牙龈卟啉单胞菌诱导T淋巴细胞活化、凋亡的体外研究

目的检测牙龈卟啉单胞菌对人外周血中T淋巴细胞活化及凋亡的作用,并检测Fas/FasL在牙龈卟啉单胞菌(Porphyrom onas gingivalis,Pg)诱导的T淋巴细胞凋亡中的表达。方法选取10例全身及牙周组织健康受试者,分离外周血中T淋巴细胞,在有/无Pg情况下培养0~96 h,用荧光探针(Annexin V-FITC、PI、CD69)及特殊的单克隆抗体(Fas、FasL)进行标记,并进行流式细胞仪检测。结果 CD69+淋巴细胞+Pg组Annexin V+/PI-细胞百分数在各个时间点上都明显高于T淋巴细胞+Pg组(P0.01)。Fas和FasL的表达量明显上调。用抗Fas单克隆抗体阻滞Fas-FasL相互作用导致T细胞凋亡的明显减少,百分比为(20.56±2.43)%,未加抗体的为(50.41±2.68)%。但残余的细胞凋亡活动与阴性对照相比仍高。结论 Pg能够诱导人外周血中T淋巴细胞活化,并且能够通过活化促进其凋亡,Pg诱导T淋巴细胞凋亡主要通过Fas-FasL途径,并具有时间依赖性。     

喘可治注射液对小鼠体外CD4+CD25+T细胞的影响

利用荧光抗体标记和流式细胞术检测喘可治对刀豆蛋白A(ConA)诱导的T细胞CD69和CD25表达的影响,研究喘可治是否具有促进CD4 CD25 调节性T细胞升高的作用.结果发现喘可治对ConA诱导的T细胞活化标志分子CD69的表达具有抑制作用,但对CD25的表达具有促进作用.说明喘可治对T细胞活化具有抑制作用,CD25表达的上调并不是由活化引起的,而很可能是CD4 CD25 Tr水平升高的标志.     

Ⅱ类MHC在接种流感疫苗后诱导保护性免疫应答中的作用

<正>MHCⅡ类缺陷(MHC-II KO;Aβ-/-)小鼠用于评价MHC-II类分子在接种疫苗后诱导保护性免疫应答中的作用。接种流感A/PR8病毒样颗粒(VLP)疫苗后,完全不同于CD4 T细胞缺陷小鼠,在MHCⅡ类分子缺陷小鼠体内外均未检测到疫苗特异性免疫球蛋白Ig G抗体。缺乏MHCⅡ类分子并没有明显影响血清中诱导产生特异性Ig M抗体。用     

人咽鳞癌Fadu细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的:探讨咽鳞癌细胞总RNA转染的树突状细胞(DC)疫苗体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力.方法:分离人脐血单个核细胞,经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人IL-4(rhIL-4)诱导不成熟DC(iDC),提取人咽鳞癌细胞FaDu总RNA后,转染入人iDC,成为FaDu RNA/DC疫苗,用流式细胞仪检测DC表面分子CD40、CDS0、CD83、CD86、HLA-DR的表达,混合淋巴细胞反应测定DCs刺激同种异基因T细胞增殖能力.用LDH法评估转染肿瘤总RNA的DC瘤苗的细胞毒性T淋巴细胞反应.结果:与转染前比较,人咽鳞癌细胞FaDu总RNA转染后脐血单核细胞来源DCs表面CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子水平明显升高(P均<0.05);可显著促进T细胞增殖,在体外能诱导高效而特异的抗下咽癌免疫效应(P<0.05).结论:人咽鳞癌细胞的总RNA转染的DC肿瘤疫苗能诱导CD8+,CD4+T细胞免疫,是较有临床应用前景的下咽癌免疫治疗方法.     

携带HCV核心蛋白原核表达质粒与真核表达质粒的减毒伤寒沙门菌诱导小鼠免疫应答之比较

丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是丙肝疫苗的重要候选抗原,然而,该蛋白因具有免疫调控作用而影响免疫应答的诱导。构建了HCV核心蛋白的两种表达质粒,一种是体内激活型原核表达质粒pZW-C,另一种是真核表达质粒pCI-C。将该两种质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,得到重组菌SL7207/pZW-C和SL7207/pCI-C,分别将重组菌口服接种小鼠,检测小鼠的免疫应答,结果发现:①SL7207/pCI-C免疫鼠的CD3 CD4 T细胞持续降低,而SL7207/pZW-C免疫鼠的CD3 CD4 T细胞无明显改变;②SL7207/pCI-C免疫只诱导低水平抗HCV核心蛋白抗体,加强免疫对抗体阳转率及抗体水平无明显影响,而SL7207/pZW-C免疫组所有小鼠均产生较高水平的抗核心蛋白抗体。③SL7207/pCI-C免疫鼠脾细胞的体外增殖活性、细胞毒性T细胞活性以及加强免疫对细胞免疫应答的增强作用均明显不及SL7207/pZW-C免疫鼠。结果提示:携带真核表达质粒pCI-C的沙门菌因在小鼠细胞内表达天然形式(结构以及磷酸化修饰)的HCV核心蛋白,可能通过对T细胞的免疫抑制作用而弱化免疫应答。而以携带原核表达质粒pZW-C的沙门菌免疫可避免这一问题,并具有接种方便,成本低廉等优点,从而可望作为基于HCV核心蛋白为靶抗原的HCV疫苗的候选免疫方式。     

重组质粒与重组蛋白共免疫诱导HBsAg特异性T细胞免疫抑制

摘要：【目的】为了探索治疗急性乙型肝炎和爆发性乙型肝的新策略,本研究将HBV DNA疫苗和相应抗原的蛋白质分子联合免疫小鼠,旨在探讨联合免疫对小鼠抗原特异性T细胞增殖反应的影响。【方法】我们将HBV DNA疫苗（pcDS2）和相应抗原蛋白质分子(HBsAg)联合免疫BALB/c小鼠;分别在第0、2和4周进行免疫,在第6周用ELISA方法检测抗-HBs IgG效价,MTT和流式细胞仪检测T细胞增殖反应,及流式细胞仪检测细胞因子表达水平。【结果】pcDS2和HBsAg联合免疫组小鼠的抗-HBs水平显著提高;免疫小鼠的T细胞体外经HBsAg刺激后, 联合免疫组刺激指数(SI)明显降低;经流式细胞仪检测进一步证实联合免疫组T细胞增殖反应被显著抑制;联合免疫组T细胞表达IL-10和Foxp3水平显著升高。【结论】pcDS2和HBsAg联合免疫能诱导产生特异性体液免疫应答,但不能诱导产生抗原特异性T细胞增殖反应;T细胞增殖反应被显著抑制可能与T细胞表达IL-10和Foxp3上调有关;本研究为急性乙型肝炎和爆发性乙型肝炎治疗及HBV疫苗的研究奠定了基础。     

成人外周血来源树突状细胞体外诱导培养动态监测

目的:分析体外诱导培养树突状细胞(dendritic cells,DCs)表面分子及成熟度的动态变化;方法:利用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测分析DCs表面成熟标志分子CD83和T细胞辅助分子CD58、CD54、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、HLA-ABC表达水平;结果:体外诱导培养5 d细胞即高表达DCs标志分子CD11c,细胞成熟度与细胞表面T细胞辅助分子的表达水平随培养天数的增加有一定提高,但显著低于大肠杆菌LPS刺激的DCs;结论:诱导培养6 d DCs表型为CD83 low、CD58low、CD54 low、CD40 low、CD80 low、CD86 low、HLA-DRhigh、HLA-ABChigh,为不成熟DCs.     

HA纳米载体介导转hGM-CSF基因的HepG2疫苗诱导的 抗瘤效应研究

目的:观察HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因的HepG2细胞疫苗体外抗肿瘤效应,为hGM-CSF基因修饰的HepG2细胞疫苗的临床应用提供依据。方法:HA纳米颗粒载体介导hGM-CSF基因转染HepG2细胞制备转GMCSF基因的HepG2细胞疫苗。密度梯度离心法分离人PBMC,体外诱导人PBMC。WST-1法测定PBMC的增殖活性及对HepG2细胞的杀伤效应,流式细胞术分析CD4+和CD8+的阳性表达率,ELISA法测定INF-γ的分泌。结果:WST-1结果显示,转基因HepG2组疫苗能诱导PBMC增殖,其增殖率优于野生型疫苗(p<0.05);其诱导的PBMC对HepG2的杀伤率高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。FCM结果显示,转基因HepG2疫苗组PBMC中CD4+和CD8+阳性表达率均高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。ELISA结果显示,转基因组PBMC培养上清中IFN-γ含量为1989.76±254.21pg/ml,高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。结论:HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因能增加HepG2细胞疫苗的免疫原性,转hGM-CSF基因HepG2细胞疫苗可有效诱导PBMC增殖、分化,增加INF-γ的分泌,提高其对HepG2细胞的杀伤作用。     

未经刺激的静止CD4+T细胞与克隆CD4+T细胞在抗原特异的及主要组织相容性抗原限制的无能诱导中的差异及其意义

在体外克隆T细胞中,T细胞无能可在多种条件下诱导产生,但T细胞在体内条件下的无能诱导仍有很多疑问和争议。由于正常动物体内对单一抗原特异应答的T细胞频率太低,从体内新提取未经刺激的T细胞进行无能诱导研究一直存在技术上的困难。本文利用HNT—TCR转基因小鼠高度单一的针对HA多肽抗原的CD4^ T细胞群体,以T细胞增殖反应作为检测方法,比较研究了克隆CD4^ T细胞和新提取未经刺激的CD4^ T细胞对无能诱导的反应。结果表明,经化学交联剂l—ethyl-3-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(ECDI)处理的抗原提呈细胞(APC)与流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽诱导在克隆CD4^ T细胞中产生了无能,这种无能是依赖于特异抗原和主要组织相容性抗原(MHC)的;而在同样条件下,新提取未经刺激的CD4^ T细胞则不能被诱导产生无能。结果提示,体内T细胞与克隆T细胞存在功能上的不同,体内T细胞的无能诱导可能需要不同的条件。这对体内T细胞免疫耐受产生的机制研究和临床应用都有重要意义。     

烟曲霉抗原Asp f16HLA-A*0201限制性的CD8+CTL抗原表位生物信息学预测与实验室鉴定

目的 预测与鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A *0201限制性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位.方法 以国人常见的HLA-A*0201位点为靶点,依据生物信息学软件扫描烟曲霉特异性抗原Asp f16的全部427个氨基酸序列.使用HLA-A *0201转基因小鼠制备骨髓来源的树突状细胞(DC)和CTL.流式细胞仪技术检测DC表面MHC Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c的表达来验证其是否成熟.ELISPOT试验检测烟曲霉抗原多肽特异性CTL产生的细胞因子IFN-γ.四聚体(Tetramer)试验证实烟曲霉特异性CTL与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的亲和性.结果 根据与MHC I类分子结合的半衰期评分,选择了3个HLA-A*0201限制性抗原表位.流式细胞仪分析示成熟DC高表达HLA Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c.Tetramer试验证实烟曲霉特异性T细胞受体与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的高亲和性.ELISPOT实验结果 表明烟曲霉抗原肽体外可以活化CD8+CTL,被负载了抗原肽的DC刺激活化后可以产生IFN-γ.结论 本研究成功鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,可作为疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型抗烟曲霉疫苗提供参考.     

重组CHO细胞乙肝表面抗原诱导小鼠细胞免疫应答的研究

为了研究重组CHO细胞乙肝表面抗原(CHO-rHBsAg)在小鼠中诱导T细胞免疫应答的能力,全面评价疫苗的免疫原性,以CHO-rHBsAg免疫BALB/c小鼠,常规制备小鼠脾脏淋巴细胞并在体外以抗原或特异多肽刺激;采用ELISA法测定抗原特异性T淋巴细胞分泌的细胞因子,乳酸脱氢酶法(LDH)测定抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性,酶联斑点法(ELISPOT)测定CTL频数(CTLp),应用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚群。结果显示,rHBsAg可在小鼠中诱导Th1及Th2类细胞因子;加铝佐剂的rHBsAg较未加佐剂的抗原可诱导较高水平的IFN-γ、CTL克隆及较高百分比的CD8+T淋巴细胞亚群。重组CHO细胞来源的HBsAg可在BALB/c小鼠中诱导一定程度的细胞免疫应答。     

携带HCV核心蛋白原核表达质粒与真核表达质粒的减毒伤寒沙门菌诱导小鼠免疫应答之比较

丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白是丙肝疫苗的重要候选抗原,然而,该蛋白因具有免疫调控作用而影响免疫应答的诱导。构建了HCV核心蛋白的两种表达质粒,一种是体内激活型原核表达质粒pZW-C,另一种是真核表达质粒pCI-C。将该两种质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,得到重组菌SL7207/pZW-C和SL7207/pCI-C,分别将重组菌口服接种小鼠,检测小鼠的免疫应答,结果发现：① SL7207/pCI-C免疫鼠的CD3⁺CD4⁺ T细胞持续降低,而SL7207/pZW-C免疫鼠的CD3⁺CD4⁺ T细胞无明显改变;② SL7207/pCI-C免疫只诱导低水平抗HCV核心蛋白抗体,加强免疫对抗体阳转率及抗体水平无明显影响,而SL7207/pZW-C免疫组所有小鼠均产生较高水平的抗核心蛋白抗体。③ SL7207/pCI-C免疫鼠脾细胞的体外增殖活性、细胞毒性T细胞活性以及加强免疫对细胞免疫应答的增强作用均明显不及SL7207/pZW-C免疫鼠。结果提示：携带真核表达质粒pCI-C的沙门菌因在小鼠细胞内表达天然形式（结构以及磷酸化修饰）的HCV核心蛋白,可能通过对T细胞的免疫抑制作用而弱化免疫应答。而以携带原核表达质粒pZW-C的沙门菌免疫可避免这一问题,并具有接种方便,成本低廉等优点,从而可望作为基于HCV核心蛋白为靶抗原的HCV疫苗的候选免疫方式。     

B型流感病毒血凝素的表达及免疫原性测定北大核心CSCD

B型流感病毒是引起季节性流感的原因之一,严重时会造成重大疾病或死亡。为了检测B型流感病毒2个疫苗候选毒株的血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白胞外段在哺乳动物细胞中的表达及在小鼠体内的免疫原性,本研究将带有三聚体标签的HA胞外段(HA-ectodomain,HA-ecto)序列及神经氨酸酶(neuraminidase,NA)全长编码框经密码子优化后构建至pCAGGS载体中,通过线性聚乙烯亚胺将pCAGGS-HA-ecto与pCAGGS-NA共转染293T细胞。收集转染后96h的上清,通过镍离子亲和层析及分子筛层析获得三聚体形式的HA-ecto蛋白,然后将HA-ecto三聚体蛋白免疫小鼠,进行酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HAI)检测HA-ecto蛋白诱导小鼠后产生的抗体水平。纯化结果显示,通过哺乳动物细胞表达系统能够得到分泌型表达的三聚体HA-ecto蛋白。ELISA及HAI结果显示,三聚体HA-ecto蛋白二次免疫小鼠后,能诱导小鼠产生较高水平的同源和异源交叉抗体。以上结果表明,哺乳动物细胞表达的B型流感病毒HA蛋白可作为亚单位重组流感疫苗的候选。     

OX40参与RSV气道炎症反应中CD4~+T细胞的增殖活化

OX40是TNFR超家族成员之一,主要表达于活化的CD4~+T细胞表面。OX40能促进CD4~+T细胞的增殖与活化,但其在呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus, RSV)感染所诱发的气道炎症反应中对CD4~+T细胞增殖与活化的作用尚不十分清楚。通过建立RSV急性感染的实验动物模型,采用流式细胞术、免疫磁珠分选、Real-time RT-PCR、Elisa、Western Blot等实验方法,旨在揭示在RSV感染性气道炎症中OX40对CD4~+T细胞增殖与活化的影响作用。结果显示,RSV感染后脾组织内表达OX40的CD4~+T细胞数量及CD4~+T细胞OX40 mRNAs和OX40蛋白表达水平显著增加。从感染3 d的BALB/c鼠脾组织分选CD4~+T细胞进行体外培养并加入OX40激动型抗体,发现加入OX40激动型抗体的CD4~+T细胞组与未加组相比,其细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13的表达水平显著增高。证实在感染性气道炎症中OX40对CD4~+T的细胞增殖与活化起着重要的调控作用。     

羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )和已插入CpG序列的pcDNA3.1-CpG中,构建pcDNA3.1-P32、pcDNA3.1-CpG-P32和pcDNA3.1-CpG-MP32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4 和CD8 T细胞亚群.结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达P32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4 T细胞数目和CD4 /CD8 T细胞比值明显高于对照组.结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答.     

分枝杆菌干扰抗原呈递细胞功能的研究进展

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)为巨噬细胞内寄生菌,诱导宿主产生的免疫应答以细胞免疫应答为主,其中活化的T细胞特别是CD4 T辅助细胞(Th)及其激活调节的巨噬细胞等多种细胞所发挥的免疫机制是机体抗Mtb特异性免疫的关键,决定了胞内Mtb是被清除、还是进一步繁殖并发展为活动性结核抑或静止于胞内处于潜伏状态[1].     

新生儿HB免疫后抗体和Th2记忆应答高于成人

新生儿对大多数T细胞依赖性抗原可产生有限的抗体应答,但对疫苗的T淋巴细胞应答知之甚少。在本文研究中,作者比较了新生儿和初次接受试验的成人由乙型肝炎疫苗诱导的免疫应答。婴儿产生了比成人明显高的血清抗乙肝表面抗原(HBs)抗体效价,     

HA纳米载体介导转hGM-CSF基因的HepG2疫苗诱导的抗瘤效应研究

目的：观察HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因的HepG2细胞疫苗体外抗肿瘤效应,为hGM-CSF基因修饰的HepG2细胞疫苗的临床应用提供依据。方法：HA纳米颗粒载体介导hGM-CSF基因转染HepG2细胞制备转GMCSF基因的HepG2细胞疫苗。密度梯度离心法分离人PBMC,体外诱导人PBMC。WST-1法测定PBMC的增殖活性及对HepG2细胞的杀伤效应,流式细胞术分析CD4＋和CD8＋的阳性表达率,ELISA法测定INF-γ的分泌。结果：WST-1结果显示,转基因HepG2组疫苗能诱导PBMC增殖,其增殖率优于野生型疫苗（p〈0.05）;其诱导的PBMC对HepG2的杀伤率高于各野生型疫苗组和各空白对照组（p〈0.05）。FCM结果显示,转基因HepG2疫苗组PBMC中CD4＋和CD8＋阳性表达率均高于各野生型疫苗组和各空白对照组（p〈0.05）。ELISA结果显示,转基因组PBMC培养上清中IFN-γ含量为1989.76±254.21pg/ml,高于各野生型疫苗组和各空白对照组（p〈0.05）。结论：HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因能增加HepG2细胞疫苗的免疫原性,转hGM-CSF基因HepG2细胞疫苗可有效诱导PBMC增殖、分化,增加INF-γ的分泌,提高其对HepG2细胞的杀伤作用。     

抗独特型抗体与T细胞记忆的关系

记忆T细胞作为人体免疫系统中的一个组成部分,在免疫应答中发挥着至关重要的作用,因此利用抗独特型抗体制备诱导产生记忆T细胞的疫苗是免疫学领域的一个重要方向。抗独特型抗体Fab段具有与特异性抗原相似的抗原决定簇的结构,其作为抗原替代物制备的疫苗所激发机体产生的记忆T细胞具有特异性强和安全性高的特点,成为一种比较理想的疫苗.就抗独特型抗体与T细胞记忆之间的联系及其应用效果作一简要综述。     

编码流感病毒血凝素基因和CD40L的核酸疫苗抗小鼠流感研究

为了检测表达CD40L的质粒能否作为核酸疫苗佐剂提高A/PR8/34流感病毒血凝素(HA)DNA疫苗的免疫应答,构建了表达鼠CD40L的质粒,并将它与A型流感病毒的 HA DNA疫苗用电击的方法共同免疫BALB/C小鼠(各30μg),免疫两次,间隔三周,第二次免疫后1周,用致死量流感病毒A/PR8/34攻击.发现与单独免疫30μg HA相比,血清中抗HA的IgG抗体量明显提高,且以IgG2a抗体提高为主,小鼠体重减轻非常少且体重恢复加快.实验结果显示,CD40L能作为流感病毒核酸疫苗佐剂,提高小鼠抗流感病毒攻击的能力.