回转器旋转对鸡胚脑细胞内游离Ca~(2+)水平的影响

采用ｆｕｒａ－２双波长荧光法,测定了孵化第６至１６天鸡胚脑细胞内游离Ｃａ２＋的浓度。并且利用回转器模拟微重力的生物效应,研究了不同胚龄鸡胚旋转不同时间后,脑细胞内游离Ｃａ２＋水平的变化。结果表明,孵化第８至１６天鸡胚旋转不同时间后,其脑细胞内游离Ｃａ２＋浓度均有所下降,其中第１０天鸡胚旋转４或７小时及第１３天鸡胚旋转２４小时后,脑细胞内Ｃａ２＋浓度比对照组显著降低（ｐ＜０．０１）。第１０天和１３天鸡胚分别旋转４和２４小时后再静置恢复相同时间,细胞内Ｃａ２＋浓度均有所增加,但仍低于对照组水平。结果显示,回转器旋转引起的鸡胚脑细胞内游离Ｃａ２＋水平降低是可逆的     

鸡胚脑细胞磷脂和能量代谢的模拟微重力生物效应的31P-NMR谱研究

利用31P-NMR方法对回转器旋转的鸡胚脑细胞内磷酸单脂(PME)、磷酸双脂(PDE)及ATP和pH值进行了定量分析, 以研究对脑细胞磷脂代谢及能量代谢的模拟微重力生物效应. 实验结果显示出: 对E13鸡胚旋转24 h引起了ATP和PME及pH值水平的显著性升高. E15鸡胚经24 h旋转对脑细胞磷脂代谢及能量代谢产生类似影响, 但皆未达显著性差异水平. 还利用孔雀石绿方法测量旋转对鸡胚脑细胞 ATPase活性的影响. 从实验结果观察到: E13和E15鸡胚经24 h的旋转引起了ATPase活性的显著下降, 前者比后者更敏感. 停止旋转24 h后, 鸡胚脑细胞所出现的上述变化, 除ATP仍然高于对照外, 其他指标皆可以恢复.     

鸡胚脑细胞谷氨酸释放的模拟微重力效应

用回转器旋转鸡胚蛋研究对脑细胞的模拟微重力生物效应.采用连续荧光法测量孵化10 d（E10）和孵化13 d（E13）鸡胚的脑细胞谷氨酸的初始释放速率、在KCl去极化及单个电脉冲刺激后的释放速率和释放量以及谷氨酸的含量,并对旋转处理组和静止对照组进行了比较.结果如下：旋转组和对照组脑细胞的谷氨酸初始释放速率没有显著差异,E10鸡胚经24 h旋转后,在KCl刺激下脑细胞的谷氨酸释放速率和释放量皆高于对照组,经4 h旋转后谷氨酸含量显著增高（P＜0.01）;但旋转24 h的E13鸡胚上述指标皆无显著改变,表明微重力对鸡胚脑细胞神经递质释放的影响与胚龄有关.鸡胚脑细胞在电脉冲刺激下谷氨酸释放的动态过程表明：脉冲电场引起的谷氨酸释放与细胞内钙离子迅速增加有关.     

回转器旋转对体外培养的鸡胚神经元的影响

用回转器旋转研究重力改变对体外培养的鸡胚神经元的影响。结果发现在回转器里经过７－９小时的处理后,神经元的形态和行为发生明显改变。只有６．３％的神经元呈现两极型的运动形态,而对照组正常培养的细胞运动形态的神经元占３４．２％。某些细胞的突起出现异常,呈现扭曲的形状。在培养基质上的神经元伸出许多丝状突起,丝状突起的末端锚定在周围的细胞上或锚定在培养基质上。经过重力改变处理的细胞重新放在相差显微镜下观察,结果显示神经元的运动活性降低,许多细胞没有观察到明显运动的迹象。     

脉冲电场对鸡胚脑细胞Ca~(2 )和cAMP含量的影响

利用ｆｕｒａ－２／ＡＭ荧光方法和放射免疫方法分别研究了脉冲电场对１１天和１４天胚龄的悬浮鸡胚脑细胞内Ｃａ２＋和环腺苷酸（ｃＡＭＰ）含量的影响,并探讨了在脉冲电场作用下这两种信号物质变化的相关性。实验结果表明：当电激液中［Ｃａ２＋］为１ｍｍｏｌ／Ｌ时,在宽度为１００微秒．强度为０．５,１．０,２．０ｋＶ／ｃｍ的脉冲电场作用下,１１天胚龄的鸡胚脑细胞内钙离子浓度（以［Ｃａ２＋］ｉ表示）与对照相比显著上升,其升高值随着脉冲强度的增加而增加,而细胞内ｃＡＭＰ含量与对照相比显著降低;用ＥＧＴＡ络合电激液中游离Ｃａ２＋以后,虽然细胞内［Ｃａ２＋］ｉ显著上升,细胞内ｃＡＭＰ含量没有显著变化。１４天胚龄的鸡胚脑细胞内［Ｃａ２＋］ｉ在脉冲电场作用下显著上升,而细胞内ｃＡＭＰ含量没有显著变化。脉冲电场对１１天和１４天胚龄的鸡胚脑细胞膜和细胞内Ｃａ２＋库Ｃａ２＋转移系统的开放均有显著作用,此作用具有对脉冲强度的依赖性。为了解物理信号跨细胞膜传导的方式提供了初步的实验根据     

罗汉果胚、胚乳及胚乳吸器的发育

本文采用石蜡切片与酶解分离法对罗汉果Ｓｉｒａｉｔｉａｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉ胚、胚乳及胚乳吸器的发育过程进行观察．ａ）罗汉果胚的发育是按Ｇｅｕｍｕｒｂａｎｕｍ的分裂程序进行的．属紫菀型．但在合子分裂成球胚过程中,胚芽原细胞分化明显．故属紫菀型的变异型。ｂ）胚乳发育属核型．在球形胚阶段,在合点端和珠孔端有发育的胚乳吸器形成并进行旺盛生长,最大长度达１４２０μｍ,心形胚期．吸器活动开始减退,合点端核型胚乳吸器转变成细胞型．由胚乳本体基部膨大细胞．充当补助吸器．ｃ）酶解分离法研究胚乳吸器的发生发育有较好的应用前景。     

脉冲电场对鸡胚脑细胞Ca~(2+)和cAMP含量的影响

利用ｆｕｒａ－２／ＡＭ荧光方法和放射免疫方法分别研究了脉冲电场对１１天和１４天胚龄的悬浮鸡胚脑细胞内Ｃａ２＋和环腺苷酸（ｃＡＭＰ）含量的影响,并探讨了在脉冲电场作用下这两种信号物质变化的相关性。实验结果表明：当电激液中［Ｃａ２＋］为１ｍｍｏｌ／Ｌ时,在宽度为１００微秒．强度为０．５,１．０,２．０ｋＶ／ｃｍ的脉冲电场作用下,１１天胚龄的鸡胚脑细胞内钙离子浓度（以［Ｃａ２＋］ｉ表示）与对照相比显著上升,其升高值随着脉冲强度的增加而增加,而细胞内ｃＡＭＰ含量与对照相比显著降低;用ＥＧＴＡ络合电激液中游离Ｃａ２＋以后,虽然细胞内［Ｃａ２＋］ｉ显著上升,细胞内ｃＡＭＰ含量没有显著变化。１４天胚龄的鸡胚脑细胞内［Ｃａ２＋］ｉ在脉冲电场作用下显著上升,而细胞内ｃＡＭＰ含量没有显著变化。脉冲电场对１１天和１４天胚龄的鸡胚脑细胞膜和细胞内Ｃａ２＋库Ｃａ２＋转移系统的开放均有显著作用,此作用具有对脉冲强度的依赖性。为了解物理信号跨细胞膜传导的方式提供了初步的实验根据     

人衰老成纤维细胞经紫外线损伤后的DNA修复和细胞周期调控

 以体外培养的不同代龄的人胚肺二倍体成纤维细胞（２ Ｂ Ｓ）为对象,紫外线诱导 Ｄ Ｎ Ａ 损伤后,观察细胞形态、增殖特性、细胞周期、 Ｄ Ｎ Ａ 修复变化等细胞应答以及 ｇａｄｄ１５３、ｐ２１ Ｗ Ａ Ｆ１／ Ｃ Ｉ Ｐ１／ Ｓ Ｄ Ｉ１、ｐ５３ 等基因的转录水平的表达变化．结果显示：紫外线诱导 Ｄ Ｎ Ａ 损伤后,衰老（＞ ５５ 代）２ Ｂ Ｓ细胞形态及增殖能力的改变不如年轻细胞（＜ ３０ 代）显著;不同代龄的细胞损伤后均出现 Ｇ１ 期阻滞现象,年轻细胞 Ｇ１ 期阻滞率明显高于衰老细胞（ Ｐ＜ ００５）;衰老细胞总的修复能力较年轻细胞明显下降（ Ｐ＜ ００１）;同时,ｇａｄｄ１５３、ｐ２１、ｐ５３ 等的可诱导性均低于年轻 ２ Ｂ Ｓ细胞．由此,分别在细胞水平与基因水平反映了衰老细胞经紫外线照射损伤后的细胞应答变化与修复机能减退的关系．     

鸡胚原肠胚期原条细胞命运决定于其所处的局部微环境

在果蝇、斑马鱼、鸡等三胚层动物胚胎早期发育的原肠胚期,原条两侧的上胚层细胞进入原条经历上皮-间充质转化(EMT),迁移进入囊胚腔,形成松散的中胚层细胞,位于原条不同部位的细胞其迁移路线和分化命运不同,如前部原条细胞贡献于体节和心脏等,而后部原条细胞则迁移至胚外形成血岛。为了研究细胞的迁移途径及分化命运是否会随着细胞所处不同部位微环境的改变而改变,利用传统的移植技术,将宿主鸡胚原条前部的一部分细胞用GFP阳性的相同时期鸡胚原条组织替换,培养一段时间后,用荧光体视显微镜追踪GFP阳性细胞的迁移途径。结果发现,从供体原条后部移植到宿主原条前部的细胞遵循原条前部细胞迁移的路线,反之亦然;原位杂交结果显示移植后的GFP阳性细胞分化为所处部位的细胞类型。上述结果表明:鸡胚原肠胚期原条细胞迁移和分化的命运决定于细胞所处的微环境或者说局部基因表达的时空性。     

钙调素对DNA合成的影响

利用钙调素ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ,ＣａＭ）拮抗剂─三氟拉嗪（ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ,ＴＦＰ）对Ｇ０期小鼠Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２成纤维细胞进入Ｓ期和ＤＮＡ合成进行了研究．Ｇ０期细胞进入Ｓ期时,大量钙调素进入细胞核,其水平为Ｇ０期的２倍。ＴＦＰ处理的细胞被阻抑在Ｇ１期,不仅使Ｓ期细胞群体下降,而且３Ｈ－ＴｄＲ掺入ＤＮＡ强度受到明显抑制．同时,ＴＦＰ处理的细胞胸腺嘧啶核苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ,ＴＫ）基因表达及ＴＫ活性亦明显下降,但不影响Ｓ期细胞核内的钙调素水平,结果表明钙调素功能之抑制不仅阻抑细胞从Ｇ１期至Ｓ期的进程,而且对细胞ＤＮＡ合成强度亦有抑制作用．     

ES细胞分化为血管样结构的机理探讨—TGF—β1在血管形成中的作用

本文利用小鼠ＥＳ细胞的拟胚一培养和三维胶原蛋白培养系统研究了外源ｒｈＴＧＦ－β１对ＥＳ细胞分化为血管样样结构的影响。结果发现,远方介培养中添加外源ｒｈＴＧＦ－β１或细胞经基因转染面有过度表达的ＴＧＦ－β１的ＥＳ－Ｔ６细胞分化为血管样结构的频率明显地受到抑制,相似于其亲本ＥＳ－５细胞的分化水平。在Ｉ型胶原三维培养系统中的单层ＥＳ－５细胞培液中添加ｒｈＴＧＦ－β１时,明显地促进ＥＳ－５细胞形成血管样结     

钙调素对DNA合成的影响

利用钙调素拮抗剂－－三氟拉嗪对Ｇｏ期小鼠Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２成纤维细胞进入Ｓ期和ＤＮＡ合成进行了研究,Ｇ０期细胞进入Ｓ期时,大量钙调进入细胞核,其水平为Ｇ０期的２倍。ＴＦＰ处理的细胞被阻抑在Ｇ１期,不仅使Ｓ期细胞群体下降,而且３Ｈ－ＴｄＲ掺入ＤＮＡ强度受到明显抑制,同时ＴＦＰ处理的细胞胞腺啶核苷激酶基因表达及ＴＫ活性亦明显下降,但不影响Ｓ期细胞核内的钙调素水平,结果表明钙调素功能之抑制不仅阻抑细胞从     

鸡原始生殖细胞转染条件优化

为获得鸡原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的最佳转染效率,本研究比较不同质粒用量和不同细胞数在3种转染试剂(Lipofectamine 2000、3000和LTX&Plus Reagent)中PGCs的转染效率,利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting technology,FACS)辅助优化Lipofectamine 3000转染试剂,经FACS进一步分选获得带绿色荧光蛋白(GFP)的PGCs,继续培养3周后,移植回注到受体鸡胚中,移植3.5 d后分离性腺拍照观察。结果显示,转染试剂Lipofectamine 3000的转染效率最高,质粒、Lipofectamine 3000转染试剂和PGCs细胞数的配比为3μg:4μL:0.5×10⁴个,转染5 h转染效率最高,达到23.4%,与现有的研究结果相比提高了2倍以上。移植回注PGCs到受体鸡胚中,荧光显微镜观察到鸡胚性腺中有GFP阳性细胞。本研究综合考虑转染试剂、质粒用量和细胞数量的影响因素以优化PGCs的转染条件,为高效制备转基因鸡及基因编辑鸡的研究奠定基础。     

鸡X期胚盘细胞体外培养

为证实经遗传修饰的鸡X期胚盘细胞具有参与受体胚胎发育和形成嵌合体的能力,本研究将由鸡X期胚盘制成的细胞悬液与经脂质体包埋的抗鸡传染性支气管炎病毒基因重组质粒PGS1共孵育后,直接显微注入同期受体胚盘（140枚）;或对转染后供体细胞进行G418抗性筛选性后显微注入同期受体鸡胚盘（140枚）;或将供体细胞体外培养48h,再与脂质体-P^GSI复合物共孵育后显微注入同期受体鸡胚盘（190枚）,制备转基因嵌合体鸡,并应用PCR和RAPD方法,对鸡胚和雏鸡不同组织或血液中的DNA进行检测。结果表明：直接注射组孵化率（5.7%)显著（P＜0.01)高于G418筛选处理组（1.4%)和培养48h处理组（2.1%);G418筛选处理组不同胚龄鸡胚组织、器官中外源DNA的PCR检测阳性率均高于其它二个组。实验结果证明,体外培养48h并经遗传修饰的胚盘细胞仍然具有形成嵌合体的能力,利用早期胚盘细胞途径制备转基因鸡是可行的。     

一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中;（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子;（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上,对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。     

鸡胚巨噬细胞AcP酶变化及AcP酶与凋亡细胞的关系

本研究采用电镜及酶细胞化学的方法观察了鸡胚脾脏不同胚龄组巨噬细胞溶酶体酸性磷酸酶（AcP酶）的变化、凋亡实验组巨噬细胞及其AcP酶与凋亡细胞的关系。取10天、13天和17天鸡胚脾脏,按Gomori法显示AcP酶,各胚龄脾脏巨噬细胞AcP酶细胞化学反应阳性,按AcP酶染色阳性做溶酶体计数,结果显示随着胚龄的增加溶酶体数随之增加,尤以第17天组溶酶体数增加最为明显,所得数据经统计分析表明各胚龄组间溶酶体数的差异有统计学意义。凋亡实验组采用放线菌酮诱导15天鸡胚脾脏细胞凋亡,结果显示凋亡细胞为各类幼稚血细胞,以幼稚淋巴细胞为主。巨噬细胞未见凋亡,而是吞噬了大量的凋亡细胞和凋亡小体,AcP酶反应颗粒不仅出现在巨噬细胞的溶酶体、吞噬体,还见于高尔基复合体、内质网等。细胞AcP酶反应强度数字化结果表明：凋亡组酶活性显著高于对照组,差别有统计学意义,提示胚胎巨噬细胞在凋亡细胞出现时AcP酶活性增强,说明巨噬细胞吞噬和消化凋亡细胞或凋亡小体是通过AcP酶等活性物质来实现的。     

多胚水稻品系SB—1的细胞胚胎学研究：助细胞无配子生殖

对多胚水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）品系ＳＢ－１ 自然群体中单倍体来源进行的细胞胚胎学研究表明,卵器中的一个或两个助细胞能在受精之前发育成胚,其发生率分别为观察子房数的２．２４％ 和１．７５％ 。在１ 个助细胞提前发育成胚的胚囊中观察到双受精作用。在开花后３—８ ｄ的颖果中观察到１．６２％ 的与合子胚迥异的异位瘦长单胚和０．８１％ 的有胚无胚乳子房,根据胚所处的位置认为其来源于助细胞无配子生殖。此外,还观察到极少数的中央细胞未经受精自发产生胚乳的现象。讨论了ＳＢ－１中发生的无配子生殖的意义     

鸡胚细胞的传代培养和麻疹病毒的增殖

为了建立原代鸡胚细胞的传代培养工艺,探究传代鸡胚细胞对麻疹病毒的敏感性和适应性,本研究将原代鸡胚细胞进行传代培养,分别采用原代鸡胚细胞和传代鸡胚细胞培养麻疹病毒沪-191(Shanghai-191,S-191)株毒种,并对病毒收获液进行滴度检测和基因序列测定。结果显示,原代鸡胚细胞可稳定传代培养至第10代,各代次细胞生长趋势相似;第5代鸡胚细胞染色体检查为正常染色体核型;第8代鸡胚细胞成瘤性检查未见成瘤;采用第3、5代鸡胚细胞制备的麻疹病毒滴度水平高于原代鸡胚细胞,但无显著性差异(n＝3,P＞0.05),编码病毒核蛋白(nucleoprotein,N)和血凝素蛋白(hemagglutinin,H)的基因序列与S-191株完全一致,未发生变异。本研究证实,原代鸡胚细胞可进行传代培养,各代次鸡胚细胞对麻疹病毒的敏感性不变,产毒水平无显著差异,可用于培养麻疹病毒。     

鸡Ⅹ期胚盘细胞体外培养

为证实经遗传修饰的鸡X期胚盘细胞具有参与受体胚胎发育和形成嵌合体的能力 ,本研究将由鸡X期胚盘制成的细胞悬液与经脂质体包埋的抗鸡传染性支气管炎病毒基因重组质粒PGS1共孵育后 ,直接显微注入同期受体胚盘 (14 0枚 ) ;或对转染后供体细胞进行G418抗性筛选后显微注入同期受体鸡胚盘 (14 0枚 ) ;或将供体细胞体外培养 4 8h ,再与脂质体 PGS1复合物共孵育后显微注入同期受体鸡胚盘 (190枚 ) ,制备转基因嵌合体鸡 ,并应用PCR和RAPD方法 ,对鸡胚和雏鸡不同组织或血液中的DNA进行检测。结果表明 :直接注射组孵化率(5 7% )显著 (P <0 0 1)高于G418筛选处理组 (1 4 % )和培养 4 8h处理组 (2 1% ) ;G418筛选处理组不同胚龄鸡胚组织、器官中外源DNA的PCR检测阳性率均高于其它二个组。实验结果证明 ,体外培养 4 8h并经遗传修饰的胚盘细胞仍然具有形成嵌合体的能力 ,利用早期胚盘细胞途径制备转基因鸡是可行的。     

DON抑制小麦种胚细胞周期启动的研究

小麦种子在０．５－４．０ｍｇ／Ｌ的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ＤＯＮ）中溶液中萌发,用流式细胞仪检测胚细胞的周期时相并观察黄化苗的生长。结果表明,对照组胚细胞在萌发１２ｈ开始启动细胞周期,此后Ｓ期细胞比率迅速增加并在２０ｈ达到最大值,较萌发１０ｈ的６．５％增加１．７８倍,约１４％的胚细胞在萌发的２２－２６ｈ间完成第一次分裂;ＤＯＮ抑制Ｇ１期胚细胞的启动,小麦胚中Ｓ期细胞比率随ＤＯＮ浓度增加呈指数下降,３．