脑缺血再灌流大鼠海马hsp70及bcl—2基因的表达

为进一步了解中枢神经系统中选择性易损伤的分子机制,采用大鼠短暂前脑缺血再灌流损伤动物模型,应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、原位杂交及免疫组织化学方法,检测了ｈｓｐ７０及ｂｃｌ－２基因的表达及其组织学分布。发现易损伤的海马ＣＡ１区锥体细胞出现ｈｓｐ７０基因的诱导表达,ＢＣＬ－２蛋白合成受抑制;而耐受缺血的海马ＣＡ３区锥体细胞则明显地持续表达ＢＣＬ－２蛋白,却未见明显的ｈｓｐ７０基因表达。因此提示,ｈｓｐ７０基因的表达是神经元缺血的应激指征,也可能对神经元有保护作用;ＢＣＬ－２蛋白对神经元有保护作用     

大鼠海马CA1区锥体细胞的急性分离和鉴定

目的：建立一种适用膜片钳技术的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞的急性分离方法,并对其进行鉴定。方法：采用酶加机械分离法制备７～１０ｄ鼠龄的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞,用免疫荧光技术鉴定神经元,其电生理学特性测定用全细胞膜片钳技术。结果：分离的锥体细胞是海马ＣＡ１区锥体细胞,且具有正常的电生理学特性,并保存了某些主要的电压依赖性和受体依赖性离子通道特性。结论：成功地建立了一种简单、快速、高产的适用于膜片钳技术的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞的急性分离方法。     

p75NGFR在哺乳动物神经细胞中的表达及其在诱导细胞凋亡中的功能

将从人胎儿基底前脑提取的总ＲＮＡ用ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆在ｐＵＣ１２中的人神经生长因子低亲和力受体（ｐ７５ＮＧＦＲ）基因分两步克隆到逆转录病毒表达载体ｐＸＴ－１中,经ＰＡ３１７细胞体外包装后收集假病毒上清感染大鼠小脑神经细胞系Ｒ２,在ＲＮＡ转录和蛋白质合成水平获得了表达。转染了ｐ７５ＮＧＦＲ的Ｒ２细胞在去血清培养时可以诱导细胞凋亡的发生,此凋亡可被ＲＮＡ合成抑制剂放线菌素Ｄ和蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺抑制。表明ｐ７５ＮＧＦＲ诱导的细胞凋亡过程中有活跃的基因表达参与。     

高压氧对脑缺血再灌注海马神经元Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

目的：进一步探讨高压氧治疗脑缺血再灌注损伤,减轻神经元调亡朋而发挥保护作用的机理。方法：采用“双侧颈总动脉阻断法”前脑缺血模型,对沙土鼠前脑缺血２０ｍｉｎ后再灌注３ｄ,并用０．１５ＭＰａ和０．２５ＭＰａ压力的高压氧治疗（６０ｍｉｎ／ｄ,连续３ｄ）后,应用免疫组化ＬＳＡＢ方法,观察高压氧对海巴ＣＡ１,区神经元凋亡相关基因ｂｃｌ－２和ｂａｘ的蛋白表达的影响。结果：沙土鼠脑缺血再灌注３ｄ组海马ＣＡ１区大     

棉铃虫核型多角体病毒p35基因的PCR扩增和克隆及其在原核细胞中的表达

用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ Ａｃ Ｎ Ｐ Ｖ） 凋亡抑制基因ｐ３５ 的合成引物,从棉铃虫核型多角体病毒（ Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ） 基因组中用 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增到了１ｋｂ 片段。采用 Ｐ Ｃ Ｒ－ 双脱氧核苷酸链终止银染法,测定了所扩增到的１ ０１０ｂｐ 全序列,发现其开放阅读框完整,长８９７ｂｐ ,编码２９９ 个氨基酸。用 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ 和 Ｐ Ｒ Ｏ Ｓ Ｉ Ｓ 软件分析发现,此片段与 Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ ｐ３５ 基因同源区核苷酸同源性为９１ ％ ,氨基酸同源性也达８１ ％ ,证明了所扩增的片段是 Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ 的ｐ３５ 基因。为了研究此ｐ３５ 基因的功能及其效应机制,克隆了这一基因并在大肠杆菌细胞中实现了表达。     

大鼠隔区一氧化氮合酶阳性神经元的分布和脑缺血后的变化

大鼠隔区一氧化氮合酶阳性神经元的分布和脑缺血后的变化ＤＩＳＴＲＩＢＵＴＩＯＮＡＮＤＩＳＣＨＥＭＩＡＩＮＤＵＣＥＤＣＨＡＮＧＥＳＯＦＮＩＴＲＩＣＯＸＩＤＥＳＹＮＴＨＡＳＥＰＯＳＩＴＩＶＥＮＥＵＲＯＮＳＩＮＴＨＥＳＥＰＴＡＬＡＲＥＡＯＦＲＡＴ关键词大鼠...     

利用DDRT-PCR技术分析神经生长因子低亲和力受体诱导的细胞凋亡过程中基因表达的差异

转染了Ｐ７５ＮＧＦＲ的Ｒ２神经细胞系Ｒ２Ｌ１在去血清的培养时可以诱导细胞凋亡的发生．此凋亡可以被ＲＮＡ合成抑制剂放线菌素Ｄ和蛋白质合成抑制剂环己酰胺所抑制．利用ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术比较了去血清培养的发生凋亡的Ｒ２Ｌ１细胞与有血清培养的不发生凋亡的Ｒ２Ｌ１细胞以及去血清培养的不发生凋亡的Ｒ２Ｐ细胞基因表达的差异．克隆了数个特异或差异表达的短ｃＤＮＡ片段,经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实其中两个片段ＬＩＡＲＥＳＴ－１和ＬＩＡＲＥＳＴ－２表达量在凋亡细胞中显著高于不发生凋亡的细胞中,ＧｅｎＢａｎｋ检索表明此二片段为新的ｃＤＮＡ序列并给予登录号Ｕ４７３１５和Ｕ４７３１６．另有一个ｃＤＮＡ片段ＬＩＡＲＣＤ－３在凋亡细胞中受到了明显的抑制,经检索为一已知的与前强啡肽原上游调控区结合的ＤＮＡ结合蛋白ｃＤＮＡ编码区的一部分,首次被证实它与Ｐ７５ＮＧＦＲ诱导的神经细胞凋亡调控关联     

两类Ca~(2 )通道拮抗剂对脑缺血时Ca~(2 )/CaM PK Ⅱ活性抑制的保护作用

本文以蒙古沙土鼠双颈总动脉结扎（ＢＣＡＯ）前脑缺血模型Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性变化为指标,研究了以氯胺酮（ＫＴ）、右美沙芬（ＤＭ）、苄丙咯（ＢＰ）及硝苯吡啶（ＮＤ）为代表的配体门控Ｃａ２＋通道（ＬＧＣＣ）及电压门控Ｃａ２＋通道（ＶＧＣＣ）两类Ｃａ２＋通道拮抗剂对缺血性脑损伤的保护作用。结果如下：（１）脑缺血后,胞浆型及颗粒型Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性均明显下降;（２）缺血前单独用药,ＫＴ、ＤＭ、ＢＰ及ＮＤ对酶活性均具有剂量依赖性的保护作用;（３）与单独用药相比,联用异类药,ＫＴ＋ＢＰ、ＫＴ＋ＮＤ及ＤＭ＋ＢＰ的保护作用显著增高,而联用同类药,ＢＰ＋ＮＤ及ＫＴ＋ＤＭ的保护作用无明显增高。结果提示：脑缺血中,ＬＧＣＣ及ＶＧＣＣ两类Ｃａ２＋通道均参与了缺血性脑损伤过程;两类Ｃａ２＋通道的单一拮抗对缺血性脑损伤均有保护作用,而联合拮抗效果更佳。     

γ—氨基丁酸抑制缺氧所致神经元钙超载

本文以体外分散培养的新生大鼠海马ＣＡ１区神经细胞为标本,分别采用激光扫描共聚集显微镜动态监测单个细胞［Ｃａ＾２＋］ｉ和膜片箝全细胞记录的电生理技术检测细胞的ＮＭＤＡ电流和电压依赖性Ｃａ＾２＋电流等方法,较为深入地研究了抑制性神经递质γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）及ＧＡＢＡ－Ａ受体激动剂蝇蕈醇对急性缺氧时海马ＣＡ１神经元［Ｃａ＾２＋］ｉ升高过程的影响方式及其作用机制。结果表明：对照组细胞缺氧后比缺氧前［Ｃ     

强啡肽对脊髓原生型与诱生型一氧化氮合成酶活性、分布和基因表达的影响及机制

蛛网膜下腔注射（ｉ．ｔ．）强啡肽Ａ１－１７（Ｄｙｎ）引起剂量依赖性后肢和尾部瘫痪及甩尾甩足抑制。脊髓背角（侧）ＮＭＤＡ受体和ＮＯＳ／ＮＯ功能活性下降可能与Ｄｙｎ镇痛作用有关,脊髓腹角（侧）ＮＭＤＡ受体－Ｃａ２＋－ＮＯＳ／ＮＯ通路过度激活及ｃ－ｆｏｓ高表达可能与Ｄｙｎ致脊髓损伤（ＳＣＩ）作用有关。在Ｄｙｎ致ＳＣＩ机制中,过量ＮＯ（细胞水平）具有神经毒性作用,脑源性ＮＯＳ主要在早期,诱生型ＮＯＳ主要在后期起作用,而内皮细胞源性ＮＯＳ和适量ＮＯ（血管水平）可能具有保护作用。在原代培养脊髓神经元中,高浓度Ｄｙｎ可通过ＮＭＤＡ受体和κ受体直接引起细胞内Ｃａ２＋超负荷,低浓度Ｄｙｎ只通过κ受体抑制高钾刺激性Ｃａ２＋内流     

针刺抗脑缺血性神经元凋亡作用与机制的研究

本研究在肯定针刺抗缺血性神经元凋亡的基础上,进一步探讨针刺对内源性促凋亡因素及抑制凋亡因素的调整作用,寻找针刺对元保护作用的切入点及作用机制。结果表明：（１）针刺能减轻脑缺血导致的神经缺损行为异常,缩小梗塞面积;（２）ＰＩ荧光染色及ＴＵＮＥＬ染以显示：大鼠缺血皮层梗塞区有大量凋亡阳性信号细胞,电针后细胞凋亡受到明显抑制测定ＮＯ含量及观察ｃＮＯＳ和ｉＮＯＳ免疫活性显示：大鼠脑缺血－再灌注后脑内ＮＯ水     

GABA减缓缺氧引起的神经营养素mRNA表达量的变化

γ－氨基丁酸是中枢神经系统中的一种内源性抑制递质。近年已有实验证据揭示ＧＡＢＡ具有抵抗中枢神经元缺氧或缺血损伤的作用,但其机制尚不清楚。脑源性神经营养因子ＢＤＮＦ,神经生长因子ＮＧＦ和神经营养素－３是同一家族的成员,它们在海马脑区均有表达。为研究ＧＡＢＡ抗缺氧作用的机制,我们以培养的海马ＣＡ１神经元为材料,采用原位杂交的方法检测了缺氧后ＢＤＮＦｍＲＮＡ,ＮＧＦｍＲＮＡ和ＮＴ－３ｍＲＮＡ表达量的变化以及ＧＡＢＡ对这种变化的影响。结果显示,缺氧使ＮＧＦｍＲＮＡ和ＢＤＮＦｍＲＮＡ的表达量迅速上调且前者的变化极为剧烈,而ＮＴ－３ｍＲＮＡ的表达量显著下降;用２０μＭ的ＧＡＢＡ处理细胞后,上述缺氧引起的神经营养因子ｍＲＮＡ表达量的上升或下降幅度均被减缓,其中对ＮＧＦｍＲＮＡ表达量变化的影响最为显著。这些结果表明,ＧＡＢＡ具有稳定缺氧后ＢＤＮＦｍＲＮＡ,ＮＧＦｍＲＮＡ和ＮＴ－３ｍＲＮＡ表达水平的作用。推测这种作用与ＧＡＢＡ增加氯电导,维持钙稳态以及提高神经元的抗缺氧能力的效应有一定联系     

强啡肽对脊髓原生型与诱生型一氧化氮合成酶活性,分布和基因表达的影响

蛛网膜下腔注射强啡肽Ａ１－１７引起剂量依赖性后肢和尾部瘫痪及甩尾甩足抑制。脊髓背角（侧）ＮＭＤＡ受体和ＮＯＳ／ＮＯ功能活性下降可能与Ｄｙｎ镇痛作用有关,脊髓腹角（）ＮＭＤＡ受体－Ｃａ＾２＋－ＮＯＳ／ＮＯ通路过度激活及ｃ－ｆｏｓ高表达可能与Ｄｙｎ致脊髓损伤作用有关。     

T细胞在激活诱导凋亡中的信号途径

淋巴细胞ＡＩＣＤ是免疫系统维持稳定的一种重要机制。现在已知的可引发ＡＩＣＤ的途径包括ＣＤ３／ＴＣＲ途径、ＣＤ２途径、ＣＤ４７途径、ＣＤ３０途径。它们最终将信号传播至两条凋亡途径,引起细胞死亡。第一条是死亡受今是传导途径,其中主要包括Ｆａｓ／ＦａｓＬ途径、Ａｐｏ－ＴＲＡＩＬ等ＴＮＦ受体超家庭起始的途径。另外,Ｂｃｌ－２家庭构成的线粒体途径可能参与一定的调节作用。     

Alzheimer病与细胞凋亡

Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病（简称ＡＤ）是一种老年期痴呆综合征,其病因及发病机制尚不十分清楚。近年来的研究表明,细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）参与了ＡＤ神经元退行性病变。探讨细胞凋亡与ＡＤ的关系对深入了解ＡＤ的发病机制及研究其防治均有重要意义。１．细胞凋亡在...     

青心酮对妊娠高血压综合征胎盘血管内皮和平滑肌细胞内一氧化氮合酶的影响

本文对正常孕妇、妊娠高血压综合征（ＰＩＨ）患者和经青心酮（ＤＨＡＰ）治疗的ＰＩＨ患者等共２４例,应用组织化学分析方法观察胎盘血管内皮细胞（ＶＥＣ）和平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）内一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性的变化。结果表明：正常孕妇胎盘ＶＥＣ和ＶＳＭＣ内ＮＯＳ活性较高;ＰＩＨ胎盘ＶＥＣ和ＶＳＭＣ内ＮＯＳ活性明显减弱,并伴有组织和细胞的形态学损伤;经ＤＨＡＰ治疗后的ＰＩＨ胎盘ＶＥＣ和ＶＳＭＣ细胞ＮＯＳ活性较未经ＤＨＡＰ治疗者明显增加,其组织和细胞损伤也减轻。本研究结果提示胎盘内ＶＥＣ和ＶＳＭＣ细胞的ＮＯＳ减少可能与ＰＩＨ的发生和／或发展有关,青心酮治疗ＰＩＨ的作用可能与ＤＨＡＰ促进胎盘ＶＥＣ和ＶＳＭＣ内一氧化氮（ＮＯ）合成有关。     

多巴胺D1和D2受体激动剂和拮抗剂对脑缺血/再灌注损伤的影响

实验应用开阔法、组织病理学方法、原位末端标记(in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-metliated de-oxy-UTP mick end labeling,TUNEL)法及免疫组织化学等方法,探讨多巴胺D1、D2受体激动剂和拮抗剂对沙土鼠前脑缺血／再灌注损伤海马CA1区神经元凋亡及凋亡相关基因bcl-2、bax表达的影响。结果显示：前脑缺血5min可引起沙土鼠探索活动增加;再灌注3d,海马CA1区约95％的锥体细胞凋亡;再灌注7d,海马CA1区仅残存约2％—7％的存活锥体细胞;前脑缺血5min可抑制bcl-2的表达并诱导bax表达增高;预先应用D2受体激动剂培高利特可减轻缺血后沙土鼠行为学异常、抑制海马CA1区锥体细胞凋亡、提高锥体细胞存活数、显著诱导bcl-2的表达并抑制bax的表达。预先应用SKF38393、SCH23390及螺哌隆对以上结果无明显影响。实验结果提示,培高利特具有确切的脑保护作用,诱导bcl-2并抑制bax的表达可能是其脑保护作用机制之一。     

谷氨酸对大鼠海马CA1区神经元的短暂性外向K+电流的影响

为了在离子通道水平探讨谷氨酸对急性分离海马ＣＡ１区神经元的短暂外向Ｋ＋电流的影响。用７～１０ｄ大鼠,以链霉蛋白酶Ｅ酶解加吸管吹打法制备海马ＣＡ１区神经元;利用全细胞膜片箝技术,观察了谷氨酸对海马ＣＡ１区锥体细胞的短暂性Ｋ＋电流的影响。结果观察到谷氨酸对短暂性Ｋ＋电流有明显抑制作用,且呈明显浓度依赖性、时间依赖性和部分电压依赖性。上述结果表明,谷氨酸对Ｋ＋通道的影响在中枢神经系统中具有重要作用。     

肢体缺血预处理减少大鼠全脑缺血再灌注诱导的海马CA1区锥体神经元凋亡

探探讨肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning,LIP)对大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区锥体细胞凋亡的影响。46只大鼠椎动脉凝闭后分为假手术组、肢体缺血组、脑缺血组、LIP组。重复夹闭大鼠双侧股动脉3次(每次10min,间隔10min)作为LIP,之后立即夹闭双侧颈总动脉进行全脑缺血8min后再灌注。DNA凝胶电泳、TUNEL和吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双染技术从生化和形态学方面观察海马神经元凋亡的情况。凝胶电泳显示,脑缺血组出现了凋亡特征性DNA梯状条带,而LIP组无上述条带出现。与脑缺血组比较,LIP可明显减少海马CAI区TUNEL阳性神经元数(17.8±5.8vs 69.8±12,P<0.01)。AO/EB染色也显示LIP可明显减少脑缺血再灌注引起的神经元凋亡。以上结果提示,LIP可抑制脑缺血再灌注后海马神经元的凋亡,进而减轻脑缺血再灌注损伤,提供脑保护作用。     

NMDA受体介导脑缺血/再灌注诱导GluR6 巯基亚硝基化的研究

目的:研究脑缺血再灌注以及联合给予脑缺血和NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体抑制剂MK801对大鼠海马CA1区Glu R6巯基亚硝基化以及海马CA1区锥体细胞凋亡的影响。方法:采用四动脉结扎法构建大鼠全脑缺血再灌注模型,给予SD大鼠腹腔注射NMDA受体特异性抑制剂MK801(3 mg/kg)。主要运用'生物素转化法'(Biotin-Switch method)、SDS-PAGE、免疫印迹、焦油紫染色等方法对Glu R6的巯基亚硝基化(S-亚硝基化)、蛋白表达水平以及海马CA1区锥体细胞的凋亡水平进行研究。结果:脑缺血/再灌注显著促进Glu R6的巯基亚硝基化以及海马CA1区锥体细胞的凋亡,给予NMDA受体特异性抑制剂MK801能够显著抑制脑缺血/复灌诱导增加的Glu R6的S-亚硝基化以及海马CA1区锥体细胞的凋亡。结论:脑缺血/再灌注早期NMDA受体介导了Glu R6的巯基亚硝基化以及海马CA1区锥体细胞的凋亡,从而为临床治疗缺血再灌注脑损伤提供了理论依据。