如何变化研究甚少。本研究采用Wistar大鼠为研究对象,并随机将其分为假手术（sham）组和创伤性脑损伤（TBI）组。TBI组再按致伤后时间长短分为6 h、12 h、24 h、72 h、15 d五个亚组。TBI组应用PinPointTM颅脑撞击器撞击而致伤,sham组不撞击。采用Morris水迷宫评价实验动物空间记忆能力;干湿重法测定脑含水量,评估脑水肿与海马水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP-4）的相关性;海马神经元特异性核蛋白（neuron specific nuclear protein,NeuN）标记和免疫荧光检测评估TBI致大鼠神经元丢失情况;通过Western印迹检测TBI致海马骨架相关蛋白质和记忆相关蛋白质含量变化。本研究证实,与sham组相比,TBI组大鼠潜伏期明显增加［（61.98±12.82) s vs.(28.32±8.52) s,n=5,P<0.01,day 15］,探索时间明显缩短［（36.98±0.37) s vs. (73.68±5.09) s,n=5,P<0.01,day15］,表明脑创伤损害了动物的空间参考记忆能力和空间工作记忆能力。与sham组相比,TBI组大鼠海马AQP-4在蛋白质水平上的表达和脑含水量持续升高,15 d恢复正常;在12 h［（3.78±0.74),(83.78±0.35)%］和72 h［（3.49±0.85),(82.28±0.63)%］均形成两个波峰,n=5,P均<0.01,表明继发性脑损伤与持续脑水肿和海马AQP-4在蛋白质上的高表达有关。与sham组相比,NeuN标记和免疫荧光检测发现,TBI后24 h 致大鼠海马神经元丢失严重［（198.2±8.002) vs.(297.2±6.866) cells/mm2, n=5,P<0.01］,表明TBI动物的海马功能受损。与sham相比,TBI组海马神经元树突标志物微管结合蛋白2（microtubule associated proein 2,MAP2）和突触前终末特异性标记物突触素（synaptophysin,SYN）在蛋白质水平均伤后逐步降低（n=5,P均<0.01）,72 h［（0.55±0.05) vs.(1.27±0.08), (0.52±0.14) vs.(1.06±0.16), n=5,P均<0.01］降低最明显;TBI组形成神经元纤维缠结主要成分的过度磷酸化tau（ser404）,伤后逐步升高,72 h［（1.25±0.11)vs. (0.33±0.07), n=5,P<0.01］升高最明显。 MAP2、SYN和过度磷酸化的tau（ser404）检测指标的改变,表明脑损伤致神经元受损,神经元生长和损伤修复能力减弱,最终导致神经元骨架破环,TBI损害了动物的海马空间记忆能力。与sham组相比,TBI组大鼠海马环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB）和磷酸化CREB ser133(phosphorylated CREB Ser133, pCREB Ser133)含量降低明显（n=5,P均<0.05）,表明脑损伤动物海马的存储记忆能力减弱;TBI组大鼠海马一般调控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible 2 kinase,GCN2)蛋白质升高明显（n=5,P均<0.05）,表明脑损伤动物海马将新信息转化成长期记忆能力下降。本研究提示,创伤性脑损伤可使大鼠海马神经元骨架破坏,进而导致在学习记忆过程中起重要作用的分子蛋白质下调,抑制记忆储存的蛋白质（GCN2）上调,促使学习记忆功能障碍。     

A Pituitary Homeobox 2 (Pitx2):microRNA-200a-3p:β-catenin Pathway Converts Mesenchymal Cells to Amelogenin-expressing Dental Epithelial Cells

Pitx2, Wnt/β-catenin signaling, and microRNAs (miRs) play a critical role in the regulation of dental stem cells during embryonic development. In this report, we have identified a Pitx2:β-catenin regulatory pathway involved in epithelial cell differentiation and conversion of mesenchymal cells to amelogenin expressing epithelial cells via miR-200a. Pitx2 and β-catenin are expressed in the labial incisor cervical loop or epithelial stem cell niche, with decreased expression in the differentiating ameloblast cells of the mouse lower incisor. Bioinformatics analyses reveal that miR-200a-3p expression is activated in the pre-ameloblast cells to enhance epithelial cell differentiation. We demonstrate that Pitx2 activates miR-200a-3p expression and miR-200a-3p reciprocally represses Pitx2 and β-catenin expression. Pitx2 and β-catenin interact to synergistically activate gene expression during odontogenesis and miR-200a-3p attenuates their expression and directs differentiation. To understand how this mechanism controls cell differentiation and cell fate, oral epithelial and odontoblast mesenchymal cells were reprogrammed by a two-step induction method using Pitx2 and miR-200a-3p. Conversion to amelogenin expressing dental epithelial cells involved an up-regulation of the stem cell marker Sox2 and proliferation genes and decreased expression of mesenchymal markers. E-cadherin expression was increased as well as ameloblast specific factors. The combination of Pitx2, a regulator of dental stem cells and miR-200a converts mesenchymal cells to a fully differentiated dental epithelial cell type. This pathway and reprogramming can be used to reprogram mesenchymal or oral epithelial cells to dental epithelial (ameloblast) cells, which can be used in tissue repair and regeneration studies.     

创伤性脑损伤对大鼠海马骨架蛋白及学习记忆功能影响

创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是极为常见的外伤性疾病,致死率和致残率很高。存活者伴随的空间认知功能障碍,给患者家庭和社会造成了极大的负担。目前,对TBI造成的空间记忆障碍缺乏系统研究。脑损伤后海马组织与记忆有关的分子以及组成神经元骨架的分子如何变化研究甚少。本研究采用Wistar大鼠为研究对象,并随机将其分为假手术（sham）组和创伤性脑损伤（TBI）组。TBI组再按致伤后时间长短分为6 h、12 h、24 h、72 h、15 d五个亚组。TBI组应用PinPointTM颅脑撞击器撞击而致伤,sham组不撞击。采用Morris水迷宫评价实验动物空间记忆能力;干湿重法测定脑含水量,评估脑水肿与海马水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP-4）的相关性;海马神经元特异性核蛋白（neuron specific nuclear protein,NeuN）标记和免疫荧光检测评估TBI致大鼠神经元丢失情况;通过Western印迹检测TBI致海马骨架相关蛋白质和记忆相关蛋白质含量变化。本研究证实,与sham组相比,TBI组大鼠潜伏期明显增加［（61.98±12.82) s vs.(28.32±8.52) s,n=5,P<0.01,day 15］,探索时间明显缩短［（36.98±0.37) s vs. (73.68±5.09) s,n=5,P<0.01,day15］,表明脑创伤损害了动物的空间参考记忆能力和空间工作记忆能力。与sham组相比,TBI组大鼠海马AQP-4在蛋白质水平上的表达和脑含水量持续升高,15 d恢复正常;在12 h［（3.78±0.74),(83.78±0.35)%］和72 h［（3.49±0.85),(82.28±0.63)%］均形成两个波峰,n=5,P均<0.01,表明继发性脑损伤与持续脑水肿和海马AQP-4在蛋白质上的高表达有关。与sham组相比,NeuN标记和免疫荧光检测发现,TBI后24 h 致大鼠海马神经元丢失严重［（198.2±8.002) vs.(297.2±6.866) cells/mm2, n=5,P<0.01］,表明TBI动物的海马功能受损。与sham相比,TBI组海马神经元树突标志物微管结合蛋白2（microtubule associated proein 2,MAP2）和突触前终末特异性标记物突触素（synaptophysin,SYN）在蛋白质水平均伤后逐步降低（n=5,P均<0.01）,72 h［（0.55±0.05) vs.(1.27±0.08), (0.52±0.14) vs.(1.06±0.16), n=5,P均<0.01］降低最明显;TBI组形成神经元纤维缠结主要成分的过度磷酸化tau（ser404）,伤后逐步升高,72 h［（1.25±0.11)vs. (0.33±0.07), n=5,P<0.01］升高最明显。 MAP2、SYN和过度磷酸化的tau（ser404）检测指标的改变,表明脑损伤致神经元受损,神经元生长和损伤修复能力减弱,最终导致神经元骨架破环,TBI损害了动物的海马空间记忆能力。与sham组相比,TBI组大鼠海马环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB）和磷酸化CREB ser133(phosphorylated CREB Ser133, pCREB Ser133)含量降低明显（n=5,P均<0.05）,表明脑损伤动物海马的存储记忆能力减弱;TBI组大鼠海马一般调控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible 2 kinase,GCN2)蛋白质升高明显（n=5,P均<0.05）,表明脑损伤动物海马将新信息转化成长期记忆能力下降。本研究提示,创伤性脑损伤可使大鼠海马神经元骨架破坏,进而导致在学习记忆过程中起重要作用的分子蛋白质下调,抑制记忆储存的蛋白质（GCN2）上调,促使学习记忆功能障碍。     

Uncoupling protein 2 mediates resistance to gemcitabine-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cell lines

Oxidative stress induction is a common effector pathway for commonly used chemotherapeutic agents like gemcitabine (GEM) in hepatocellular carcinoma (HCC) patients. However, GEM alone or in combination with oxiplatin hardly renders any survival benefits to HCC patients. Mitochondrial uncoupling protein 2 (UCP2) is known to suppress mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation, thus mitigating oxidative stress-induced apoptosis. We demonstrate in the present study, using a panel of HCC cell lines that sensitivity to GEM in HCC well correlate with the endogenous level of UCP2 protein expression. Moreover, ectopic overexpression of UCP2 in a HCC cell line with low endogenous UCP2 expression, HLE, significantly decreased mitochondrial superoxide induction by the anti-cancer drug GEM. Conversely, UCP2 mRNA silencing by RNA interference in HCC cell lines with high endogenous UCP2 expression significantly enhanced GEM-induced mitochondrial superoxide generation and apoptosis. Cumulatively, our results suggest a critical role for mitochondrial uncoupling in GEM resistance in HCC cell lines. Hence, synergistic targeting of UCP2 in combination with other chemotherapeutic agents might be more potent in HCC patients.     

Epidermal Growth Factor Activates the Rho GTPase-activating Protein (GAP) Deleted in Liver Cancer 1 via Focal Adhesion Kinase and Protein Phosphatase 2A

Deleted in Liver Cancer 1 (DLC1) is a RHO GTPase-activating protein (GAP) that negatively regulates RHO. Through its GAP activity, it modulates the actin cytoskeleton network and focal adhesion dynamics, ultimately leading to suppression of cell invasion and metastasis. Despite its presence in various structural and signaling components, little is known about how the activity of DLC1 is regulated at focal adhesions. Here we show that EGF stimulation activates the GAP activity of DLC1 through a concerted mechanism involving DLC1 phosphorylation by MEK/ERK and its subsequent dephosphorylation by protein phosphatase 2A (PP2A) and inhibition of focal adhesion kinase by MEK/ERK to allow the binding between DLC1 and PP2A. Phosphoproteomics and mutation studies revealed that threonine 301 and serine 308 on DLC1, known previously to be mutated in certain cancers, are required for DLC1-PP2A interaction and the subsequent activation of DLC1 upon their dephosphorylation. The intricate interplay of this “MEK/ERK-focal adhesion kinase-DLC1-PP2A” quartet provides a novel checkpoint in the spatiotemporal control of cell spreading and cell motility.