外加磁场作用下磁性Fe3O4纳米粒子对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子对肝癌细胞的体外作用,并研究外加稳恒磁场(SMF)或交变磁场(EMF)对Fe3O4纳米粒子作用的影响。方法:光镜下观察CBRH-7919细胞对Fe3O4纳米粒子的吞噬作用;MTT法检测Fe3O4纳米粒子对大鼠肝癌细胞株CBRH-7919的毒性及外加磁场的影响;流式细胞术检测外加磁场作用下Fe3O4纳米粒子对细胞凋亡及线粒体膜电位的影响。结果:光镜下可见CBRH-7919细胞吞噬大量Fe3O4纳米粒子入胞浆,且交变磁场作用下细胞的吞噬量增加。30～100μg/mL Fe3O4纳米粒子作用于CBRH-7919细胞未产生细胞毒性,稳恒磁场对其作用无影响,而交变磁场能增加Fe3O4纳米粒子的毒性,使细胞活性降低、凋亡率增加、线粒体膜电位降低。结论:交变磁场能增加CBRH-7919细胞对Fe3O4纳米粒子的吞噬并产生细胞毒性。     

外加磁场作用下磁性Fe3O4纳米粒子对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察磁性四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子对肝癌细胞的体外作用,并研究外加稳恒磁场（SMF）或交变磁场（EMF）对FeID4纳米粒子作用的影响。方法：光镜下观察CBRH-7919细胞对Fe3O4纳米粒子的吞噬作用;MTT法检测Fe304纳米粒子对大鼠肝癌细胞株CBRH-7919的毒性及外加磁场的影响;流式细胞术检测外加磁场作用下Fe3O4纳米粒子对细胞凋亡及线粒体膜电位的影响。结果：光镜下可见CBRH-7919细胞吞噬大量Fe3O4纳米粒子入胞浆,且交变磁场作用下细胞的吞噬量增加。30-100μg／mLFe3O4纳米粒子作用于CBRH-7919细胞未产生细胞毒性,稳恒磁场对其作用无影响,而交变磁场能增加Fe3O4纳米粒子的毒性,使细胞活性降低、凋亡率增加、线粒体膜电位降低。结论：交变磁场能增加CBRH-7919细胞对Fe3O4纳米粒子的吞噬并产生细胞毒性。     

姜黄素联合索拉菲尼对肝癌细胞系HepG-2细胞增殖及自噬的影响

目的:研究姜黄素联合索拉菲尼对肝癌细胞系HepG-2细胞增殖及自噬的影响。方法:体外培养肝癌细胞系HepG-2细胞,用不同浓度姜黄素(0、10、20、30、40、50 mmol/L)、不同浓度索拉菲尼(0、5、10、15、20μmol/L)及两药联合处理肝癌细胞系HepG-2细胞24 h后,用CCK8实验检测细胞存活率。用姜黄素30 mmol/L、索拉菲尼10μmol/L及两药联合处理肝癌细胞系HepG-2细胞24 h后,用荧光定量PCR检测自噬相关信号通路关键蛋白AKT、mTOR及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的mRNA表达情况。结果:姜黄素、索拉菲尼及两药联合对HepG-2细胞均有增殖抑制作用,且呈浓度依赖性。与姜黄素或索拉菲尼单药组相比,姜黄素联合索拉菲尼组能显著抑制肝癌细胞系HepG-2细胞的增殖(P0.001);能显著抑制AKT、mTOR的mRNA表达而增加自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的mRNA的表达(P0.001)。结论:姜黄素联合索拉菲尼组抑制肝癌细胞系HepG-2细胞增殖作用较单药组明显增强,两药联合协同诱导肝癌细胞系HepG2细胞产生自噬,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。     

新型磁性纳米脂质复合物对肝癌细胞和肝细胞的作用研究

目的:研究新型磁性纳米脂质复合物对肝癌细胞和肝细胞的作用。方法:将肝癌细胞(Hep-G2)和肝细胞(L-02)根据加入的不同浓度新型纳米脂质复合物,各自分为空白对照组、不同浓度含铁脂质体组、空脂质体组,用MTT法观察各组细胞毒性,筛选出适合的浓度和时间;用普鲁士蓝染色、电镜检测观察各组细胞吞噬情况;用原子分光光度计观察各组细胞内铁含量;用细胞磁共振观察新型纳米脂质复合物体外显影效果。结果:新型磁性纳米脂质复合物含铁浓度在0.238μg/ml以上时,24小时有较强的细胞毒性,对肝癌细胞和肝细胞的抑制率均超过40%,故以下实验选择含铁浓度在0.238μg/ml以下;肝癌细胞和肝细胞与各浓度新型磁性纳米脂质复合物共同培养,24小时普鲁士蓝染色最高阳性率分别为5.5%和1.25%,24小时细胞内铁含量最高值分别为0.675pg/cell和0.460pg/cell;24小时电镜观察肝癌细胞和肝细胞空白对照组均未见颗粒样物质,各含铁脂质体组和空脂质体组均可见颗粒样物质;24小时肝癌细胞和肝细胞磁共振感兴趣区均未见明显信号表达。结论:新型磁性纳米脂质复合物含铁浓度在0.238μg/ml以下时,24小时细胞毒性较小;肝癌细胞对新型磁性纳米脂质复合物的吞噬作用稍高于肝细胞对其的吞噬;进入细胞内的新型磁性纳米脂质复合物含铁量低,体外显影效果不佳。     

人脐血CD133细胞的分离及其体外扩增的研究

目的:探讨免疫磁性纳米粒子分离人脐血CD133细胞的方法,了解分离出的CD133细胞在体外短期培养中的变化及其在体外扩增的可能性。方法:通过化学沉淀法制备具有超顺磁性的r-Fe_2O_3纳米粒子,在其表面包裹具有生物亲合性的二氧化硅,并在其表面通过化学修饰使其成为生物功能化的磁性纳米粒子。再通过一定的化学连接方法将单克隆抗体CD133连接到生物功能化的磁性纳米粒子表面使其成为免疫磁性纳米粒子,然后利用自制的免疫磁性纳米粒子从单个核细胞中分离出CD133细胞,并分别对单个核细胞和CD133细胞在体外短期培养中的动态变化进行了初步观察和比较。结果:经免疫磁性纳米粒子分离的脐血中CD133细胞平均数为(5±1．4)×10~7/ml,占单个核细胞数的(3±0．3)%;单个核细胞(对照组)和CD133细胞(实验组)分别进行红、粒系集落扩增培养14天、21天,实验组中两种造血祖细胞集落扩增倍数都明显高于对照组(P＜0．01)。结论:使用自制的免疫磁性纳米粒子能较好的分离脐血中的CD133细胞,分离与纯化出来的CD133细胞不仅细胞活力不受影响,而且与单个核细胞相比具有更强的增殖能力。     

葡聚糖包被的纳米磁粒子制备及其在H-22细胞标记中的应用

利用化学共沉淀法制备近微米级葡聚糖T-40包被的超顺磁纳米氧化铁(SPIO)粒子。用X射线衍射(XRD)、透射电镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)、红外光谱等手段对其性质进行表征。XRD确定所制备的粒子主要为Fe3O4晶体,具有超顺磁性且饱和磁化强度为64.396emu/g;TEM显示无机核心粒径约为20nm;被葡聚糖包被后,AFM显示粒子呈扁平长方体形貌,三维尺寸为(200～300)nm×(400～600)nm×(50～70)nm。在超声作用下,该类粒子能够对小鼠H-22肝癌细胞进行标记,说明所制备的磁性纳米粒子具有作细胞磁性标记物的特性,同时超声也可促进H-22细胞快速装载磁性微粒。     

Canstatin基因转染对人肝癌HepG-2细胞体外血管生成拟态的影响

目的:探讨转染Canstatin基因对人肝癌HepG-2细胞体外形成血管生成拟态的影响。方法:将Canstatin基因通过脂质体法转染人肝癌HepG-2细胞,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS-PAGE电泳检测Canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达;建立HepG-2细胞人工基底膜基质凝胶体外三维细胞培养模型,观察HepG-2细胞能否形成血管生成拟态,并比较转基因和未转基因细胞的管道形成能力。结果:Canstatin在转染人HepG-2细胞中表达并分泌至上清液中,人肝癌HepG-2细胞在体外三维培养条件下能够形成血管生成拟态。Canstatin基因转染HepG-2细胞组的管状结构数量高于空载体组和HepG-2细胞组,转染细胞管道形成能力明显受抑制。结论:人肝癌HepG-2细胞株可形成血管生成拟态,Canstatin能抑制人肝癌细胞株HepG-2体外血管生成拟态形成。     

蜂胶黄酮Pinobanksin-3-acetate对人肝癌HepG-2和肝正常L02细胞增殖和凋亡的影响

为探讨蜂胶黄酮Pinobanksin-3-acetate(PB3A)对人肝癌Hep G-2和肝正常细胞L02增殖、形态学变化和细胞凋亡的影响,采用MTT显色法检测不同浓度PB3A作用不同时间对SGC-7901细胞生长所产生的影响,计算生长抑制率和IC50值;倒置显微镜观察PB3A干预后细胞的形态学变化;Annexin V-FITC/PI双染色、流式细胞仪检测细胞的凋亡率;结果显示,PB3A可显著抑制Hep G-2和L02细胞的增殖,并呈浓度和时间依赖性,各时间段Hep G-2细胞IC50值明显低于L02细胞。流式细胞检测结果显示,PB3A能促进Hep G-2和L02细胞凋亡,并呈剂量依赖性,同浓度PB3A诱导Hep G-2细胞的早期凋亡率明显高于L02细胞。上述结果表明,PB3A对人正常肝L02细胞和肝癌Hep G-2具有明显的区别增殖抑制和诱导凋亡作用,区别抑制作用的本质是PB3A诱导两种细胞凋亡的程度不同。     

基于L-半胱氨酸修饰的Fe3O4@TiO2复合纳米颗粒体外光动力疗法灭活HL60细胞的试验研究

本文采用共沉淀法制备了L-半胱氨酸(L-Cys)修饰的Fe3O4包裹TiO2(Fe3O4@TiO2/L-Cys)复合纳米粒子。通过透射电子显微镜(TEM),X射线衍射(XRD)和傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)对复合纳米粒子进行了表征,并讨论了复合纳米粒子对HL60细胞体外光动力疗法(PDT)灭活的影响。并对其PDT灭活机制进行了初步探索。试验表明,Fe3O4@TiO2/L-Cys复合纳米粒子分散性高,生物相容性好,对细胞的暗毒性更低,并可以有效增强靶向性,提高PDT灭活效率,在410nm波长的光激发下,光照剂量为18J/cm^2的情况下,当TiO2与Fe3O4的比例为1∶3时,整体PDT效率最高。PDT灭活效率可达69.36%。     

以叶酸偶联纳米Fe_3O_4颗粒的合成和标记肿瘤实验研究

目的:研究叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒对活体肝癌标记效果和MRI成像功能。方法:以铁盐、十二烷基苯磺酸和3-氨基丙基3-乙氧基硅烷为原料,通过共沉淀法合成了APTES修饰的超顺磁Fe3O4纳米颗粒,通过酰胺化法合成了叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒,以X射线衍射仪、透射电镜、红外光谱仪、振动样品磁强计、动态光散射仪对合成材料进行表征,采用SRB法对叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒细胞进行安全性检测,同时建立活体瘤鼠动物模型,对其在叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒标记前后进行MRI成像对比检测,每个肿瘤组织块各取2套切片,分别行苏木素-伊红染色和普鲁士蓝染色,观察肿瘤组织光镜下形态及组织内含Fe情况。结果:所制备的叶酸偶联的Fe3O4纳米颗粒为立方相的Fe3O4,粒径约8 nm左右,水合直径25.7nm,呈近似球形,表面分布有羧基等功能基团,呈超顺磁特性,饱和磁化强度为51 emu/g Fe。叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒对人皮肤成纤维细胞(HSF)的生长与生理盐水对照组的影响一样,无明显抑制细胞生长的表现。同时,磁共振成像和染色结果均显示肿瘤的存在。结论:叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒,不仅细胞毒性小,而且因其表面的叶酸与叶酸受体之间的高强结合力。同时,它能通过这种结合作用被高效介导进入肿瘤细胞内,增强MRI成像中肿瘤组织与周围正常组织的对比度,有利于肿瘤细胞的标记、示踪和靶向检测,是一种很有应用前景的肿瘤细胞靶向检测物质。     

骨形成蛋白7基因诱导人肝癌细胞的凋亡

目的 构建表达重组人骨形成蛋白7 （bone morphogenic protein 7, BMP7）基因的重组逆转录病毒,观察其对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导活性,并探讨其作用机制。方法 克隆BMP7基因,以loxP同源重组法构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP7（pLLBMP7）,转染包装细胞PT67进行病毒包装并测定病毒滴度;将逆转录病毒感染人成骨细胞,MTT法检测细胞生长变化,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;Western blotting检测BMP7,caspase-3和bcl-2蛋白表达。结果 重组逆转录病毒载体pLLBMP7经鉴定连接正确,转染PT67细胞后上清液中可得到病毒,滴度达1×109pfu;MTT检测见pLLBMP7病毒组48和72h细胞抑制率高于对照组（35.1% vs. 5.3%,68.5% vs.18.3%,均p<0.05）,48h可见BMP7蛋白高表达。琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,于转染48h后达最高峰,其凋亡百分率高达14.42%;BMP7蛋白高表达时caspase-3蛋白的表达亦有显著升高,但bcl-2蛋白未见表达差异。结论 构建了BMP7逆转录病毒,在体外能够有效地诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡,其可能是通过激活caspase-3而发生作用。     

甲壳胺诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的:通过体外实验探讨甲壳胺是否对人肝癌细胞HepG2具有生长抑制及诱导凋亡作用.方法:在HepG2细胞培养液中加入不同浓度的甲壳胺,培养48 h,于倒置相差显微镜下观察甲壳胺处理组及对照组细胞形态学变化;用流武细胞术(FCM)检测HepG2细胞的凋亡率,Western印迹检测甲壳胺处理组及对照组Bcl-2和p53蛋白...     

封闭EFNA2 基因表达对肝癌细胞HepG2 的转移和运动的抑制作用

目的:构建Ephrin-A2(EFNA2)基因的干扰RNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞HepG2转移能力的影响。方法:合成EFNA2基因的干扰RNA片段,用基因重组技术构建于腺病毒载体pAD-X,经293细胞包装得到高滴度重组腺病毒pAEFNA2/siRNA,并用real-time PCR进行EFNA2基因表达的验证。将重组腺病毒pAEFNA2/siRNA感染HepG2细胞,48h后用transwell小室法检测病毒对HepG2细胞侵袭和运动能力的影响。结果:经验证病毒正确构建,且HepG2细胞感染病毒pAEFNA2/siRNA后48小时的real-time PCR检测结果未见到有EFNA2基因的表达。病毒感染后transwell小室可见,HepG2细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制(分别为105±12 v.s.21±7cells/孔和194±22 v.s.39±11,P<0.01)。结论:成功构建了重组EFNA2siRNA腺病毒,并观察到封闭EFNA2对肝癌细胞HepG2的侵袭和运动均有抑制作用。     

中心体异常在咖啡因增强顺铂杀伤人肝癌细胞系中的作用

为了探讨咖啡因是否影响细胞周期检验点而增强顺铂杀伤肿瘤细胞及其作用机制 ,选取同步化于S期的肝癌细胞系SMMC 772 1,用顺铂和咖啡因进行不同方式的处理 ,包括顺铂处理、咖啡因处理以及先经顺铂 ,再用咖啡因处理 .利用相关方法对不同处理的细胞进行了分析 ,包括细胞形态 ,细胞生长速率 ,多核细胞的形成与死亡 ,中心体的异常等 .结果显示 ,顺铂与咖啡因联合处理的细胞出现明显的多核化现象 ,多核细胞占总细胞的百分比可以达到 30 %以上 ,高于用顺铂或用咖啡因处理的细胞 .同时观察到多核细胞生存能力较差 ,它们会通过细胞凋亡的形式死亡 .抗中心体人自身免疫血清的免疫荧光结果显示 ,中心体异常与多核细胞的形成直接相关 .在部分多核细胞的核周围有多个不同强度的荧光点 ,在另部分多核细胞中 ,在其中央有一个大的荧光点 ,被多个细胞核围绕 ,荧光较强 .根据结果推测 ,由多个不完整的中心体导致的多极分裂形成多核细胞 ,随后多个中心体聚集到中央形成大的中心体 ,负责间期微管的组装 .结果表明 ,受到顺铂损伤的细胞由于检验点的作用而使细胞周期阻断 ,咖啡因可消除周期的阻断 ,使细胞在中心体未完成正常复制状态下进入有丝分裂 ,产生大量多核细胞 ,这些多核细胞最终发生凋亡 .     

去整合素基质金属蛋白酶19抑制人正常胎盘来源滋养层细胞的侵润能力

去整合素基质金属蛋白酶19(ADAM-19)是新近发现的ADAMs家族成员,在胎盘组织中有较高水平的表达,但其在胎盘发生过程和滋养层细胞侵润中的功能还是未知的.我们以人正常胎盘来源的细胞滋养层细胞(NPC)为体外模型,利用基因转染、RT-PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学及细胞侵润分析等手段,证实ADAM-19在人胎盘组织中有特异表达,存在于多种滋养层细胞中;转化生长因子β1(TGF-β1)可以显著上调NPC细胞中ADAM-19的表达,呈现剂量依赖性;过表达hADAM-19可使NPC细胞中MMP-9的mRNA和蛋白质表达下调,并降低细胞的侵润能力.研究结果表明,人滋养层细胞中存在ADAM-19表达的旁分泌调节机制,而ADAM-19在调节滋养层细胞侵润中发挥一定作用.这一结果为阐明ADAM-19在胎盘发生中的功能提供了新的科学资料.     

木樨草素抑制肝癌SMMC7721细胞增殖的研究

目的：探讨木樨草素对肝癌细胞增殖的抑制效应及可能机制,为其临床应用提供理论依据。方法：以肝癌细胞系SMMC7721为模型,通过细胞增殖检测,乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、碱性磷酸酶（ALP）活性及其胞内总蛋白含量检测等手段,观察木樨草素对肝癌SMMC7721细胞的抑制作用。结果：经50μg／mL木樨草素处理72h后,肝癌SMMC7721细胞的生长抑制率达到54．68％;经400μg／mL木樨草素处理24h后,细胞LDH、SDH和ALP的活性与对照组相比分别降低56．12％、49．69％和76．31％;细胞胞内总蛋白含量无明显变化。结论：木樨草素能有效地抑制肝癌SMMC7721细胞的增殖,具有体外抗肿瘤活性,以及与诱导分化药物相似的抗肿瘤效果。     

高良姜素对人食管鳞癌KYSE-510细胞的抑制作用

探讨在体外高良姜素对人食管鳞癌KYSE-510细胞的抑制作用以及可能的作用机制.MTT结果表明,高良姜素对人食管鳞癌KYSE-510细胞具有很强的生长抑制作用.光学显微镜、激光共聚焦显微镜以及流式细胞仪的分析结果表明,高良姜素可诱导KYSE-510细胞分化.荧光定量RT-PCR和Western印迹分析结果表明,高良姜素诱导P21^waf1、抑制细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白D1的表达,推测上述基因可能是高良姜素实现细胞分化诱导作用的靶基因.     

表达人肝再生增强因子肝细胞系生物人工肝治疗安全性的动物实验初步研究

目的：评价表达人肝再生增强因子基因的HepG2细胞系的细胞培养上清及细胞裂解物的小鼠急性毒性和近期致瘤性。方法：SPF级昆明种小鼠18只,随机分为空白对照组、细胞培养上清组、细胞裂解物组,每组小鼠各6只,腹腔分别接种空白培养液、细胞培养上清、细胞裂解物0．5ml。连续14天,每天观察记录动物毒性反应,14d后宰杀小鼠,取血测血生化指标。及观察病理改变。结果：各组小鼠均存活。除对照组1例小鼠,细胞培养上清组1例小鼠,细胞裂解物组2例小鼠次日活动稍减少外,均未见异常反应。血液生化检测ALT、AST、AFP、TBIL无明显异常,且各组间无差别。普通光镜下各组动物肝脏病理切片染色均未见明显异常。结论：目的细胞系细胞培养上清、细胞裂解物对实验用昆明小鼠无明确毒副作用及短期致瘤性。可能提供一种安全的可用于生物人工肝新的细胞来源。     

人白细胞介素－2基因在人骨肉瘤细胞系内表达

从pHIG53质粒内切下人白细胞介素-2(IL-2)cDNA基因, 并经中间质粒pSP72转换成与pDOR-neo载体相匹配的酶切位点, 然后将IL-2cDNA定向连接入pDOR-neo载体, 构建成功人IL-2逆转录病毒载体, 经脂质体导入人骨肉瘤细胞系Ma中, 经G418筛选后测转基因肿瘤细胞培养上清中IL-2表达量, 每1×10⁵细胞24hIL-2表达量为50～800U, 为骨肉瘤的基因治疗创造条件.     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对胃癌细胞增殖及细胞周期的影响

探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）对体外培养的两株胃癌细胞（SGC-7901和BGC-823）增殖及细胞周期的影响。采用细胞培养、噻唑蓝（MTF）比色法、流式细胞定量检测（FCM）、蛋白质免疫印迹（Western印迹）以及免疫细胞化学染色（ICH）等方法,研究不同浓度DON处理72h对体外培养胃癌细胞的增殖、细胞周期及细胞周期相关蛋白—细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（CKIs）P21WAF/CIP1和细胞周期蛋白E（cyclin E）表达的影响。MTT法检测结果显示DON可明显抑制两株胃癌细胞的增殖,SGC．7901和BGC．823细胞100、500、1000ug／L DON处理组的增殖抑制率分别为4．28％、36．20％、45．35％和14．89％、32．30％、51．61％。FCM检测结果显示,给予1000ug／LDON处理72h可使两株细胞周期阻滞在GffM期。在100～1000u扎浓度范围内,两株细胞P21WAF／CIP1表达量均高于对照组,P21WAF／CIP1的表达与DON浓度呈显著正相关关系（SGC-7901细胞：r=0．886,P〈0．01;BGC-823细胞：r=0．943,P〈0．01）;两株细胞的细胞周期蛋白E表达量均低于对照组,与DON浓度有明显剂量依赖关系（SGC．7901细胞：r=-0．923,P〈0．01;BGC-823细胞：r=-0．854,P〈0．01）。Western印迹及免疫细胞化学检测进一步证实了DON处理对蛋白质表达的影响。综合结果表明,DON可抑制体外培养胃癌细胞的增殖活性,G2／M期阻滞、P21WAF/CIP1表达增高及细胞周期蛋白E表达下降可能是DON抑制胃癌细胞增殖的可能机制,DON对分化程度不同的胃癌细胞的影响没有明显差别。