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10 828条籼稻全长cDNA的分离和注释华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室国家植物基因研究中心谢卡斌、张建伟、向勇等与中国科学院国家基因研究中心冯旗、韩斌等九位专家教授,对此课题作了研究和注释。它们对全长cDNA基因组学和蛋白质组学研究有着非常重要的价值。以分离籼稻基因组全长cDNA为目标,从优良的籼稻恢复系明恢63中分离到10 828条非冗余的全长cDNA,其中780条是新的水稻表达序列,新得到的全长cDNA至少满足以下两个条件之一:(1)5'端序列包含粳稻日本晴的全长cDNA新预测的完整的OKF(9 078条);(2)包含同源蛋白质对应的完整N未端编码序列(6 543条)。在分离到的全长cDNA中,53%的序列比报道的粳稻全长cDNA有更长的5'端非翻译区(5'UTK);90.28%(9 776条)的序列能定位到粳稻基因组序列上,92.7%(10 046条)的序列可以定位到籼稻基因组序列上;     

10828条籼稻全长cDNA的分离和注释

全长cDNA对基因组学和蛋白质组学研究有着非常重要的价值. 以分离籼稻基因组全长cDNA为目标, 从优良的籼稻恢复系明恢63中分离到10828条非冗余的全长cDNA, 其中780条是新的水稻表达序列. 所得到的全长cDNA至少满足以下两个条件之一: (ⅰ) 5′端序列包含粳稻日本晴的全长cDNA所预测的完整的ORF (9078条); (ⅱ) 包含同源蛋白质对应的完整N末端编码序列(6543条). 在分离到的全长cDNA中, 53％的序列比报道的粳稻全长cDNA有更长的5′端非翻译区(5′UTR); 90.28％ (9776条)的序列能定位到粳稻基因组序列上, 92.78％ (10046条)的序列可以定位到籼稻基因组序列上; 8216条序列能与日本晴的全长cDNA序列定位到粳稻基因组序列的同一位置上, 籼粳间cDNA序列的平均相似性为99.2％; 90％以上的全长cDNA能进行GO (gene ontology)分类. 在780条新的cDNA中, 60％以上的找不到任何同源蛋白序列.     

cDNA捕捉法获得水稻杂种不育基因座位Sc区域的编码序列

摘要：cDNA捕获法足一种以表达为基础的基因分离技术,直接用目的区域的基因DNA捕捉该区域编码的cDNA,快速从大的基因组区域分离表达序列。本研究用一个水稻杂种不育基因座位Sc附近的大片段TAC基因组片段来捕捉该区域在水稻穗部表达的cDNA,共获得了6条不同的cDNA。将这些cDNA克隆进行测序分析,获得了该区域在水稻部表达的部分基因,其中1个是籼稻特有的基因。这些cDNA片段可成为新的标记用于目的基因的精细定位和候选基因序列分析。     

悦目金蛛丝腺SMART RACE cDNA文库的构建与鉴定

运用SMART 技术构建了悦目金蛛丝腺SMART RACE cDNA文库.经检测,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500 bp～2000 bp 之间;把双链cDNA通过T/A克隆、随机挑选阳性克隆并测序后,得到1条752 bp的全长cDNA序列.以该文库为模板,用依据这条全长cDNA序列设计的基因特异性引物与接头引物进行RACE, 3'RACE 和5'RACE的产物拼接后的全长序列与上述全长cDNA序列一致.结果表明,该文库适于用RACE方法从中分离在悦目金蛛丝腺中表达基因的全长cDNA.本文还对SMART 技术的特点和局限性进行了讨论.     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的分离与鉴定

利用抗病基因的保守结构设计引物,从抗叶锈病近等基因系材料TcLr24中扩增出一条703bp的条带RGAl,通过与GenBank比对,选取与RGAI高度同源的若干条带,在它们共有的保守序列位置设计引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE):ffL术扩增抗病同源基因cDNA全长.扩增到3条全长cDNA,经BLASTp比较,这些序列都舍有NBS保守结构域和多个LRR结构域.与很多已知植物抗病基因的功能相应区域一致.对FRGA-1,、FRGA-2和FRGA-3实时定量PCR分析,表明这3个基因在小麦叶片中都是组成型表达.本研究在小麦材料TcLr24中得到3条抗病基因同源cDNA全长,为研究小麦抗病基因奠定了基础.     

棉花nodulin—like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA　5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18　(Gossypium　arboreum　L.　Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长为2　353　bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1　480　bp,含有一个1　125　bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank　nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733　bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性。Nodulin-like基因的启动子全长1　969　bp,启动子区域具有Initiator、TATA　box、CAAT-like　box和富含AT序列等启动子特征序列。Southern　blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝。Northern　blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉“前期抗虫性强、后期抗虫性弱”这一生产实际问题提供有效的表达调控元件。     

棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

几种全长cDNA文库构建方法比较

全长cDNA文库是高效、大规模获得基因全序列信息的一条有效途径,尤其是对基因组庞大,近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说,是一条开展功能基因组研究的重要途径。本文对几种全长cDNA文库的构建方法进行了概述,针对各种方法的原理及优缺点做了分析、比较,并结合本实验室的结果,重点介绍了Cap-trapper法在小麦全长cDNA文库中的应用及文库中全长基因比例判定方法。     

中华绒螯蟹卵巢RACB cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列,运用SMART技术,成功构建了中华绒螯蟹卵巢(Ⅲ期)RACE cDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500—2000bP之间,RACE PCR结果表明,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物,说明所构文库的质量较好,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。     

基于PCR的cDNA基因克隆技术研究进展

RT-PCR、锚定PCR、cDNA末端快速扩增（RACE）、step out RACE、DDRT-PCR、cDNA代表性差异分析、抑制性削减杂交等都是建立在PCR基础之上的cDNA分子克隆技术。本介绍各种技术的优缺点、应用以及与同类技术进行比较,这些技术现在已经成功应用于大量EST的分离、cDNA库的构建、编码产物未知的差别表达基因的分离以及全长cDNA基因序列的克隆等方面。     

大乳头水螅RACE cDNA文库的构建

目的:为筛选和克隆大乳头水螅发育调控相关基因的全长cDNA,构建大乳头水螅RACE cDNA文库.方法:提取大乳头水螅总RNA后从其中分离mRNA,运用SMART技术构建RACE cDNA文库.为鉴定所构建文库的质量,根据GenBank中大乳头水螅actin基因cDNA序列设计5'RACE和3'RACE的引物及用于扩增actin基因编码区全长序列的引物.结果:琼脂糖凝胶电泳结果表明,RACE cDNA文库中全长cDNA的长度集中在500-2 000bp之间.5'RACE、3'RACE PCR及扩增actin基因编码区全长序列时均以本文构建的大乳头水螅RACE cDNA文库为模板,这3个PCR反应均能扩增出产物,产物大小与目标片段预计大小相似.PCR产物分别经T/A克隆及测序后证明为大乳头水螅actin基因cDNA的相应序列.结论:RACE cDNA文库的成功构建为通过RACE方法获得大乳头水螅功能基因cDNA全长序列奠定了基础.     

烟草中一条新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用差异显示技术从烟草中分离到一个受乙烯利诱导表达的cDNA片段,结合RACE扩增技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1350个碱基,编码区有1170 bp,通过GenBank同源性比较发现它与一条已知的烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS1,EC2．5．1．6)的基因编码区存在90％的同源性,编码的氨基酸顺序96％同源,而在cDNA的5’及3’非编码区同源性很低,且有一些短片段的缺失。设计合适的引物分别对这两个SAMS基因进行RT-PCR分析表明,SAMS1基因受高温诱导表达增强,但不受甲基紫晶诱导的氧化胁迫及盐胁迫影响,而新分离到的这个基因(SAMS2)的表达同时受高温、甲基紫晶及高盐3种胁迫的诱导。     

全长cDNA克隆的三种方法的比较研究

为了得到一段EST所在基因的全长,采用了快速扩增cDNA末端（RACE）、cDNA文库构建、λphage测序引物与特异性引物结合,非放射性探针进行噬菌体原位杂交等方法分别对该基因进行了克隆,结果得到了一致的全长cDNA,三种不同实验方法的应用,为更方便、有选择性地克隆全长cDNA基因奠定了基础。     

中华绒螯蟹卵巢RACE Cdna文库的构建

应用抑制性差减杂交技术 ,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列 ,运用SMART技术 ,成功构建了中华绒螯蟹卵巢 (Ⅲ期 )RACEcDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,文库所含全长cDNA的长度主要集中在 5 0 0～ 2 0 0 0bp之间 ,RACEPCR结果表明 ,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物 ,说明所构文库的质量较好 ,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。     

Gateway技术构建菊芋块茎全长cDNA文库及EST测序分析

为丰富菊芋功能基因组学研究基础平台,以成熟期菊芋块茎为材料,将菊芋全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了菊芋非剪切型全长cDNA文库。文库质量分析表明:未经扩增的原始文库库容量为5.76×10~6 CFU,插入片段大小主要为1～3000 bp,重组率为100%(24/24),达到了高质量文库的标准。利用该文库进行表达序列标签(expressed sequence tag, EST)测序,得到2639条高质量的EST序列,拼接后获得1895条非重复的唯一表达序列(unigene)。与NCBI的NR数据库同源比对分析表明,共有1533条unigene(80.9%)与已知基因有显著的同源性。GO分类结果显示:菊芋块茎表达基因在分子功能类群中,结合和催化活性所占比例最高。此cDNA文库将可用于菊芋功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及菊芋cDNA芯片的制备等。     

目的基因全长cDNA合成及克隆技术进展

在基因克隆、基因功能和表达调控研究中 ,获得目的基因尤其是表达丰度低的基因全长cDNA仍然是一个技术难题。本文对近年来有关反转录过程中影响全长cDNA合成的因素与对策的研究进行了总结 ,特别对消除mRNA二级结构阻碍的方法及其效果、较高反应温度和金属离子对模板mRNA完整性的影响、RNA分子伴侣在反应温度不变的情况下改善cDNA第一链质量的效果等作了较为详细的介绍。此外 ,还介绍了确保具有完整5′端的cDNA进入后续研究的几种新方法。     

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列,为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号:KF682139),ORF长540 bp,编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。