研究报告: 组织蛋白酶B介导NLRP3小体在砷致小胶质细胞炎症激活中的作用

目的 探究组织蛋白酶B（CTSB）介导NLRP3小体在砷致小胶质细胞（BV-2）炎症激活中的作用。方法 取处于对数生长期的BV-2细胞，分别暴露于终浓度为0、2、4、8 μmol/L亚砷酸钠（NaAsO₂）溶液培养24 h，检测细胞活性，测定各组细胞内CTSB和细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β的表达水平。流式细胞仪检测胞内溶酶体膜稳定性。基于实验结果，增设CTSB抑制剂组（5 μmol/L CA074-Me +8 μmol/L NaAsO₂、10 μmol/L CA074-Me+8 μmol/L NaAsO₂），检测两组细胞内炎症相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β、IL-18的表达水平。结果 与对照组比较，各染砷组细胞抑制率增高，呈现剂量效应关系，溶酶体膜稳定性下降，差异有统计学意义（P<0.01），胞内CTSB、NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1表达增高，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组（8 μmol/L NaAsO₂）比较，抑制剂组BV-2细胞胞内CTSB、NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1水平均降低，差异有统计学差异（P<0.01）。结论 NaAsO₂通过诱导小胶质细胞内CTSB水平的上升，介导NLRP3炎症小体激活小胶质细胞，促其释放炎性因子，致神经系统损伤。     

β-谷甾醇对创伤性脑损伤大鼠的保护作用及对铁死亡-脂质代谢途径的影响

摘要 目的：揭示β-谷甾醇（Sito）对创伤性脑损伤（TBI）大鼠的保护作用及对铁死亡-脂质代谢途径的影响。方法：将大鼠分为Sham组（n=10）、TBI组（n=11）、TBI+10Sito组（n=10）、TBI+20Sito组（n=10）、TBI+40Sito组（n=10）和TBI+40Sito+GPX4-IN-3组（n=10）。Sham组大鼠不进行造模,其他组大鼠为TBI模型大鼠。Sham组和TBI组大鼠每天灌胃1 mL0.5%羧甲基纤维素钠。TBI+10Sito组、TBI+20Sito组、TBI+40Sito组大鼠分别灌胃1 mL 10、20、40 mg/kg/d的β-谷甾醇。TBI+40Sito+GPX4-IN-3组大鼠同时灌胃0.5 mL 40 mg/kg/d的β-谷甾醇和0.5 mL 15 mg/kg/d的GPX4-IN-3（铁死亡选择性诱导剂）。各组大鼠均给药14 d。给药结束后,检测了各组大鼠的神经功能评分。通过Morris水迷宫实验评价认知功能。通过蔗糖偏好实验和旷场实验评价行为学。检测血清脂质代谢指标[总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）]水平、脑组织含水量、脑组织氧化应激指标[超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）]水平、脑组织Fe²⁺含量。通过苏木素伊红（HE）染色和尼氏染色评价脑组织损伤。通过Western blot和免疫荧光染色检测谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）蛋白表达。结果：与Sham组比较,TBI组大鼠的神经功能评分和逃避潜伏期升高,穿越平台次数、蔗糖偏好率、水平活动分数和垂直活动分数降低,TC、TG和LDL-c升高,HDL-c降低,脑组织含水量升高,神经元出现明显损伤,SOD水平降低,MDA水平升高,Fe²⁺含量升高,GPX4蛋白表达水平和GPX4相对荧光强度降低（P<0.05）。与TBI组比较,TBI+10Sito组、TBI+20Sito组和TBI+40Sito组大鼠的神经功能评分和逃避潜伏期降低,穿越平台次数、蔗糖偏好率、水平活动分数和垂直活动分数升高,TC、TG和LDL-c降低,HDL-c升高,脑组织含水量降低,神经元损伤明显减轻,SOD水平升高,MDA水平降低,Fe²⁺含量降低,GPX4蛋白表达水平和GPX4相对荧光强度升高（P<0.05）。与TBI+40Sito组比较,TBI+40Sito+GPX4-IN-3组大鼠的神经功能评分和逃避潜伏期升高,穿越平台次数、蔗糖偏好率、水平活动分数和垂直活动分数降低,TC、TG和LDL-c升高,HDL-c降低,脑组织含水量升高,神经元损伤加重,SOD水平降低,MDA水平升高,Fe²⁺含量升高,GPX4蛋白表达水平和GPX4相对荧光强度降低（P<0.05）。结论：β-谷甾醇可有效减轻TBI后的继发性损伤,其机制可能与抑制铁死亡途径介导的氧化应激和脂质代谢紊乱有关。     

CUL1基因对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活和NLRP3炎症体通路的影响

摘要 目的：探究Cullin1（CUL1）基因对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导的SH-SY5Y细胞存活和核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎症体通路的影响。方法：（1）将SH-SY5Y细胞分为NC组、NC-sh组、CUL1-sh组、NC-OE组和CUL1-OE组。使用Lipofectamine 2000试剂对细胞转染相应的慢病毒。（2）将SH-SY5Y细胞分为Control组、MPP+组和MPP++CUL1-OE组。MPP+组和MPP++CUL1-OE组细胞使用1 mmol/L的MPP+处理48 h,Control组细胞正常培养。通过MTT法检测细胞增殖,通过Annexin V-FITC/PI双染色法和TUNEL染色法检测细胞凋亡,通过qRT-PCR检测CUL1的mRNA水平,通过Western blot检测CUL1、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、cleaved caspase-1、白细胞介素（IL）-1β和IL-18蛋白水平。通过ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平。结果：（1）与NC组和NC-sh组比较,CUL1-sh组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量降低,相对细胞活力降低,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率升高,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平升高（P<0.05）。与NC组和NC-OE组比较,CUL1-OE组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量升高,相对细胞活力升高,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率降低,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平降低（P<0.05）。（2）与Control组比较,MPP+组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量降低,相对细胞活力降低,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率升高,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平升高（P<0.05）。与MPP+组比较,MPP++CUL1-OE组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量升高,相对细胞活力升高,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率降低,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平降低（P<0.05）。结论：CUL1可能通过抑制NLRP3炎症体激活促进MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活。     

血清IL-18、IL-1β及NLRP3炎症小体在射血分数保留型心衰患者中的表达及其与肠道菌群的相关性分析

摘要 目的：血清IL-18、IL-1β及NLRP3炎症小体在射血分数保留型心衰患者中的表达及其与肠道菌群的相关性分析。方法：选择2020年5月到2022年1月于我院住院治疗的50例射血分数保留型心衰患者作为实验组，选取同期健康体检者50例作为对照组，收集两组人口学资料、一般查体资料及心脏彩超等结果。检测血清IL-18、IL-1β、NLRP3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）表达水平。采用每克粪便湿质量中菌落形成单位对数值（1gCFU/g），给予活菌计数，肠道定植抗力指标则用双歧杆菌与肠杆菌数量的比值(B/E值)表示。结果：（1）实验组IL-18、IL-1β表达水平较对照组明显升高（P<0.05）；（2）实验组NLRP3、Caspase-1表达水平较对照组明显升高（P<0.05）；（3）实验组的双歧杆菌、乳杆菌数目和B/E值较对照组低，肠球菌、肠杆菌数目较对照组高（P<0.05）；（4）两组的Chao1指数无差异；病例组Shannon指数较对照组低，Simpson指数较对照组高（P<0.05）；（5）Pearson分析显示，射血分数保留型心衰患者B/E值与IL-18、IL-1β及NLRP3炎症小体表达正相关。结论：射血分数保留型心衰患者存在血清IL-18、IL-1β及NLRP3炎症小体表达明显升高及肠道菌群失调，且IL-18、IL-1β及NLRP3炎症小体与肠道菌群有显著相关性。     

右旋氯胺酮对大鼠脊髓损伤后BDNF和炎症反应的影响

摘要 目的：探讨脊髓损伤后,使用右旋氯胺酮对BDNF和炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-13表达的影响。方法：将60只成年雄性大鼠随机分入5组,损伤组（A组）5 mg/kg右旋氯胺酮组（B组）、10 mg/kg右旋氯胺酮组（C组）和20 mg/kg右旋氯胺酮组（D组）,假手术组（S组）,每组12只。除S组外,其余4组使用脊髓打击法制备脊髓损伤模型,于脊髓损伤后4 h按照相应的给药剂量以5 mL/h的速度泵注右旋氯胺酮,S组仅进行手术操作,不损伤脊髓,手术后4h以相同的方法泵注等量的0.9 %氯化钠溶液。脊髓损伤后7、14、21和28天使用BBB法进行神经功能缺陷评分。采用HE染色法观察脊髓损伤后存活的神经元数量,ELISA法测定BDNF、Trk B、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-13、的表达水平。结果：与S组比较,其余四组BBB评分升高,存活神经元数量减少,BDNF、TrkB表达显著增加,促炎因子TNF-α、IL-1β表达上调,抑炎因子IL-10、IL-13表达均显著下调（P<0.05）;与A组比较,B组大鼠BBB评分、神经元数量、BDNF、TrkB、炎症因子的表达无明显差异（P>0.05）,C组、D组大鼠BBB评分升高,存活神经元数量减少,BDNF、TrkB表达增多,促炎因子TNF-α、IL-1β上调,抑炎因子IL-10、IL-13表达下调,且差异有统计学意义(P<0.05),C组与D组以上指标差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：脊髓损伤后4 h给予10或20 mg/kg右旋氯胺酮可以减轻SCI后神经元损伤,其机制与上调原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）的表达,增加BDNF含量,从而下调促炎因子IL-1β,TNF-α,上调抑炎因子 IL-10、IL-13有关,在本研究中右旋氯胺酮最佳作用剂量为10 mg/kg。     

雷公藤甲素对Con A诱导小鼠急性肝损伤的保护作用及机制

摘要 目的：探究雷公藤甲素（Triptolide）对刀豆蛋白A（Concanavalin, Con A）诱导的小鼠急性肝损伤的保护机制。方法：雄性BALB/c小鼠30只,随机等分为正常对照组、Con A模型组和雷公藤甲素治疗组。通过尾静脉注射Con A构建小鼠急性肝损伤模型。微孔板法检测血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平,HE染色观察肝组织病理变化,免疫组化、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肝组织及血清中细胞因子水平。结果：与正常对照组比较,Con A诱导急性肝损伤小鼠血清ALT、AST水平显著增高（P<0.05）,肝组织呈局灶性炎性浸润、坏死。与Con A模型组比较,雷公藤甲素治疗组小鼠血清ALT、AST水平显著下降（P<0.05）;肝组织病理程度明显减轻;肝组织中CD4⁺T细胞的浸润降低,促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2）的水平显著降低（P<0.05）。结论：雷公藤甲素可以通过抑制CD4⁺T细胞向肝脏募集,下调IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2的表达,有效防治Con A诱导的急性免疫性肝损伤。     

细胞焦亡在创伤性脑损伤中的作用

创伤性脑损(traumatic brain injury, TBI)是全球脑损伤患者死亡和致残的主要原因。创伤导致的不受控的内源性介质释放作为危险信号被危险相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)感知,触发炎性体(inflammasome)蛋白复合物组装。炎性体是TBI后的关键细胞内多蛋白信号感知平台,炎性体组装可以诱导含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)活化促使白细胞介素(interleukin, IL)-1β和IL-18的成熟和释放,启动细胞焦亡。近年来越来越多的证据表明,炎症小体主要是NLRP3、NLRP1和AIM2介导的细胞焦亡,参与TBI后组织损伤和功能障碍。本文简要总结目前关于细胞焦亡在TBI中作用的研究进展。     

人参皂苷Rg3通过调节自噬减轻脓毒症心肌损伤

摘要 目的：探讨人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3,Rg3）对脓毒症介导的心肌损伤的作用效果及机制。方法：本研究通过对小鼠进行盲肠结扎穿孔手术的方法构建脓毒症模型。32只BALB/c小鼠随机分为假手术组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）、人参皂苷Rg3治疗组（Rg3+CLP组）以及自噬抑制剂干预组（3-MA+Rg3+CLP组）,每组8只。术后18 h分别留取各组小鼠血浆及心肌组织。通过ELISA方法检测白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达水平。通过HE染色观察心肌组织形态结构的变化。应用Western-blot方法检测自噬及NLRP3炎性小体相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达。结果：与Sham组相比,CLP组小鼠心肌组织结构紊乱,炎性细胞浸润明显。另外,Caspase-3活性增加,NLRP3炎性小体相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）表达升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。与CLP组相比,外源应用Rg3组小鼠心肌组织炎性细胞浸润减少,并且Caspase-3活性降低,NLRP3炎性小体相关蛋白表达下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,而部分自噬相关蛋白表达升高。应用自噬抑制剂后,较单纯应用Rg3组,心肌组织损伤明显,而NLRP3炎性小体活性增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：脓毒症时NLRP3炎性小体激活,释放大量的细胞因子,进而导致心肌损伤。而Rg3治疗后,可以调节心肌细胞自噬,抑制NLRP3炎性小体激活,进而减轻细胞因子对心肌细胞的损伤。本研究表明Rg3可能通过调节心肌自噬,抑制NLRP3炎性小体的激活,进而减轻脓毒症时心脏的损伤。     

白介素-35对哮喘患者外周血单个核细胞糖皮质激素抵抗的作用及机制研究

摘要 目的：探讨白介素（IL）-35对哮喘患者外周血单个核细胞糖皮质激素抵抗的作用及机制。方法：选择2017年8月至2018年11月于徐州医科大学附属医院和滨海县人民医院确诊的哮喘患者54例,其中20例为激素抵抗型患者（SR组）,34例为激素敏感型患者（SS组）。采用Luminex200液相芯片法检测哮喘患者外周血IL-35的水平;体外分离培养两组患者外周血单个核细胞：通过检测细胞培养上清IL-6的水平确定地塞米松（DEX）对单个核细胞的半抑制浓度及最大抑制率;流式细胞术检测单个核细胞内磷酸化-P38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）平均荧光强度及表达p-p38 MAPK单个核细胞率。结果：SR组患者外周血IL-35水平显著低于SS组（P<0.05）;与SS组比较,SR组DEX半抑制浓度显著升高而最大抑制率显著降低,且单个核细胞内p-p38 MAPK平均荧光强度显著升高（P<0.05）;哮喘患者外周血清IL-35水平与DEX半抑制浓度和外周血单个核细胞内p-p38 MAPK荧光强度呈负相关(r=-0.351, r=-0.352,P<0.001),与最大抑制率呈正相关(r=0.450, P<0.001);SS组：与IL-35+脂多糖（LPS）组比较,IL-35+DEX+LPS组表达p-p38 MAPK 单个核细胞率显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）;SR组：IL-35+DEX+LPS组表达p-p38 MAPK 单个核细胞率无显著变化,差异无统计学意义（P>0.05）。结论：IL-35能够减轻哮喘患者糖皮质激素抵抗,其机制可能是通过抑制单个核细胞内p-p38 MAPK的表达。     

鸢尾素对心肌梗死后大鼠心房颤动和心房间质纤维化的影响

摘要 目的：探讨鸢尾素对心肌梗死后大鼠心房颤动和心房间质纤维化的影响。方法：通过结扎左前降支冠状动脉（LADCA）建立急性心肌梗死（MI）大鼠模型,大鼠每天腹腔注射100 μg/kg的鸢尾素1次,共治疗4周。通过超声心动图检查左室舒张末期直径（LVEDD）、左室收缩末期直径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）、左室缩短分数（LVFS）。应用苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色评估大鼠心肌形态和纤维化情况。蛋白质印迹分析检测TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、MMP9、TIMP-1、collagenⅠ、collagenⅢ、NLRP3、Caspase 1和IL-1β的表达。结果：与模型组相比,鸢尾素组大鼠的LVEF和LVFS升高,而LVEDD和LVESD降低（P<0.05）;房颤诱发率和房颤持续时间显著降低（P<0.05）;心肌形态明显改善,纤维化面积显著降低（P<0.05）;TGFβ1、p-Smad2/3、collagenⅠ、collagenⅢ和MMP9的蛋白表达水平显著降低,TIMP1的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;NLRP3炎性体、cleaved-caspase-1和IL-1β的表达水平显著降低（P<0.05）。结论：鸢尾素可显著改善心肌梗死动物模型的心脏功能,抑制心肌纤维化和房颤形成,具有较高的临床应用前景。