松树蜂与其共生真菌的互利共生关系

松树蜂Sirex noctilio Fabricius是一种重要的国际林业检疫性害虫,主要危害针叶树,原产欧亚大陆和北非。近100多年来,先后入侵大洋洲(新西兰和澳大利亚)、南美洲(乌拉圭、阿根廷、巴西和智利)、北美洲(加拿大和美国),以及南非。2013年8月,在中国黑龙江省内首次发现松树蜂,目前发现其主要危害樟子松。松树蜂能与一种淀粉韧革菌属Amylostereum的真菌Amylostereum areolatum(Fr.)Boidin形成严格的互利共生关系,该虫除直接钻蛀树木外,还能通过产卵行为将自身毒素腺体分泌的毒素和体内共生真菌随同虫卵一起注入寄主树木体内,形成"虫-毒-菌"3个致害因子相互协作的特殊危害方式,加速树势的衰弱并造成寄主树木死亡。本文就国内外松树蜂与其共生菌互利共生关系的研究进行了综述,分别从结构与功能的层次上对其互利共生关系进行了梳理和总结,重点阐释了松树蜂与共生菌的营养共生关系,松树蜂携带传播共生菌的机制,共生菌的种群遗传学以及松树蜂毒素和共生菌在危害寄主树木时的协同关系等。以期为开展关于松树蜂的专项研究提供一些合理的建议,同时为积极有效地防控该害虫提供科学依据。     

桑树桑黄菌丝体和子实体基因差异表达分析

通过对桑树桑黄Sanghuangporus sanghuang菌丝体和子实体2个不同生长阶段的转录组进行分析,为研究桑黄子实体生长发育相关机制奠定基础。采用Illumina测序技术,对桑树桑黄菌株S23菌丝体和子实体2个不同生长发育阶段进行了全转录组测序。将转录组测序reads比对到参考序列上,菌丝体测序样本的reads比对率为82.89%;子实体测序样本的reads比对率为83%。基因差异表达分析显示,与菌丝体相比,子实体中显著上调表达基因为2 898个,显著下调表达基因为1 965个。经过Blast nr比对发现,桑黄菌在子实体阶段表达量上升的基因主要与各种氧化酶活性、疏水蛋白等相关;表达量下降的基因主要与糖类、氨基酸结合、运输等相关。基因本体（gene ontology,GO）富集分析表明,菌丝体及子实体两个阶段与跨膜转运相关的差异表达基因富集明显。代谢通路（pathway）富集分析表明,类固醇生物合成、精氨酸生物合成、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路等差异基因富集明显。     

果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 680个,其中上调表达基因有1 181个,下调表达基因有1 499个。Gene Ontology 功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。     

不同碳源条件下广叶绣球菌转录组分析

【背景】广叶绣球菌(Sparassis latifolia)是一种名贵的食用菌,其木质纤维素降解的分子机制尚不明确。【目的】了解广叶绣球菌在不同碳源条件下木质纤维素降解相关基因表达动态。【方法】通过转录组测序技术对分别以葡萄糖、纤维素+木质素、纤维素及松木屑为碳源的广叶绣球菌基因表达谱进行分析。以葡萄糖为碳源的样本为对照,分别对不同碳源下广叶绣球菌显著差异表达的基因进行功能分析。【结果】Geneontology(Go)富集分析表明,以葡萄糖为碳源的样本为对照,差异表达基因主要富集在碳水化合物利用的过程,如多糖催化过程、碳水化合物催化过程、碳水化合物代谢过程及多糖代谢过程等。碳水化合物活性酶(Carbohydrate-activeenzymes,CAZymes)功能注释表明,碳源种类主要影响了半纤维素和纤维素降解相关糖苷水解酶家族基因的表达,其中涉及半纤维素降解的相关酶基因上调幅度最大。同时,在纤维素+木质素、松木屑为碳源的处理组中一些转录因子基因上调表达显著。【结论】不同碳源显著影响了广叶绣球菌基因表达谱,这种对碳源的适应也可能反映了广叶绣球菌攻击植物细胞壁的机制,研究结果为深入了解广叶绣球菌木质纤维素降解的分子机理和相关功能基因提供了一些参考。     

巴氏蘑菇子实体不同发育阶段的转录组分析

为探讨巴氏蘑菇子实体不同发育阶段基因的表达情况,本研究对巴氏蘑菇子实体不同发育时期（原基、采收期和开伞期）进行转录组测序,以本实验室已获得的巴氏蘑菇JA菌株的不育单孢菌株JA-15036基因组为参考基因组研究原基与采收期及开伞期样本间差异表达基因,并对差异表达基因进行了GO功能和Pathway富集分析。GO功能分析结果显示,差异表达基因主要富集在跨膜转运、碳水化合物代谢途径和膜组分,它们协同调控为子实体生长发育提供稳定的内环境。KEGG富集分析结果表明,原基期上调的差异表达基因主要富集在核糖体蛋白和DNA复制,表明原基期细胞代谢旺盛,其中核糖体蛋白基因上调为后期蛋白质合成提供重要场所;采收期和开伞期子实体时期差异表达基因主要富集在碳水化合物代谢、脂肪酸降解和氨基酸代谢等途径,为巴氏蘑菇子实体的生长发育与成熟提供营养与能量。     

转录组和代谢组分析瘤菌根菌对铁皮石斛的促生机制

为筛选出促进铁皮石斛(Dendrobium officinale)生长的差异表达基因和差异代谢物,对瘤菌根菌与无菌盆栽铁皮石斛苗共生后形成的侧根根系进行转录组、代谢组和双组学联合分析。结果表明,转录组分析共找到262条差异表达基因富集到了35条通路中,其中内质网蛋白质加工通路途径的差异基因最多,其次为氨基糖和核苷酸糖代谢通路。代谢组分析共检测出194个差异代谢物富集到33个KEGG通路中,其中代谢途径的差异代谢物最多有133个,其次为不同环境的微生物代谢途径的差异代谢物有70个。通过联合分析,有9个差异基因的差异表达导致丝氨酸、谷氨酸、D-甘露糖和激素等代谢物的积累量发生变化,这可能是瘤菌根菌促进铁皮石斛生长的重要原因。因此,推测瘤菌根菌促进铁皮石斛生长与氨基酸、糖、植物激素的积累及相关基因的表达变化有关。     

尖孢镰刀菌古巴专化型MAPK FoSlt2敲除突变体的转录组分析

尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense（FOC）是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）FoSlt2信号通路在调控尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育、细胞壁完整性和致病性方面发挥着重要作用。为了揭示FoSlt2信号通路的致病机理和寻找农药靶标,本研究利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和FoSlt2敲除突变体菌株的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 164个,其中上调表达基因有1 184个,下调表达基因有980个。Gene Ontology（GO）功能分析结果表明,差异表达基因主要参与在结合、催化分子功能组和代谢过程、细胞过程生物学通路中。KEGG 功能富集分析结果表明,差异基因主要参与戊糖和葡糖醛酸盐转换、氨基糖和核苷酸糖、氨基葡聚糖降解、磷酸肌醇和碳类物质代谢通路,说明这些通路与尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育和致病性相关。该研究为尖孢镰刀菌古巴专化型致病机制的阐明奠定了理论基础。     

萱草叶片响应低温胁迫的转录组分析

低温胁迫是萱草（Hemerocallis fulva）生长过程中经常会遭遇的一种非生物胁迫。比较了萱草叶片在低温处理（10、5、0 ℃）下转录组与对照（15 ℃）数据的差异,共筛选出差异表达基因2 457个,其中上调基因1 253个,下调基因1 204个。差异表达基因主要富集在细胞过程、代谢过程和催化活性等49个GO过程,代谢途径、次生代谢产物的生物合成、植物激素信号转导等42条KEGG代谢途径中。其中参与植物激素信号转导通路的差异表达基因发生了不同程度的变化,GH3.10基因上调至对照组的13.624倍,IAA1基因下调0.120倍;参与可溶性糖合成通路的差异基因发生了0.076~28.114倍不同程度的变化。随后对3个低温处理组共有的29个差异表达基因进行热图和网络调控分析,基于基因在网络调控中的位置,对ABCF5、OFPs和SWEETs等基因在冷应答的作用进行了分析。本研究结果为进一步挖掘萱草低温响应的关键基因及耐寒萱草种质开发、分子育种提供了一定的理论支撑。     

BbRho5对球孢白僵菌生长速率的作用研究

为阐明BbRho5对球孢白僵菌生防潜能的作用,构建了Bbrho5单基因敲除菌株ΔBbrho5,以野生型菌株WT作为对照,在不同培养基上测定菌落生长速率,并测定了菌株对多菌灵胁迫耐受性及对大蜡螟幼虫体壁侵染能力。进一步获取和分析了ΔBbrho5和WT细胞内基因转录组数据。结果表明,BbRho5蛋白功能缺陷显著抑制球孢白僵菌菌丝生长速率,同时微弱影响其多菌灵胁迫抗逆性及生防能力。相较于WT,ΔBbrho5中具有770个差异表达基因(DEGs),其中上调基因395个,下调基因375个。GO分析显示,ΔBbrho5 VS WT中DEGs主要富集于氧化还原酶活力(oxidoreductase activity)和单加氧酶活力(monooxygenase activity)功能。KEGG通路富集结果显示,DEGs主要富集于氮代谢及多种氨基酸代谢通路。在氮代谢通路中富集到7个功能基因,其中有5个上调,2个下调,说明敲除菌株可能采用增强氮源利用及谷氨酸合成以应对Bbrho5缺陷引起的生长迟缓。以上研究结果揭示了球孢白僵菌中小GTP酶BbRho5对球孢白僵菌生长速率具有重要影响,且氮代谢和氨基酸代谢可能为其重要的响应代谢通路。     

BbRho5对球孢白僵菌生长速率的作用研究

为阐明BbRho5对球孢白僵菌生防潜能的作用,构建了Bbrho5单基因敲除菌株ΔBbrho5,以野生型菌株WT作为对照,在不同培养基上测定菌落生长速率,并测定了菌株对多菌灵胁迫耐受性及对大蜡螟幼虫体壁侵染能力。进一步获取和分析了ΔBbrho5和WT细胞内基因转录组数据。结果表明,BbRho5蛋白功能缺陷显著抑制球孢白僵菌菌丝生长速率,同时微弱影响其多菌灵胁迫抗逆性及生防能力。相较于WT,ΔBbrho5中具有770个差异表达基因(DEGs),其中上调基因395个,下调基因375个。GO分析显示,ΔBbrho5 VS WT中DEGs主要富集于氧化还原酶活力(oxidoreductase activity)和单加氧酶活力(monooxygenase activity)功能。KEGG通路富集结果显示,DEGs主要富集于氮代谢及多种氨基酸代谢通路。在氮代谢通路中富集到7个功能基因,其中有5个上调,2个下调,说明敲除菌株可能采用增强氮源利用及谷氨酸合成以应对Bbrho5缺陷引起的生长迟缓。以上研究结果揭示了球孢白僵菌中小GTP酶BbRho5对球孢白僵菌生长速率具有重要影响,且氮代谢和氨基酸代谢可能为其重要的响应代谢通路。     

松树蜂的产卵行为

【目的】研究松树蜂Sirex noctilio的产卵行为,明确其产卵能力,为评估其繁殖潜力和危害能力提供基础数据。【方法】于黑龙江省大庆市杜尔伯特蒙古族自治县新店林场采集被松树蜂危害的寄主樟子松Pinus sylvestris var.mongolica木段上获得虫源。在室内条件下观察和分析松树蜂产卵的行为过程及规律。解剖松树蜂在樟子松木段上的产卵孔,并观察其结构特征。【结果】松树蜂羽化时即性成熟,能够马上进行交配和产卵。松树蜂雌成虫一次完整的产卵过程主要分为4个动作:树皮钻孔、木质部钻刺、产卵(注入有毒黏液和共生真菌Amylosereum areolatum)和产卵器拔出。产卵时间在360～540 s之间的产卵频数最多,占产卵总频数的41.40%;产卵过程中木质部钻刺用时最长,至少占整个产卵过程用时的90%。松树蜂雌成虫在一个产卵孔处会进行1～4次产卵,产卵时间和产卵次数呈显著正相关,当产卵时间t<360 s时,进行了1次产卵;当360 s≤t<540 s时,进行了2次产卵;当540 s≤t<780 s时,进行了3次产卵;当t≥780 s时,进行了4次或更多次产卵。松树蜂在一个产卵孔处进行1, 2, 3和4次产卵的比例分别为21.66%, 41.40%, 27.39%和9.55%。【结论】松树蜂雌成虫在一个产卵孔处的产卵时间和产卵次数呈正相关。利用产卵时间和产卵次数的关系,在只调查产卵时间的情况下,可以推断产卵次数。松树蜂在一个产卵孔处产卵的次数多,对寄主樟子松危害大。     

肺形侧耳低温胁迫时期的转录组分析

本文以肺形侧耳栽培菌株X57为研究对象,利用高通量RNA测序技术对4℃低温处理0h、6h和12h后的肺形侧耳进行基因表达分析来探讨肺形侧耳低温应答机制。分析结果筛选出低温处理6h差异表达基因742个,其中上调表达基因374个,下调表达基因368个;低温处理12h差异表达基因1 489个,其中上调表达基因占53%,下调表达基因占47%。Gene Ontology（GO）功能聚类分析表明,差异表达基因主要富集在结合、催化分子功能组和代谢过程、细胞过程生物学过程中。KEGG功能富集分析结果显示,差异基因主要富集在氨基酸、核糖体和类固醇生物合成,及氮类物质代谢的通路上,富集到与低温胁迫相关通路MAPK signaling pathway-yeast上的基因表达随低温处理时间的增加呈上调趋势。已报道HOG-MAPK通路是MAPK途径研究较为明确、信号传递单一的真菌低温胁迫中重要的通路,本文运用生物信息学软件构建肺形侧耳的HOG-MAPK通路,并利用荧光定量PCR对相关基因表达进行验证,结果显示以低温处理0h为参照,随着低温胁迫时间增加通路上大部分基因的表达量持续上升,且差异显著,与RNA‐Seq分析结果一致。本文通过全面分析肺形侧耳低温胁迫时期基因表达情况,为进一步研究肺形侧耳低温胁迫相关重要基因的功能鉴定与信号通路调控机理提供基础。     

北方蜜环菌菌索生长、发育对环境氧气及土壤湿度的响应

蜜环菌属Armillaria spp.真菌是重要的植物病原菌和兰科Orchidaceae植物天麻Gastrodia elata的专性共生菌,能以菌索形式在土壤中存活和传播,因此,土壤环境变化对蜜环菌菌索生长、发育的影响,是关系天麻栽培和森林蜜环菌病害的重要过程。为了揭示蜜环菌生长发育对土壤水分和氧气的适应特征,本研究以北方蜜环菌Armillaria borealis为研究材料,设计氧气浓度5%、15%、20%和30%的4个水平与土壤湿度20%、40%、60%和80%的双因素实验,在室内24 ℃及黑暗条件下培养,观察菌索发生时间(T)、测定菌索生物量(DW)、菌索长度(L)、菌索数(Nt)、菌索分枝数(Nf)和菌索直径(AD)。结果表明,土壤湿度和氧气浓度对北方蜜环菌菌索发育和生长具有显著影响,在15%的氧气浓度和60%的土壤湿度发育最快。本研究为人工模拟蜜环菌生长发育的环境提供了部分依据,对提高天麻人工栽培的产量,揭示森林蜜环菌病害发病机制具有重要价值。     

木屑处理迷宫栓孔菌Zn(II)-Cys(6)转录因子差异表达分析

Zn(II)-Cys(6)蛋白是一类仅存在于真菌中的锌指转录因子,其在迷宫栓孔菌(曾用名“偏肿革裥菌”) Trametes gibbosa中的相关研究较少。本研究对木屑处理后的迷宫栓孔菌进行转录组测序分析,以期挖掘到差异表达的Zn(II)-Cys(6)转录因子,为后续进一步对其功能的分析提供支持。首先,对在木屑处理下的T. gibbosa木质素降解酶进行了酶活检测,确认迷宫栓孔菌能有效降解木质素。之后,用木屑分别处理迷宫栓孔菌0、3、5、7和11 d,提取菌丝总RNA,利用高通量测序技术对这5个菌丝样本进行了转录组测序分析。通过COG、GO、Pfam和Swiss等数据库进行功能注释分析,鉴定出迷宫栓孔菌中全部的Zn(II)-Cys(6)家族转录因子基因,并进一步筛选出7个差异表达基因。进一步又对这7个差异基因的表达及蛋白结构进行了分析,绘制表达趋势热图,同时也对其理化性质,二、三级结构,疏水性等生物学特性进行了预测。通过构建系统发育树、预测Motif序列等初步分析了它们的进化关系及特性。最后,对这7个基因又利用RT-qPCR技术,进一步验证了转录组测序的结果。本研究从转录水平分析并鉴定出在木屑处理条件下迷宫栓孔菌中7个差异表达的Zn(II)-Cys(6)转录因子,研究结果将对后续研究迷宫栓孔菌中Zn(II)-Cys(6)转录因子的功能和表达调控机制有重要的参考价值。     

中国东北地区三种蜜环菌的生物学特性及奥氏蜜环菌人工培养

蜜环菌属Armillaria真菌具有较高的食药用价值。由于蜜环菌的生长发育过程较复杂,还未完全实现商业化栽培,野生资源的供应受到季节性和地域性的影响。本研究以采自东北地区蜜环菌属的3个菌株为研究对象,通过培养物的形态特征及分子标记确定菌株JG19016为奥氏蜜环菌A. ostoyae,菌株JG19017为高卢蜜环菌A. gallica,菌株JG19018为中国蜜环菌生物种C。奥氏蜜环菌JG19016最适生长温度为25 ℃,高卢蜜环菌JG19017的最适生长温度为22 ℃,中国蜜环菌生物种C JG19018则在22-25 ℃时菌丝生长速度最快;3个菌株最适pH为5-6。奥氏蜜环菌JG19016对葡萄糖和蔗糖利用率较好,高卢蜜环菌JG19017对葡萄糖利用率较好,中国蜜环菌生物种C JG19018对葡萄糖和淀粉利用率较好;蛋白胨对3个菌株促进作用最强,为最适氮源。培养基中加入VB₁,对3个菌株的菌丝生长均有明显的促进作用。奥氏蜜环菌JG19016菌丝生长的最优培养基配方为：葡萄糖20 g,蛋白胨3 g,磷酸二氢钾2 g,硫酸镁1.5 g,VB₁ 10 mg,琼脂20 g,水1 L。在木屑基质中培养,其配方的最优碳氮比为38:1,最佳木屑粗细比为3:1以上。出菇条件探索结果显示,菌丝及菌索长满菌袋(17 mm×33 mm×5 mm丝聚乙烯袋)需要50-60 d,之后在18 ℃、60%湿度和12 h散射光的环境中,10 d左右可观察到原基产生。增加菇房湿度到90%-95%,2-3 d可观察到1-3 cm的幼子实体,7 d左右菌柄和菌盖完全分化,10 d左右观察到菌盖展开。     

金针菇成熟期和伸长期菌盖的转录组与蛋白组比较分析

菌盖是大型真菌的重要组成部分,也是其产生有性孢子的部位,但是其发育机制仍不明确。本研究以金针菇Flammulina filiformis为材料,采用转录组和蛋白组联合分析的方法,比较分析了金针菇成熟期和伸长期菌盖的差异基因与蛋白,并对其进行GO (gene ontology)功能聚类分析、KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析和蛋白互作网络分析。本研究筛选到差异表达基因有1 391个,差异表达蛋白147个,均以上调表达为主。GO功能聚类分析结果表明,催化活性(catalytic activity)条目富集基因最多,其次是细胞组分(cell part)、细胞过程(cellular process)和细胞器(organelle)。KEGG富集分析结果表明,差异表达基因和蛋白主要富集在碳水化合物代谢通路(carbohydrate metabolism)和氨基酸代谢通路(amino acid metabolism)等。本研究选取了9个关键的差异表达基因,使用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)对其表达量进行了验证。RT-qPCR验证结果与转录组测序结果相一致。蛋白互作网络分析表明,水解酶类、结构域类和转录调节类蛋白为互作网络的主要结点。本研究联合转录组、蛋白组测序数据,通过分析差异基因与蛋白,为深入了解金针菇菌盖发育机制提供数据参考。     

基于转录组分析香菇不同漆酶活性单核菌丝体基因表达

漆酶是香菇生长发育过程中一种重要的木质素降解酶,其活性高低对于香菇木质素降解能力和香菇品质形成具有重要作用。为探讨香菇不同漆酶活性的单核菌丝体基因表达变化,对漆酶活性存在差异的单核菌丝体进行转录组测序分析,共获得15 522个注释基因。GO（gene ontology）分析表明差异基因在氧化还原酶活性节点大量富集,包括参与木质素降解的酶类及55个细胞色素P450基因;KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析发现淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化途径中糖苷水解酶、UDPG脱氢酶等基因上调表达。通过搜索转录因子数据筛选到172个差异表达的转录因子,预测了可能与漆酶结合的bZIP、C₂H₂、C₄转录因子家族。由此推测,在漆酶高产单核菌株中木质素降解和碳水化合物代谢的相关基因的表达发生变化,及糖醛酸和磷酸戊糖途径相关基因上调表达,促进了木质素降解产物高效转化成糖、核酸等生物大分子,有助于香菇菌丝体的生长,转录因子在漆酶活性调控中起了重要作用。本研究为深入理解香菇漆酶高产菌株的生理代谢机制提供了重要的基因数据资源。